Name: Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Öğrenin, indüklenmiş çok potansiyel kök hücrelerden antijen-özgü düzenleyici T hücreleri üretme yöntemini. Bu teknik, otoimmün artrit için immünoterapide tek tip ve hedefe özgü hücreler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje Sağlık (R01AI121180, R21AI109239 ve K18CA151798), American Diabetes Association National Institutes hibe altında, kısmen, finanse edildi (1-16-IBS-281) ve Sağlık Pennsylvania Bölümü (Tütün Yerleşim FONLAR) JS

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts of rheumatoid arthritis.</a> Nature. 423, 356-361 (2003).</li>
<li>Ferraro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interindividual+variation+in+human+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interindividual variation in human T regulatory cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E1111-E1120 (2014).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-expanded+antigen-specific+regulatory+T+cells+suppress+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes.</a> J Exp Med. 199, 1455-1465 (2004).</li>
<li>van Herwijnen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+that+recognize+a+ubiquitous+stress-inducible+self-antigen+are+long-lived+suppressors+of+autoimmune+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells that recognize a ubiquitous stress-inducible self-antigen are long-lived suppressors of autoimmune arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 14134-14139 (2012).</li>
<li>Wright, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+therapy+with+redirected+primary+regulatory+T+cells+results+in+antigen-specific+suppression+of+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adoptive therapy with redirected primary regulatory T cells results in antigen-specific suppression of arthritis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19078-19083 (2009).</li>
<li>Schmitt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+and+establishment+of+T+cell+competence+from+embryonic+stem+cells+differentiated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro.</a> Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).</li>
<li>La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+development+from+human+cord+blood+hematopoietic+stem+cells+by+Delta-like+1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro.</a> Blood. 105, 1431-1439 (2005).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Weiler, L., Vrana, K. E., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lineage+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells.</a> Cell Immunol. 260, 1-5 (2009).</li>
<li>Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+towards+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes.</a> J Vis Exp. , e3986(2012).</li>
<li>Lei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+programming+of+tumor+antigen-specific+T+lymphocytes+from+pluripotent+stem+cells+to+promote+cancer+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance.</a> Cancer Res. 71, 4742-4747 (2011).</li>
<li>Haque, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+regulatory+T+cells+from+pluripotent+stem+cells+and+prevention+of+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity.</a> J Immunol. 189, 1228-1236 (2012).</li>
<li>Chi, V., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%3A+paraffin+sections+using+the+Vectastain+ABC+kit+from+vector+labs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Lu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+all-trans+retinoic+acid+in+stabilizing+human+natural+regulatory+T+cells+under+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E3432-E3440 (2014).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-9-CD44+interaction+enhances+stability+and+function+of+adaptive+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Galectin-9-CD44 interaction enhances stability and function of adaptive regulatory T cells.</a> Immunity. 41, 270-282 (2014).</li>
<li>Di Stasi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+apoptosis+as+a+safety+switch+for+adoptive+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.</a> N Engl J Med. 365, 1673-1683 (2011).</li>
<li>Ramos, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+caspase+9+suicide+gene+to+improve+the+safety+of+mesenchymal+stromal+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An inducible caspase 9 suicide gene to improve the safety of mesenchymal stromal cell therapies.</a> Stem Cells. 28, 1107-1115 (2010).</li>
<li>Haque, R., Lei, F., Xiong, X., Wu, Y., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3+and+Bcl-xL+cooperatively+promote+regulatory+T+cell+persistence+and+prevention+of+arthritis+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">FoxP3 and Bcl-xL cooperatively promote regulatory T cell persistence and prevention of arthritis development.</a> Arthritis Res Ther. 12, R66(2010).</li>
<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat Med. 16, 475-482 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, kritik bir adımdır TCR / FoxP3 gen transduced iPSCs in vitro farklılaştırma olduğunu. In vitro Notch sinyal T hücre soyu doğru gelişimini uyarmaktadır. CD4 + FoxP3 + Tregs içine iPSCs ayırt etmek, biz OP9-DL1 / DL4 / IA b hücreleri, son derece hızlı MHC II (IA b) molekülleri kullanılır. IPSCs çoğu CD4 + hücreleri içinde farklılık gösterir. Ancak, yüzey TCR ifade sonrasında, pek çok farklı ön T hücreleri ayırt etmek ve en sonunda ölmek ...

Otoimmün artrit, sinovyal dokunun hiperplazisi ve eklem kıkırdağı, kemik ve ligamentlerin ilerleyici yıkımı ile karakterize sistemik bir hastalıktır1. Otoimmün artritte Treg'lerin kusurlu üretimi veya işlevi, kronik inflamasyona ve doku hasarına katkıda bulunur, çünkü Treg'ler oto-reaktif bağışıklık hücrelerinin gelişimini önlemede çok önemli bir rol oynar. 
Treg'lerin manipülasyonu, Ag'ye bağımlı bir şekilde iltihabı baskılamak için tedavilerin geliştirilmesi için ideal bir stratejidir. Treg bazlı immünoterapi için, transfer edilen Treg'lerin özgüllüğü, devam eden otoimmünitenin tedavisi için önemlidir2. Baskılayıcı aktiviteyi sergilemek için, Treg'lerin etkilenen bölgede göç etmesi ve tutulması gerekir, bu da okonumdaki Ag için TCR'nin özgüllüğü tarafından yönlendirilebilir 3. Poliklonal Treg'ler, TCR'lerinden bu Ag özgüllüğünü içeren küçük bir popülasyon içerebilse de, bu Ag'ye özgü Treg'lerin sayıları genellikle düşüktür. Sonuç olarak, otoimmün bozukluklara karşı poliklonal Treg'leri kullanan hücre bazlı tedaviler, çok sayıda Treg'in evlat edinici transferlerini gerektirir4,5. Pluripotent kök hücreler (PSC'ler) herhangi bir hücre tipine dönüşme yeteneğine sahip olduğundan, Ag'ye özgü PSC-Treg'ler Treg bazlı immünoterapi için iyi adaylar olabilir. Önceki çalışmalar, Tregs6-8 dahil olmak üzere PSC'den türetilmiş T hücrelerinin başarılı bir şekilde geliştiğini göstermiştir. 
Burada, Ag'ye özgü iPSC-Treg'leri geliştirmek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, bu tür Treg'leri kullanarak bir murin modelinde otoimmün artritin hücre bazlı bir tedavisini tarif ediyoruz. Bu yöntem, murin iPSC'lerinin Ag'ye özgü TCR'ler ve transkripsiyonel faktör FoxP3 ile genetik olarak değiştirilmesine dayanmaktadır. Tasarlanmış iPSC'ler daha sonra sitokinler mFlt3L ve mIL-7 varlığında Notch ligandları DL1, DL4 ve MHC-II (I-Ab) moleküllerini eksprese eden OP9 stromal hücreleri üzerinde Ag'ye özgü Treg'lere farklılaşır. Bu Ag-spesifik iPSC-Treg'ler, Ag ile uyarıldığında TGF-β ve IL-10 gibi baskılayıcı sitokinler üretebilir ve bu tür Treg'lerin evlat edinici transferi, bir fare modelinde AIA gelişimini baskılama yeteneğine sahiptir. Açıklanan protokol, potansiyel terapötik müdahaleler için kök hücreden türetilmiş Ag'ye özgü Treg'ler geliştirmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6j fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 (2C11) antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28 (37.51) antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5) antikoru</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 ( 53&ndash; 6.7) antikor</td><td>Biyoefsanesi</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD25 (3C7) antikoru</td><td>Biyoefsane</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&beta; (H57597) antikoru</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IL10 Biolegend</td><td></td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TGF ve beta;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Entegre bilim</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lizis tamponu</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Dikkat: Alerjenik, Kanserojen, Toksik</td></tr><tr><td>Geçirgenleştirme tamponu</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Ova albümin</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner tutucu</td><td>Braintree bilimsel</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

otoimmünite karşı kök hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici t hücrelerinin gelişimini

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Otoimmün hastalıklar nedeniyle immünolojik kendine karşı direncini kaybı ortaya çıkar. Düzenleme T hücreleri (Tregs) immünolojik kendine karşı direncini önemli aracılarıdır. Periferik kanda dolaşan Tregs% 2 - yaklaşık 1 ile farelerde ve insanlarda olgun CD4 + T hücre alt-popülasyonu% 10 - Tregs yaklaşık 5 temsil etmektedir. Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) potansiyel oto-bağışıklık hastalıkları, hücre bazlı terapiler için kullanılacak sahip fonksiyonel Tregs içine ayırt edilebilir. Burada, iPSCs gelen antijen (Ag) &#39;e özgü Tregs (yani, iPSC-Treg&#39;ler) geliştirmek için bir yöntem mevcut. yöntem iPSCs olarak transkripsiyon faktörü Foxp3 ve Ag-spesifik T hücresi reseptörü (TCR) içeren ve Çentik ifade OP9 stromal hücreleri üzerinde farklılaşan göre delta-benzeri (DL) 1 ve DL4 ligandları. In vitro farklılaştırma ardından, iPSC-Treg&#39;ler CD4, CD8, CD3, CD25, Foxp3 ve Ag-spesifik TCR ifade Ag uyarısına cevap verebilmektedir.Bu yöntem, başarılı bir murin modelinde otoimmün artrit, hücre bazlı tedavi uygulanmıştır. Ag-teşvikli artrit (AIA) tohumlu zeytin farelere bu Ag-spesifik iPSC-Tregs adoptif nakli eklem iltihabı azaltmak ve şişme ve kemik kaybını önlemek için yeteneğine sahiptir.

28. günde, burada gösterildiği gibi, Ag-spesifik Tregs esas CD3 ve Ag-spesifik TCR iki T hücre işaretçileri olarak ifade edilmiştir. CD3 + TCRVβ5 + popülasyonu CD4 ifade edilmiştir. Tipik olarak, doğal olarak T regs (nTregs üretme) meydana gelen ve ektopik Foxp3 T hücrelerinde yüksek seviyelerde ifade edilmiştir, aynı zamanda CD25, CD127, ve CTLA-4 olarak ifade CD3 + TCRVβ5 + CD4 + hücrelerinin, çoğu. Akış sitometrisi <str...

Burada, bir murin modelinde otoimmün artritin immünoterapisi için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) fonksiyonel antijene (Ag) özgü düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) geliştirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Bu deneyin genel amacı, otoimmün artrit için immünoterapi amacıyla, kök hücre kaynaklı enflame eklemle ilişkili düzenleyici T hücreleri üretmek için yeni bir yöntem geliştirmektir. Bu yöntem, otoimmünite alanında otoimmün artrit için potansiyel immünoterapötikler hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kök hücre kaynaklı düzenleyici T hücrelerinin nyped olması ve tek bir tipte olmasıdır.İlgili besleyici hücreleri OP9 ortamında santimetrekare başına minimum 1x10⁴ hücre yoğunluğuna seyrelterek başlayın ve her bir 10 cm'lik kaba 1x10⁶ besleyici hücre ekin. Hücreler %80 ila %90 konfluens düzeyine ulaştığında, kültürlerdeki ortamı uzaklaştırın ve her bir kaba OP9 ortamı içerisinde 0,5 ila 1x10⁵ adet retroviral olarak transduksiyona uğramış indüklenebilir pluripotent kök hücre veya iPSC ekin. Beş gün sonra ortamı aspire edin ve hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın.Ardından, hücreleri kap başına dört mililitre Trypsin ile 37 °C'de ayırın. 10 dakika sonra, reaksiyonları sekiz mililitre IPSC besiyeri ile durdurun ve hücreleri santrifüj için toplayın. Peleti 10 mililitre taze IPSC besiyerinde yeniden süspanse edin ve hücreleri yeni 10 cm'lik kaplara tekrar ekin.Besleyici hücrelerin hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca plağa tutunmasını sağlayın. Ardından, yüzen iPSC'leri toplayın ve sayım yapmak için transduksiyona uğramış hücreleri 70 mikronluk bir süzgeçten filtreleyin. Murine-Flt3-Ligand ile takviye edilmiş OP9 ortamındaki %80 ila %90 konfluens düzeyindeki taze bir besleyici hücre plağına 5 × 10⁵ iPSC ekleyin ve kültürleri inkübatöre geri yerleştirin.Üç gün sonra, kapları kültür ortamı ile yıkamak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından, kaba beş mililitre taze OP9 ortamı ekleyin ve feeder hücre tabakasına zarar vermeyecek şekilde dikkatli ve güçlü pipetleme yaparak yarı yapışkan iPSCs'leri nazikçe yıkayıp uzaklaştırın. Yarı yapışkan hücrelerin geri kalanını toplamak için yıkama işlemini 10 mililitre PBS ile tekrarlayın ve her kaptan gelen yıkama sıvılarını kültür başına bir konik tüpte toplayın.Hücreler çöktürüldükten sonra, pelletleri Murine-Flt3-Ligand ve IL-7 ile desteklenmiş 10 mililitre OP9 besiyerinde yeniden süspande edin ve hücreleri 70 mikronluk bir süzgeçten filtreleyin. Her bir kuyucuğa, %80 ila %90 konflüen besleyici hücre monokatmanları içeren altı kuyucuklu bir kültür plağına bir IPSC kültürü ekleyin ve ko-kültürleri inkübatöre geri yerleştirin. İki günde bir, besiyerinin yarısını Murine-Flt3-Ligand ve IL-7 ile desteklenmiş taze OP9 besiyeri ile değiştirin ve her dört ila altı günde bir, gerektiği şekilde farklılaşan IPSC'leri taze bir besleyici hücre tabakası içeren yeni plaklara yeniden ekleyin.İlgili hücre kültürlerini Trypsin ile ayırarak başlayın ve her bir hücre tipini 10 mililitre taze besiyeri içinde yeniden süspande edin. Her bir hücre kültürünü yeni bir 10 santimetrelik kaba ekin ve feeder hücrelerin hücre kültürü inkübatöründe yapışmasını bekleyin. 30 dakika sonra, yüzen iPSCs hücrelerini toplayın ve sayım için hücre kümelerini uzaklaştırmak amacıyla kültürleri ayrı 70 mikronluk hücre süzgeçlerinden geçirin.Her bir kültürü, gerekirse tekrar filtreleyerek, soğuk PBS içinde 1.5 × 10⁷ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Ardından, dört ila altı haftalık dişi C57BL/6 fareleri teker teker küçük hayvan sabitleyiciye yerleştirin ve her bir hayvanın kuyruk venine fare başına bir hücre tipinden 200 µL adaptif transfer yapın. Bazal ölçümü belirlemek için her iki dizdeki şişliği ölçmek amacıyla bir kumpas kullanın.Hücre transferinden 10 gün sonra, her denek hayvanın kuyruk tabanına, komple Freund adjuvanı ile emülsifiye edilmiş 100 mikrogram metillenmiş BSA'yı bir mililitrelik şırınga kullanarak enjekte edin. Hücre transferinden 17 gün sonra, anestezi uygulanmış her bir adoptif transfer hayvanının sol diz eklemine 10 mikrolitre PBS içinde 20 mikrogram metillenmiş BSA ve sağ diz eklemine 10 mikrolitre PBS içinde 20 mikrogram metillenmiş BSA ile 100 mikrogram tam Ovalbumin intra-artiküler enjeksiyon yoluyla verilerek artrit indükleyin. Artritin indüklenmesinden yedi gün sonra, diz çapındaki yüzde artışı hesaplamak için dizleri tekrar ölçün ve patellaları cerrahi olarak çıkarın.Eklemleri formalin içinde sabitleyin. Ardından, EDTA ile dekalsifikasyon yaptıktan sonra dizleri parafine gömün ve histokimyasal boyama ile analiz için dört mikronluk kesitler alın. 28. günde, antijene özgü T regülatör hücreleri, yüksek düzeylerde CD3 ve antijene özgü T hücresi reseptörleri eksprese eder.Bu hücrelerin çoğu, doğal olarak meydana gelen T düzenleyici hücrelerinde tipik olarak yüksek seviyelerde eksprese edilen CD25, CD127 ve CTLA-4'ü de eksprese eder. Nitekim, hücre içi boyama ile tespit edildiği üzere, Notch ligandı ile uzun süreli in vitro stimülasyondan sonra bile IPSC kaynaklı T düzenleyici hücrelerinde FoxP3 varlığını sürdürür. Ek olarak, bu antijene özgü IPSC T düzenleyici hücreleri, in vitro ortamda antijen yüklü splenositlerle stimüle edildiklerinde baskılayıcı sitokinler üretirler; bu durum, bu hücreler için potansiyel bir baskılayıcı fenotipe işaret etmektedir.OVA ile tedavi edilen dizlerde FoxP3 pozitif hücreler gözlemlenirken, kontrol vektörü ile transduce edilmiş IPSC'lerin verildiği dizlerde herhangi bir FoxP3 pozitif hücreye rastlanmamıştır. Ayrıca, TCR-FoxP3 vektörü ile transduce edilmiş IPSC'lerin verildiği farelerin dizlerinde, yalnızca FoxP3 vektörü verilenlere kıyasla çok daha fazla CD4 pozitif, FoxP3 pozitif, TCR3 Beta 5 pozitif hücre görüntülenmiştir; bu durum, antijene özgü IPSC-Treg hücrelerinin, alıcı hayvanlara adoptif transferlerinden sonra antijenle indüklenen artritli dize göç ettiklerini göstermektedir. IPSC türevli hücrelerin adoptif transferi, OVA mevcut olduğunda inflamatuar diz şişkinliğinde belirgin bir azalma sağlamış, ancak kontrol metillendi BSA enjekte edilen dizler üzerinde herhangi bir etki göstermemiştir.Şişliğin azalmasının olumlu etkileri, sadece MBSA enjekte edilen kontrol hayvanlarına kıyasla hücre transferi ile tedavi edilen dizlerde gözlemlenen kemik kaybı azalmasının yüksek çözünürlüklü Mikro-BT görüntülemesi ile daha da kanıtlanmıştır. Bir kez kavrandığında, bu derinlemesine prosedür uygun şekilde yürütüldüğü takdirde altı hafta içinde tamamlanabilir. Bu teknik uygulanırken, TCR-FoxP3 antijeni transduksiyonu yapılmış iPSC'lerin farklılaşmasının tetiklendiğinden emin olmak önemlidir.Bu prosedürü takiben, antijene özgü iPSC T reg hücrelerinin sağkalımı ve kalitesi hakkındaki ek soruları yanıtlamak için farklı baskılayıcı sitokin bileşikleri de değerlendirilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, hücre bazlı tedavi alanındaki araştırmacıların otoimmün hastalıklarda antijene özgü düzenleyici T hücrelerinin rolünü keşfetmelerine yol açmıştır. Doğrudan otobody bakterileriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve prosedür uygulanırken temel iki tesis gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneyinizde başarılar dileriz.

development-stem-cell-derived-antigen-specific-regulatory-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Düzenleyici T hücreleri: Nakli Reddetme ve Tip I Diyabet Tedavisinde Terapötik Potansiyeli

Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da...

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Bu video, farelerde otoimmün artrit için hücre bazlı bir tedaviyi göstermektedir. Ovalbümin spesifik reseptörlerini eksprese eden iPSC'den türetilmiş T düzenleyici hücrelere, bir adjuvan içinde emülsifiye edilmiş metillenmiş sığır serum albümini (mBSA) enjekte edilir. Murin antijen sunan hücreler (APC'ler) mBSA'yı işler ve T hücrelerine sunar, bu da T hücresi aktivasyonunu ve diz ekleminin sinovyal zarına göçü tetikler. Sonraki enjeksiyonlar sol dizde tek başına mBSA'yı ve sağ dizde mBSA ve...

Bir Murin Modelinde Otoimmün Artrit için Hücre Bazlı Bir Tedavi

Naif CD4 Coxsackie adenovirüs reseptör transgenik ekspresyonu ile T-hücreleri içine adenoviral gen transferi düzenleyici T hücre farklılaşmasının moleküler analiz...

Naif CD4 adenoviral İletimi Treg Farklılaşma Eğitim Hücreler T

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Bu makalede, in vitro ve in vivo kullanılmak üzere fonksiyonel T hücrelerinin yüksek sayıda verim amacı ile, antijene özgü CD8 T hücrelerinin üretimi ve bunların in vitro genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Bu makalede, OP9/DLL1 co-kültür sistemini kullanarak fonksiyonel tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre türetilmiş CD8αβ+ tek pozitif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.

Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositler Farelerde HBV Replikasyonlarını Baskılar

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Öğrenin, indüklenmiş çok potansiyel kök hücrelerden antijen-özgü düzenleyici T hücreleri üretme yöntemini. Bu teknik, otoimmün artrit için immünoterapide tek tip ve hedefe özgü hücreler sağlar.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Daha fazla video keşfet