Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Bu deneyin genel amacı, otoimmün artrite karşı immünoterapi için kök hücre kaynaklı iltihaplı eklemle ilişkili düzenleyici T hücreleri üretmek için yeni bir yöntem geliştirmektir. Bu yöntem, otoimmünite alanındaki otoimmün artrit için potansiyel immünoterötikler hakkındaki anahtar soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kök hücre kaynaklı regülatör T hücrelerinin tek tip ve nadir olmasıdır.

İlgilenilen besleyici hücreleri, OP9 ortamında santimetre kare başına dördüncü hücrelerin en az bir katı 10 yoğunluğa seyrelterek ve 10 santimetrelik çanak başına altıncı besleyici hücrelere bir kez 10 kez kaplayarak başlayın. Hücreler% 80 ila 90 birleştiğinde, ortamı kültürlerden çıkarın ve her tabakta OP9 ortamında 0.5 ila bir kez 10 ila beşinci, retroviral olarak dönüştürülmüş indüklenebilir pluripotent kök hücreleri veya IPSC'leri tohumlayın. Beş gün sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri 10 mililitre PBS ile yıkayın.

Ardından, hücreleri 37 santigrat derecede tabak başına dört mililitre Tripsin ile ayırın. 10 dakika sonra, sekiz mililitre IPSC ortamı ile reaksiyonları durdurun ve hücreleri santrifüjleme için çekin. Peleti 10 mililitre taze IPSC ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri yeni 10 santimetrelik tabaklara yeniden yerleştirin.

Besleyici hücrelerin, hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca plakaya yapışmasına izin verin. Ardından, yüzen IPSC'leri toplayın ve dönüştürülen hücreleri saymak için 70 mikronluk bir süzgeçten süzün. Murine-Flt3-Ligand ile desteklenmiş OP9 ortamında taze% 80 ila 90 birleşik besleyici hücre plakasına beş kez 10 ila beşinci IPSC'leri tohumlayın ve kültürleri inkübatöre geri koyun.

Üç gün sonra, bulaşığı kültür ortamıyla yıkamak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından, tabağa beş mililitre taze OP9 ortamı ekleyin ve besleyici hücre katmanını bozmayan dikkatli, güçlü pipetleme ile yarı yapışkan IPSC'leri nazikçe yıkayın. Yarı yapışık hücrelerin sonuncusunu hasat etmek için yıkamayı 10 mililitre PBS ile tekrarlayın ve yıkamaları her bir tabaktan kültür başına bir konik tüpe çekin.

Hücreleri döndürdükten sonra, peletleri Murine-Flt3-Ligand ve IL-7 ile desteklenmiş 10 mililitre OP9 ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri 70 mikronluk bir süzgeçten süzün. % 80 ila 90 birleşik besleyici hücre tek katmanları içeren altı oyuklu bir kültür plakasına oyuk başına bir IPSC kültürü tohumlayın ve ko-kültürleri inkübatöre geri koyun. Her iki günde bir, ortamın yarısını Murine-Flt3-Ligand ve IL-7 ile takviye edilmiş taze OP9 ortamı ile değiştirin ve her dört ila altı günde bir, farklılaşan IPSC'leri gerektiği gibi yeni bir besleyici hücre tabakası ile yeni plakalara yeniden tohumlayın.

İlgilenilen hücre kültürlerini Tripsin ile ayırarak ve her hücre tipini 10 mililitre taze ortamda yeniden süspanse ederek başlayın. Her hücre kültürünü 10 santimetrelik yeni bir tabakta kaplayın ve besleyici hücrelerin hücre kültürü inkübatörüne yapışmasına izin verin. 30 dakika sonra, yüzen IPSC'leri toplayın ve kültürleri, sayım için hücre kümelerini çıkarmak için ayrı ayrı 70 mikron hücre süzgeçlerinden geçirin.

Her bir kültürü, soğuk PBS'de mililitre konsantrasyonunda 1.5 kez 10 ila yedinci hücrede yeniden süspanse edin ve gerektiği gibi tekrar süzün. Daha sonra, dört ila altı haftalık dişi C57BL / 6 fareleri birer birer küçük bir hayvan tutucuya yerleştirin ve her bir hayvanın kuyruk damarına fare başına 200 mikrolitre bir hücre türünü evlat edinerek aktarın. Temel ölçümü oluşturmak için her iki dizin şişmesini ölçmek için bir kadranlı gösterge kumpası kullanın.

Hücre transferinden 10 gün sonra, farelere her deney hayvanının kuyruğunun tabanında tam Freund adjuvanında emülsifiye edilmiş 100 mikrogram metillenmiş BSA enjekte etmek için bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Hücre transferinden 17 gün sonra, sol diz eklemine 10 mikrolitre PBS içinde 20 mikrogram metillenmiş BSA ve 20 mikrogram metillenmiş BSA ve 100 mikrogram tam Ovalbümin eklem içi enjeksiyonu ile artriti indükleyin 10 mikrolitre PBS'de, anestezi uygulanmış evlat edinilmiş olarak transfer edilen her hayvanın sağ diz eklemine. Artriti indükledikten yedi gün sonra, diz çapındaki yüzde artışın hesaplanması için dizleri tekrar ölçün ve patellaları cerrahi olarak eksize edin.

Eklemleri formalin içinde sabitleyin. Daha sonra, EDTA'da dekalsifikasyondan sonra, dizleri parafine gömün ve histokimyasal boyama ve analiz için dört mikronluk kesit elde edin. 28. günde, antijene özgü T düzenleyici hücreler, önemli düzeyde CD3 ve antijene özgü T hücresi reseptörlerini eksprese eder.

Bu hücrelerin çoğu aynı zamanda CD25, CD127 ve CTLA-4'ü de eksprese eder, bunların tümü tipik olarak doğal olarak oluşan T düzenleyici hücrelerde yüksek seviyelerde eksprese edilir. Gerçekten de, FoxP3, hücre içi boyama ile tespit edildiği gibi, Notch ligandı ile uzun süreli in vitro stimülasyondan sonra bile, IPSC'den türetilmiş T düzenleyici hücrelerde devam eder. Ek olarak, bu antijene özgü IPSC T düzenleyici hücreler, in vitro antijen darbeli splenositlerle uyarıldığında baskılayıcı sitokinler üretir ve bu hücreler için potansiyel bir baskılayıcı fenotipi gösterir.

FoxP3 pozitif hücreler, OVA ile tedavi edilen dizlerde, kontrol vektörü transdüksiyonlu IPSC'leri alan dizlerde belirgin FoxP3 pozitif hücre olmadan gözlenir. Ayrıca, TCR-FoxP3 vektörü ile transdüksiyona uğrayan IPSC'leri alan farelerin dizlerinde, tek başına FoxP3 vektöründen çok daha fazla CD4 pozitif, FoxP3 pozitif, TCR3 Beta 5 pozitif hücre görselleştirilir, bu da antijene özgü IPSC-Treg hücrelerinin, alıcı hayvanlara evlat edinerek transferlerinden sonra antijenin neden olduğu artrit dizine göç ettiğini düşündürür. IPSC'den türetilmiş hücre evlat edinme transferi, OVA mevcut olduğunda inflamatuar diz şişmesinde önemli bir azalmayı da etkiler, ancak kontrol metillenmiş BSA enjekte edilen dizler üzerinde hiçbir etkisi yoktur.

Şişlik azalmasının olumlu etkileri, sadece MBSA enjekte edilen kontrol hayvanlarına kıyasla hücre transferi ile tedavi edilen dizlerde gözlenen azalmış kemik kaybının yüksek çözünürlüklü Mikro-BT görüntülemesi ile daha da ortaya çıkmaktadır. Bir kez toplandıktan sonra, bu derinlemesine prosedür, uygun şekilde gerçekleştirilirse altı hafta içinde tamamlanabilir. Bu tekniği denerken, TCR-FoxP3 antijen transdüksiyonlu IPSC'lerin aşılanmış farklılaşmasını indüklemeyi hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, antijene özgü IPSC'lerin T reg hücrelerinin sağkalımı ve kalitesi hakkında ek soruları yanıtlamak için farklı baskılayıcı sitokinler bileşikleri de tartışılabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, hücre bazlı tedavi alanındaki araştırmacıların, otoimmün hastalıkta antijene özgü düzenleyici T hücrelerinin rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı. Doğrudan oto gövdeli baktörlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bir prosedür gerçekleştirilirken her zaman temel iki tesiste çalışmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

İzlediğiniz için teşekkürler ve denemenizde iyi şanslar.