Köpek Nötrofil Ekstrasellüler Trap Release Niceleme için Basit Floresan Testi

Bu deneyin genel amacı, durgun nötrofilleri izole etmek ve agonistlere yanıt olarak DNA salınımlarını ölçmektir. Bu yöntem, nötrofil hücre dışı tuzak indüklemesi veya hücre ölümüne neden olan çeşitli agonistlere karşı nötrofil yanıtı nedir gibi immünoloji ve veteriner hekimliğindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunun çeşitli agonist ve inhibitörlerinin hızlı bir şekilde taranmasına olanak tanımasıdır.

İşleme, sağlıklı bir köpek donörün sefalik venine 21 gauge'lik bir kelebek iğne yerleştirerek başlayın, ardından üç mililitrelik bir şırınga takarak üç adet üç mililitrelik kan örneği alın ve örnekleri derhal kapağı açık EDTA içeren kan tüplerine aktarın. Venipunksiyonun travmatik olmamasına ve kan akışının iyi olmasına dikkat edin, çünkü yetersiz kan alımı düşük nötrofil verimi ile sonuçlanacaktır. Her tüpü doldurduktan sonra, kan ve antikoagülanın yeterli şekilde karıştığından emin olmak için tüpleri ters çevirip sallayın.

Kanı 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Numuneleri, eşit hacimdeki steril oda sıcaklığında %3 Dextran 500 ile nazikçe ters çevirerek karıştırın ve tüpü oda sıcaklığında 18 ila 20 dakika boyunca dik konumda bekletin. Ardından, alt kısımdaki kırmızı tabaka ile kontamine olmadan toplanabildiği sürece, saman rengindeki üst tabakayı yeni bir tüpe aktarın.

Üst tabakayı santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve peleti 10 milliliters sterile oda sıcaklığındaki PBS içinde manuel olarak yeniden süspande edin. Ardından, 50-milliliter konik bir tüpe 10 milliliters oda sıcaklığındaki sodyum diatrizoat içeren polisükroz hücre ayırma çözeltisi ekleyin.

Hücreleri ayırma solüsyonu üzerine dikkatlice katmanlar halinde ekleyin. Hücreleri santrifüjleme yoluyla ayırın. Üstteki üç plazma, trombosit mononükleer hücre ve yoğunluk gradyanı katmanını atın.

Kalan eritrositleri 10 mililitre oda sıcaklığındaki su ile lize edin. 30 saniye sonra, tonisiteyi geri kazandırmak için 10 mililitre steril oda sıcaklığındaki %1,8 sodyum klorür ekleyin. Hücreleri nazikçe ters yüz ederek karıştırın.

Şimdi hücreleri santrifüj ederek toplayın. Beyaz peleti 10 mililitre steril PBS içinde nazikçe yeniden süspande edin. Sayım işleminden sonra hücreleri tekrar santrifüjleyin ve peleti oda sıcaklığındaki steril PBS içinde mililitre başına 5 × 10⁶ hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edin.

Uygun görüldüğünde, küçük bir hacimdeki hücreleri bir lam üzerinde havada kurutun ve ardından üretici talimatlarına göre hızlı fiksasyon ve boyama kiti ile boyayın. Nötrofil izolasyonu başarılı olduysa, ışık mikroskobu altında gözlemlendiğinde, çekirdekli hücrelerin en az %95'i minimal eritrosit kontaminasyonu ile birlikte granülositler olmalıdır. Nötrofil izolasyonunun hemen ardından, hücre süspansiyonunu steril 70 µm steril bir filtreden geçirin ve 39 °C ve %4 CO₂ ortamında 30 dakikalık inkübasyon için kültür medyası içeren 96 kuyucuklu bir plakanın test kuyucuklarına 5 × 10⁴ hücre ekleyin.

Hücreler yapıştığında, hedef agonistten, fenol kırmızısız ve ısı ile inaktive edilmiş FCS ile desteklenmiş RPMI içerisinde, test kuyucuklarına ve yalnızca PBS içeren iki boş kuyucuğa 100-200 microliters nihai hacme ulaşacak şekilde ekleyin. Ardından hücrelere uygun bir hücre geçirgen olmayan nükleik asit boyası ekleyin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Uygun inkübasyon süresinden sonra, floresan değerini bir mikroplaka okuyucu ile ölçün.

Köpek nötrofillerinin platelet-aktive edici faktör ile bir saatlik stimülasyonu, stimüle edilmemiş kontrol hücrelerine kıyasla floresan şiddetinde ortalama dört katlık bir artışla sonuçlanır. Buna karşılık PMA, aktivasyonun ikinci saatinden önce nötrofil floresansında bir artış göstermeyen ancak zamanla benzer bir kat artış sağlayan daha yavaş bir agonisttir. Nükleik asit boyası floresansı, diğer mekanizmalarla hücre ölümü gerçekleştiğinde veya reaktifler DNA ile kontamine olduğunda da ortaya çıkacağından, nötrofil hücre dışı tuzak oluşumuna özgü değildir.

Örneğin, bu temsilci deneyde, ticari bir LPS preparatı, muhtemelen bakteriyel DNA kontaminasyonu nedeniyle nötrofillerin yokluğunda çok yüksek floresans üretmiştir. Uzmanlaşıldıktan sonra, bu teknik uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık altı saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, nötrofillerin nazikçe tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

Hücreleri vortekslemeyin ve süpernatantları dökmek yerine pipetle çekin. Bu prosedürün ardından, salınan DNA'nın NETosis ile ilişkili olduğunu doğrulamak için immünofloresan mikroskopi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik geliştirildikten sonra, hematoloji alanındaki araştırmacıların, salınan DNA'nın koagülasyon üzerindeki etkileşimini ve hasta plazması dahil olmak üzere yeni NET agonistlerinin etkisini incelemelerine yol açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, köpek nötrofillerinin nasıl izole edileceği ve agonistlere verdikleri yanıtın nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir bilgiye sahip olmalısınız.