Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Bu prosedürün genel amacı, hedefe yönelik ilaç dağıtımı için ilaç yüklü disülfid çapraz bağlı misellerin sentezlenmesi için basit ve etkili bir protokol sağlamaktır. Bu yöntem, nano tıp alanındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Kararlı nano formülasyonların nasıl etkili bir şekilde üretileceği gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, disülfid çapraz bağlı miselleri büyük ölçekte kolayca sentezlememize izin vermesidir, bu da hastalarda klinik çalışmalar için son derece arzu edilir. Bu prosedüre başlamak için, yuvarlak tabanlı bir şişeye iki gram monometil sonlu polietilen glikol monoamin ekleyin. Çözmek için on mililitre susuz DMF ekleyin.

Buz üzerinde soğutun. Yuvarlak tabanlı bir şişeye üç eşdeğer hidroksi benzotriazol, üç eşdeğer DIC ve üç eşdeğer di-eth-moc korumalı lizin ekleyin. Ardından, on mililitre susuz DMF ekleyin.

Karışımı manyetik bir karıştırma plakası üzerinde 20 dakika karıştırın. Daha sonra karışımı, monometil sonlu polietilen glikol içeren yuvarlak tabanlı şişeye ekleyin. Yuvarlak tabanlı şişeyi buz banyosundan çıkarın, ardından gece boyunca oda sıcaklığında karıştırın.

Karıştırma tamamlandığında, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi reaksiyonun tamamlandığını onaylayın. Reaksiyon şişesine 200 mililitre buz gibi soğuk eter ekleyin. Dört santigrat derecede altı dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin Çökelmiş polimeri ayırmak için.

Çökeltme ve santrifüjleme işlemini iki kez tekrarlayın, ürünü çökeltmeden önce her seferinde 10 mililitre DMF'de yeniden çözün. Daha sonra polimeri üç kez buz gibi soğuk eterle yıkayın. Kalan eteri çıkarmak için tüpü yüksek bir vakum kaynağına bağlayın.

Bundan sonra, polimere DMF'de 20 mililitre% 20 4-Metilpiperidin ekleyin. Çözünme tamamlanana kadar karıştırın. Reaksiyonun üç saat boyunca eğlenceye dönüşmesine izin verin.

Reaksiyonun tamamlandığını onayladıktan sonra, polimerik ürünü kurutun. Şimdi bir vakum altında iki numaralı polimer ara maddesi, daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi ek polimer sentez adımlarını gerçekleştirin. 10 numaralı polimer ara maddesi üretildikten sonra, onu bir reaksiyon şişesine aktarın.

30 mililitre susuz DMF ekleyin. Yeni bir şişede, 20 mililitre DMF'de 24 eşdeğer aktif kolik asit çözülür. Daha sonra 48 eşdeğer N, N-Diizopropilaminlamin ekleyin.

10 dakika karıştırın. Karıştırma tamamlandıktan sonra, karışımı 10 numaralı polimer ara maddesi içeren reaksiyon şişesine aktarın. Reaksiyonun gece boyunca çalışmasına izin verin.

Ertesi gün, reaksiyonun tamamlandığını onaylayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi 11 numaralı polimer ara maddesini çökeltin. Daha sonra polimer ara maddesini deiyonize suda diyaliz edin. Beyaz bir toz elde eden numuneyi liyofilize edin.

Misel hazırlandıktan sonra, 20 miligram telodendrimer ve beş miligram PTX'i bir mililitre kloroformda çözün. Homojen bir kuru polimer film elde etmek için döner bir buharlaştırıcı kullanarak çözücüyü çıkarın. Filmi girdap yaparak bir mililitre PBS ile sulandırın.

Sonra 40 kilohertz'de 30 dakika boyunca sonikasyon. Telodendrimmer üzerindeki tiyol gruplarını oksitlemek için% 3 hidrojen peroksit ekleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi ek hazırlık ve doğrulama adımlarını gerçekleştirin.

Misel hazırlığı tamamlandıktan sonra, dinamik bir ışık saçılma aleti ile misellerin boyutunu ve boyut dağılımını ölçün. Ölçümleri oda sıcaklığında yapın ve misel konsantrasyonunu mililitre başına bir miligramda tutun. Daha sonra, PBS'de mililitre başına 7.5 miligram sodyum dodesil sülfat stok çözeltisi hazırlayın.

Daha sonra, PBS'de mililitre başına 1.5 miligramlık bir disülfür çapraz bağlı micell stok çözeltisi hazırlayın. Bu stok çözeltilerini kullanarak, nihai SDS konsantrasyonunun mililitre başına 2,5 miligram olduğu bir karışım oluşturun. Ve misel konsantrasyonu mililitre başına 1.0 miligramdır.

Numuneyi yükleyin ve misel çözeltisinin boyutunu ve boyut dağılımını iki dakikalık aralıklarla ölçün. Çıplak farelerden taze sitrat kanı topladıktan sonra, kırmızı kan hücrelerini toplamak için 10 dakika boyunca 1.000 x g'da bir mililitre kan örneğini santrifüjleyin. Bunları PBS ile üç kez yıkayın, ardından hücre peletini PBS ile %2'lik bir son konsantrasyona yeniden süspanse edin: 200 mikrolitre eritrosit süspansiyonunu mililitre başına 1.0 miligram PTX NCM çözeltisi ile karıştırın.

Daha sonra 200 mikrolitre eritrosit süspansiyonunu mililitre PTX DCM çözeltisi başına 1.0 miligram ile karıştırın. Bu karışımları bir inkübatör çalkalayıcıda 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, karışımları beş dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.

Her numunenin süpernatantının 100 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Bundan sonra, 540 nanometrede serbest hemoglobinin emilimini ölçmek için bir mikro plaka okuyucu kullanın. Ellman Testi ile ölçüldüğü gibi, serbest tiyol gruplarından disülfür bağlarına dönüşüm oranı, 48 saatlik oksijen aracılı oksidasyondan sonra %85'e ulaştı.

Burada alternatif bir yöntem olarak hidrojen peroksit aracılı bir oksidasyon yöntemi kullanılmaktadır. Dönüşüm oranı 30 dakikada %88'e ulaşıyor. Bu, oksijen aracılı yaklaşımdan 96 kat daha hızlıdır.

Bu daha verimli yaklaşımı kullanarak, dar bir boyut dağılımına sahip 27 nanometre ölçülen parçacık boyutu ile 50 gramdan fazla nanoparçacık üretilmiştir. PTX yüklü disufide çapraz bağlı misellerin stabilitesi, ciddi misel bozucu koşullar altında da araştırılmaktadır. Misellerin parçacık boyutu zamanla sabit kaldı ve bu da bozulmadan kaldıklarını gösterdi.

GSH'nin hücre içi bir konsantrasyonda sokulmasından sonra, ilaç yüklü disülfür çapraz bağlı misellerin boyutu 30 dakika boyunca bozulmadan kalır, daha sonra aniden bir nanometreye düşer. Bu, misellerin hızlı bir şekilde ayrılmasının bir ön koşulu olan kritik sayıda disülfür bağının azaltılmasını ifade eder. PTX yüklü misellerin hemolitik aktivitesinin temsili sonuçları burada gösterilmektedir.

PTX NCM'ler doza bağımlı bir kırmızı kan hücresi lizis sayısına sahiptir. Bununla birlikte, disülfid çapraz bağlanmasına sahip PTX DCM'ler gözlemlenebilir hemolitik aktivite göstermez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa başka bir teknikte yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, disülfid oluşumu için eşit miktarda %3 hidrojen peroksit eklemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, disülfid çapraz bağlı misellerin kan uyumluluğunu değerlendirmek için Hemoliz Testi yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, ilaç yüklü disülfür çapraz bağlı misellerin nasıl etkili bir şekilde sentezleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu kimyasallardan bazılarının son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.