Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması

Bu protokolün genel amacı, deneysel otoimmün ensefalomiyelit veya EAE'yi indüklemek için kullanılabilen miyelin oligodendrositlerin glikoproteini veya MOG'nin hücre dışı alanına dayalı protein üretmektir. Bu protokol, herhangi bir laboratuvarın EAE'yi indüklemek için bir antijen olarak kullanmak üzere MOG proteini yapmasını mümkün kılar. Bu protokolün ana avantajı, özel protein işleme ekipmanına dayanmamasıdır, bunun yerine hemen hemen her immünoloji laboratuvarında bulunan standart ekipmanı kullanabilirsiniz.

Bu protokol, fare versiyonuna dayalı olarak MOG etiket proteini için optimize edilmiştir, saflaştırma için bir hestat içeren diğer MOG protein ekspresyon sistemleri için çalışmalıdır. Beş mililitre sterilize et suyunu BL 21 MOG etiketli gliserol stoğu ile aşılayın ve gece boyunca 37 santigrat derece ve 200 RPM'de inkübe edin. 500 mililitre steril LB içeren 500 mililitrelik şişelere her birine mililitre ampisilin başına 500 mikrolitre 100 miligram ekleyin. Gece boyunca kültürün bir mililitresini iki LB suyu şişesinin her birine aktarın.

37 santigrat derece ve 200 RPM'de beş saat veya 0.6 optik yoğunluğa kadar inkübe edin. İstenilen hücre yoğunluğuna ulaşıldığında, her bir kültür şişesine 0.5 mililitre bir molar IPTG ekleyin. Şişeyi inkübe edin, dört saat boyunca 37 santigrat derece ve 200 RPM'ye ve ardından gece boyunca oda sıcaklığında ve 75 RPM'ye ayarlayın.

Kültürleri yüksek hızlı santrifüjleme ile uyumlu 250 mililitrelik şişelere eşit olarak dağıtın ve bu noktadan itibaren şişeleri buz üzerinde tutun. Bakteri hücrelerini dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 22.000 kez g'de peletleyin. Tüm bakteri peletlerini toplam 30 mililitre lizat tamponunda yeniden askıya alın ve birleştirin.

Bu hacmi, yüksek hızlı santrifüjleme yapabilen yaklaşık 50 mililitrelik tüpe aktarın. Bu tüpü 30 dakika boyunca 30 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. Kuluçka süresi boyunca, hücreleri yeniden askıya almak için tüpü iki kez sallayın.

İnkübasyonun ardından, tüpü buza taşıyın ve çözeltiyi 20 kilohertz'de ve genlik% 70'te sonikleştirin, üç saniye boyunca açık ve beş darbe için üç saniye boyunca kapalı hale getirin, çözeltiyi toplam altı tur beş darbeli sonikasyon haline getirin ve çözeltinin buzda soğumasına izin verin. Daha sonra, çözeltiyi dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 24.000 kez g'de santrifüjleyin, daha sonra peleti 30 mililitre tampon A'da yeniden süspanse edin ve çözeltiyi üç saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, çözeltiyi daha önce olduğu gibi buz üzerinde sonikleştirin, ardından çözeltiye 17.2 gram guanidin HCl ekleyin.

MOG etiket proteinini çözündürmek için numuneyi bir saat buz üzerinde inkübe edin. Nikel reçinesini şarj etmek ve dengelemek için önce reçine içeren her tüpe 40 mililitre su ekleyerek reçineyi yıkayın. Tüpleri yatay olarak bir külbütörün üzerine yerleştirin ve dört santigrat derecede beş dakika çalkalamaya bırakın.

Bitirdikten sonra, tüpleri dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 4500 kez g'de santrifüjleyin. Peletin bozulmasını önlemek için süpernatanı pipetleyerek atın. Ardından her tüpe 40 mililitre şarj tamponu ekleyin.

Tüpleri bir külbütöre aktarın ve daha önce olduğu gibi tekrar santrifüjlemeden önce dört santigrat derecede 15 dakika çalkalamaya bırakın. Süpernatanı atın ve tüplere 40 mililitre tampon B ekleyin. Tüpleri bir külbütöre aktarın ve tüpleri bir kez daha reçine ile santrifüjlemeden önce dört santigrat derecede beş dakika çalkalamaya bırakın.

MOG etiket proteinini saflaştırmak için, çözünmüş proteinin tüm hacmini nikel reçinesi içeren ilk tüpe aktarın. Karıştırdıktan sonra, tüpü bir saat boyunca dört santigrat derecede bir külbütöre yatay olarak yerleştirin. Tüpü dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 4500 kez g'de merkezi kaynaştırdıktan sonra, bu süpernatanı ikinci nikel reçine tüpüne aktarın ve daha önce olduğu gibi inkübe edin.

Bu arada, ilk tüpteki nikel reçinesini 40 mililitrelik evrim tamponunda yeniden süspanse edin ve tüpü, daha önce olduğu gibi santrifüjlemeden önce beş dakika boyunca dört santigrat derecede bir külbütör üzerine yatay olarak yerleştirin. İma edilen MOG etiketli proteini içeren süpernatanı, saflaştırılmış MOG etiketli protein etiketli 250 mililitrelik bir şişeye aktarın. Bu şişeyi dört santigrat derecede tutun.

Her elüsyon adımında, elde edilen süpernatanı bu şişede toplayın. İlk tüpte bulunan nikele 40 mililitre şerit tamponu ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca bir külbütöre yatay olarak yerleştirin. Tüpü santrifüjleyin, süpernatanı atın ve yükselen nikeli daha önce olduğu gibi yeniden doldurun.

Bitirdikten sonra, ilk tüp için yapıldığı gibi ikinci tüp ile ilerleyin. Çözündürülmüş proteinin yüklü nikel reçinesi üzerine toplam dört tur emilmesi ve elüsyon, proteinin çoğunu geri kazanacaktır. Yılan derisi diyaliz tüpünü yaklaşık 30 santimetre kesin.

Yılan derisinin ucunu üç kez katlayarak ve katlanmış ucu kanama durdurucu ile sıkıştırarak bir ucunu kilitli hemostat ile sabitleyin. Yılan derisini seyreltilmiş MOG etiket proteini ile doldurun. Ardından, açık uçtan dışarı çıkmaya zorlayarak yılan derisindeki hava kabarcıklarını çıkarın.

Son olarak, tüpün diğer ucunu ikinci bir kilitleme kanama durdurucu kullanarak kapatın. Daha sonra, büyük bir kovayı dört molar guanidin ile bir litre bir x asetat tamponu ile doldurun. Kovaya MOG etiket proteini içeren en fazla iki diyaliz tüpü yerleştirin.

Manyetik bir karıştırma çubuğunun altta engellenmeden dönmesi için yer bırakmak için bant kullanarak kanama durdurucuları kovanın yan tarafına sabitleyin. Kovayı manyetik bir etek plakası üzerinde dört santigrat derecelik bir odaya koyun ve yavaş bir dönüş hızına getirin. Diyaliz, tampondaki guanidin miktarını kademeli olarak azaltmak için en az üç gün sürer.

Tüpün sağlam bir şekilde başladığından ve uçların güvenli bir şekilde kapandığından emin olmak için düzenli olarak kontrol edin. Dört ila beş saat sonra, diyaliz kovasına bir litre bir x asetat tamponu ekleyin. Kovada toplam dört litre ile sonuçlanacak şekilde bu işlemi her dört ila beş saatte bir toplam üç kez tekrarlayın.

Tamponun yarısını kovaya attıktan sonra, bir litre bir x asetat tamponu ile tekrar doldurun ve boruyu ve karıştırma çubuğunu ayarlayın. Son olarak, kovadaki dört litrelik hacmin tamamını dört litre taze bir x asetat tamponu ile değiştirin ve dört ila beş saat karıştırmaya bırakın. En iyi sonuçlar için, bu adımı protein konsantrasyonunun olduğu gün yapın.

MOG etiket proteinini konsantre etmek için, bir kalemi alüminyum folyo ile kaplayın ve alüminyum folyoyu bire bir oranında PEG 3350 ve PEG 1000 ile kaplayın. PEG 3350, konsantrasyon sırasında protein agregasyonunu önlemeye yardımcı olabilir ve etkili bir kriyopreservatiftir. Yılan derisi içeren MOG etiket proteinini alüminyum folyonun üzerine koyun ve PEG 8000 ile kaplayın.

Bunu oda sıcaklığında bekletin ve hacim tahmini nihai hacme eşit veya altına gelene kadar hacmi düzenli olarak kontrol edin. Konsantrasyon işlemi sırasında kalem suya aşırı doygun hale gelirse, alüminyum folyo ve PEG ile yeni bir tava kurun. Saflaştırma protokolü boyunca alınan protein örnekleri veya saflığı doğrulamak için bir SDS sayfası jeli üzerinde çalıştırılır.

31.86 kilodaltonda yüksek oranda saflaştırılmış MOG etiketini gösteren temsili bir jel görüntülenir. MOG etiket proteininin doğru bir şekilde katlandığını doğrulamak için, MOG etiket proteininin CD19 pozitif, CD4 negatif, vahşi tip C57 siyah altı fareden veya MOG proteinine özgü bir immünoglobulin ağır zincir eksprese eden IgH MOG farelerinden lenf düğümlerinden dokuz B hücresine bağlanması akış sitometrisi kullanılarak değerlendirildi. Bu protokol baştan sona en az 10 gün gerektirir.

İzolasyon prosedürü boyunca proteini takip etmek ve neyin saklanması gerektiğini ve neyin atılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Nikel reçinesinin şarj edilmesinde kullanılan nikel sülfat hekzahidrat kullanırken son derece tehlikeli olduğunu ve solunmasını veya cilt veya gözlerle temasını önlemek için önlem alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, kendi MOG tag proteininizi nasıl üreteceğinizi ve saflaştıracağınızı iyi bir şekilde anlamış olmalısınız.

Saflaştırıldıktan sonra, MOG etiket proteini tam Freund'un adjuvanında emülsifiye edilebilir ve EAE'yi indüklemek için bir bağışıklama olarak kullanılabilir. MOG etiketi ile indüklenen EAE, merkezi sinir sistemi otoimmünitesinde CD4 veya CDAT hücreleri veya B hücreleri gibi çoklu hücre tiplerinin katılımını incelemek için kullanılabilir. MHC kısıtlı olan kısa peptitin aksine, protein antijeni herhangi bir fare suşunda kullanılabilir.