Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Bu deneyin genel amacı, hareketsiz nötrofilleri izole etmek ve agonistlere yanıt olarak DNA salınımlarını ölçmektir. Bu yöntem, immünoloji ve veterinerlik tıbbında, nötrofil hücre dışı tuzak indüksiyonu veya hücre ölümünün çeşitli agonistlerine nötrofil yanıtı nedir gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunun çeşitli agonistlerinin ve inhibitörlerinin hızlı bir şekilde taranmasına izin vermesidir.

Sağlıklı bir köpek donörünün sefalik damarına 21 gauge kelebek iğne sokarak başlayın, ardından üç mililitrelik bir şırınga takın ve üç adet üç mililitrelik kan örneği alın, örnekleri hemen kapaksız EDTA içeren kan tüplerine aktarın. Damar delinmesinin atravmatik olmasına ve kan akışının iyi olmasına dikkat edin, çünkü zayıf kan alımı zayıf bir nötrofil verimine neden olur. Her tüpü doldurduktan sonra, kan ve antikoagülanın yeterli şekilde karışmasını sağlamak için tüpleri ters çevirin.

Kanı 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Numuneleri eşit hacimde steril oda sıcaklığında% 3 Dextran 500 ile hafifçe ters çevirerek karıştırın ve tüpü oda sıcaklığında 18 ila 20 dakika dik bırakın. Daha sonra saman rengindeki üst tabakayı, alt kırmızı tabaka tarafından kirlenmeden toplanamayacak duruma gelene kadar yeni bir tüpe aktarın.

Üst tabakayı santrifüjleyin. Süpernatanı atın, peleti 10 mililitre steril oda sıcaklığında PBS'de manuel olarak yeniden süspanse edin. Daha sonra, 50 mililitrelik bir konik tüpe sodyum diatrizoat hücre ayırma çözeltisinde 10 mililitre oda sıcaklığında polisakaroz ekleyin.

Hücreleri dikkatlice ayırma çözeltisinin üzerine yerleştirin. Hücreleri santrifüjleme ile ayırın. Üstteki üç plazma ve trombosit mononükleer hücre ve yoğunluk gradyan katmanlarını atın.

Kalan eritrositlerden herhangi birini 10 mililitre oda sıcaklığında su ile parçalayın. 30 saniye sonra, tonisiteyi eski haline getirmek için 10 mililitre steril oda sıcaklığında% 1.8 sodyum klorür ekleyin. Hücreleri hafifçe ters çevirerek karıştırın.

Şimdi hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Beyaz peleti 10 mililitre steril PBS'de yavaşça yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti steril oda sıcaklığında PBS'de mililitre konsantrasyonunda beş kez 10 ila altıncı hücrede yeniden süspanse edin.

Uygun şekilde, bir cam slayt üzerinde küçük hacimli hücreleri havayla kurutun, ardından üreticinin talimatlarına göre hızlı bir sabitleme ve boyama kiti ile boyama yapın. Nötrofil izolasyonu başarılı olmuşsa, çekirdekli hücrelerin en az% 95'i, ışık mikroskobu altında gözlemlendiği gibi minimum eritrosit kontaminasyonu olan granülositler olmalıdır. Nötrofil izolasyonundan hemen sonra, hücre süspansiyonunu steril bir 70 mikron steril filtreden geçirin ve 39 santigrat derece ve% 4 karbondioksitte 30 dakikalık bir inkübasyon için kültür ortamı içeren 96 oyuklu bir plakanın test kuyucuklarına dördüncü hücrelere beş kez 10 ekleyin.

Hücreler bağlandığında, fenol kırmızısı içermeyen ve ısıyla inaktive edilmiş FCS ile test kuyucuklarına ve ayrıca tek başına PBS içeren iki boş kuyucuğa fenol kırmızısı içermeyen RPMI'de ilgilenilen agonistin 100-200 mikrolitrelik bir son hacmine kadar ekleyin. Daha sonra hücrelere uygun bir hücre geçirimsiz nükleik asit boyası ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun. Uygun inkübasyon süresinden sonra, floresansı bir mikroplaka okuyucusunda ölçün.

Trombosit aktive edici faktör ile köpek nötrofillerinin bir saatlik stimülasyonu, kontrol uyarılmamış hücrelere kıyasla floresanda ortalama dört kat artışa neden olur. Bununla birlikte, PMA, iki saatlik aktivasyondan önce artmış bir nötrofil floresan göstermeyen, ancak sonuçta zamanla benzer bir kat artışı üreten daha yavaş bir agonisttir. Nükleik asit boya floresansı, nötrofil hücre dışı tuzak oluşumu için spesifik değildir, çünkü diğer mekanizmalarla hücre ölümü olduğunda veya reaktifler DNA ile kontamine olduğunda da ortaya çıkacaktır.

Örneğin, bu temsili deneyde, ticari bir LPS preparatı, muhtemelen bakteri DNA'sı ile kontaminasyon nedeniyle, nötrofillerin yokluğunda çok yüksek floresan üretti. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa yaklaşık altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, nötrofilleri nazikçe tutmayı unutmamak önemlidir.

Hücreleri girdaplamayın ve süpernatanları dökmek yerine pipetleyin. Bu prosedürü takiben, salınan DNA'nın NETosis ile ilişkili olduğunu doğrulamak için immünofloresan mikroskobu gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, hematoloji alanındaki araştırmacıların, pıhtılaşma üzerine salınan DNA'nın etkileşimini ve hasta plazması da dahil olmak üzere yeni NET agonistlerinin etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, köpek nötrofillerini nasıl izole edeceğinizi ve agonistlere tepkilerini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.