Name: Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Öğrenin fare Myelin Oligodendrosit Glikoprotein saflaştırma ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit üretimi için standart laboratuvar ekipmanlarıyla güvenilir protein üretim yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Multipl Skleroz Derneği'nden bir hibe ile desteklenmiştir. RWJ, Waugh Ailesi Kanada MS Derneği Doktora Öğrenciliği Ödülü'nün sahibidir.

<ol><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Baxter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+application+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).</li>
<li>Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+%28MOG35-55%29+induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Shetty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodominant+T-cell+epitopes+of+MOG+reside+in+its+transmembrane+and+cytoplasmic+domains+in+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Neuroimmunol+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE.</a> Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).</li>
<li>Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+recognition+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+autoantigen+depends+on+immunization+with+protein+rather+than+short+peptide%2C+while+B+cell+invasion+of+the+CNS+in+autoimmunity+does+not%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not.</a> J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).</li>
<li>Barun, B., Bar-Or, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+multiple+sclerosis+with+anti-CD20+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies.</a> Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).</li>
<li>Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+encephalitogenicity+of+recombinant+human+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).</li>
<li>Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+and+human+myelin+oligodendrocyte+glycoproteins+induce+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+by+different+mechanisms+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Restriction+Enzyme+Digests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+additives+on+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of additives on protein aggregation.</a> Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).</li>
<li>Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+Infiltration+of+the+Spinal+Cord+by+Non-Classically+Activated+B+Cells+is+Associated+with+Chronic+Disease+Course+in+a+Spontaneous+B+Cell-Dependent+Model+of+CNS+Autoimmune+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease.</a> Front Immunol. 6, 470(2015).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+S.Tag+fusion+system+for+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The S.Tag fusion system for protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).</li>
<li>Amor, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epitopes+of+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+for+the+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+SJL+and+Biozzi+AB%2FH+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice.</a> J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).</li>
<li>Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+profiling+of+tobacco+etch+virus+protease+using+a+novel+fluorescence-assisted+whole-cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay.</a> PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).</li>
<li>Litzenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+producing+demyelinating+autoantibodies%3A+development+and+function+in+gene-targeted+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice.</a> J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).</li>
<li>Zhang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+purification+of+Escherichia+coli-expressed+human+thymosin-alpha1+using+affinity+chromatography+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography.</a> Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).</li>
<li>Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+protein+production+levels+in+Escherichia+coli+with+a+strong+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter.</a> FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).</li>
<li>Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+T+cells+exacerbates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+mouse%2C+but+not+rat%2C+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens.</a> J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).</li>
<li>Kapust, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+etch+virus+protease%3A+mechanism+of+autolysis+and+rational+design+of+stable+mutants+with+wild-type+catalytic+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency.</a> Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).</li>
<li>Blommel, P. G., Fox, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+approach+to+improving+large-scale+production+of+tobacco+etch+virus+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease.</a> Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Burada, MOG etiket protein ve nasıl MOG işareti proteiniyle saf MOG 1-125 oluşturmak için üretimi için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol standardı His-tag bazlı protein saflaştırma yöntemleri, hem de eski MOG bazlı protein 15 oluşturulması için daha önce tarif edilen protokol ile ilgili hem de dayanır. Burada tarif edilmemiş olsa da, MOG etiketi proteinin birincil kullanımı protein antijeni ile bağışıklık kazandırma yoluyla EAE oluşturmaktır. EAE MOG işa...

MS kronik enflamasyon ve miyelin yönelik otoimmün yanıtı tarafından tahrik düşünülmektedir CNS nörodejenerasyon ile karakterize edilen bir insan hastalıktır. Zamanla miyelin ve akson kaybının bilişsel ve motor fonksiyon 1 kademeli bir düşüş ile sonuçlanır. &quot;Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT&quot; MSS miyelin yönelik otoimmün hastalık hayvan modelleri için bir terimdir. İnsan MS gibi, EAE tipik haliyle, bazı durumlarda, merkezi sinir sisteminin, bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile karakterize edilir, demiyelinasyon 2. Ancak, herhangi bir EAE modeli kısmen insan MS benzer derecesi kullanılan türü veya suşu ve altta yatan anti miyelin otoimmün yanıtın karmaşıklığına bağlıdır. Anti-miyelin otoimmünite deneysel çeşitli yollarla bağlı ama günümüzde en yaygın kullanılan yöntem, immünodominant CD4 taklit eden amino asitlerin kısa bir peptid ile farelere bağışıklık kazandırılması olan edilebilir <sBir miyelin protein&gt; + T hücre epitopu kadar. Bu patojenik tepkisi oluşturmak için minimum gerekliliği temsil eder. Belki de bu en yaygın C57BL / 6 fareleri 3 EAE ikna etmek için kullanılır (MOG 35-55) miyelin oligodendrosit glikoproteinin türetilen 21 amino asitli bir peptittir. Bununla birlikte, bazı deneysel amaçlar için daha büyük bir protein antijenleri ve hatta kısa bir peptit ile bağışıklık kazandırma üzerine, bu çeşitli avantajları vardır ile bağışıklık kazandırmak için arzu edilebilir ve hatta gereklidir. Bütün proteinini veya bunun spesifik bir alan adı temsil daha büyük protein antijenleri, farklı türlerde da birden fazla fare soylannda sunum için, normal olarak işleme ya da süre önce, MHC kısıtlaması nedeniyle, kısa peptidler genellikle suşu çok sınırlı aralıkta etkilidirler 4. İkinci olarak, daha büyük bir protein antijeni, antijen tanıma lenfosit daha fazla türde içeren daha karmaşık bir bağışıklık tepkisi indüklemek yerine sınırlandırıcı edebilenCD4 + T hücreleri g antijen algılama. Örneğin, B hücre reseptörleri (BCR) yoluyla B hücrelerinin bütün yerine işlenmiş protein ile doğrudan etkileşenler. Biz ve diğerleri MOG proteini 5 tanımaz MOG 35-55 bağışıklama ile aktive olduğu B hücreleri göstermiştir. B hücreleri, en son, insan MS 6 patojenik bir rol oynadığı gösterilmiştir olduğundan, otoimmün patolojisinde B hücrelerini içermektedir EAE modelleri giderek önem kazanmaktadır. EAE uyarılması için daha büyük bir protein antijenlerinin kullanmanın avantajlarına rağmen, bu proteinler için birkaç Ticari kaynaklar orada kalır. MOG 35-55 gibi kısa peptidler çok hızlı ve nispeten düşük bir maliyetle sentezlenebilir Nitekim, MOG proteini ticari seçenekler satın almak için sınırlı ve maliyet önemli ölçüde daha fazladır. Bununla birlikte, MOG dışı alanını oluşturmak için araştırma grupları için çeşitli ekspresyon vektörleri (MOG 1-125) kendileri vardır. however, biz literatürde belirledik ifade sistemlerinin tüm beri daha verimli ifade sistemleri 7 ile yerini almış eski teknolojilere dayanmaktadır. Bundan başka, pek çok fare ya da insan MOG 8 dayanmaktadır. Farelerde otoimmünite bazı araştırmalar için, fare MOG oto dayalı bir antijen tercih edilir. Son olarak, ticari ya da sentezleme vektörü olarak Ya tespit tüm MOG tabanlı proteinler, MOG 1-125 tabanına ek amino asitleri ihtiva eden füzyon proteinleridir. Bunlar tespit koyamadık birçok fonksiyonu ile hangi yanı arıtma ve genellikle diğer dizileri için bir etiket içerir. Bu sınırlamaları gidermek için, biz MOG proteini 5 bilinen çözülemezliğini mücadele için tioredoksin içeren bir etikete kaynaşmış fare MOG hücre dışı alanına dayalı yeni bir füzyon proteini oluşturulur. takı sekansı da saflaştırma ve bir TEV proteaz cle bir 6xHis dizisini içeriristenirse, tüm etiket dizilerinin tümüyle kaldırılmasını sağlar avage sitesi. Bu saf MOG 1-125 protein üretmek için farkında tek yöntemdir. Bol miktarda protein üretimini kolaylaştırmak için, MOG 1-125 sekansı, bakteriyel ekspresyon için kodon optimizasyonu ve MOG künye füzyon proteini, pET-32 ekspresyon sistemi içine sokulmuştur. Burada, en immünoloji laboratuarlarında mevcut olmayan özel ekipman kullanılarak, üretmek ve MOG etiketi protein ve saf MOG 1-125 arındırmak için detaylı protokol açıklar.

<table><tbody><tr><td>BL21 E. coli- pet32-MOGtag</td><td>Kerfoot laboratuvarı</td><td></td><td>Bu bakteriler MOGtag proteinini yapmak için gereklidir. Bu bakterilerin gliserol stokları istek üzerine temin edilebilir.</td></tr><tr><td>LB et suyu değirmeni</td><td>Bioshop</td><td>LBL407.1</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>bio basic</td><td>AB0028</td><td>Tozu 100 mg / ml'de% 50 etanol / %50 H 2 O olarak yeniden yapılandırın. -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Bioshop</td><td>IPT002.5</td><td>Tozu 1M'de H2O'ya yeniden yapılandırın ve -20 °C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Tavuk yumurtası lizozim</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.10</td><td>H2O'da 50 mg / ml'de sulandırılır ve -80 ° C'de saklanır.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>T-8532</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>ömrü teknolojileri</td><td>20012-027</td><td>Ticari fosfat tamponlu salin gerekli değildir, herhangi bir standart laboratuvar yapımı fosfat tamponlu salin yeterlidir.</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Bioshop</td><td>SOD004.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Bioshop</td><td>TRS002.1</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol Bioshop</td><td></td><td>IMD508.100</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin-HCl</td><td>Sigma</td><td>G3272</td><td>Kalite% 98'den fazla saflıkta olmalıdır.</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>Nikel (II) sülfat</td><td>Bioshop</td><td>NIC700.500</td><td></td></tr><tr><td>Bağlama reçinesi</td><td>EMD Millipore</td><td>69670-3</td><td>%20 etanolde saklayın %80 H2O'da 4 &°C; C</td></tr><tr><td>Susuz etanol</td><td>Ticari Alkoller</td><td>P016EAAN</td><td>Gerektiği kadar su ile seyreltin.</td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat trihidrat</td><td>Bioshop</td><td>SAA305.500</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümin standardı</td><td>bio-rad</td><td>500-0206</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad protein tahlili boya reaktif konsantresi</td><td>bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamin tetraasetik asit, disodyum tuzu dihidrat</td><td>Fisher scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Bioshop</td><td>TRS001.1</td><td></td></tr><tr><td>7000 MW Yılan derisi diyaliz tüpü</td><td>Thermoscientific</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ml</td><td>Bu reaktif, çeker ocak dışında kullanılmamalıdır.</td></tr><tr><td>AcTEV proteaz</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>12575-015</td><td>Kendi TEV proteazınızı üretmek, (https://www.addgene.org/8827/) kullanılarak gerçekleştirilebilir ve referans 17</td></tr><tr><td>Polietilenglikol 3350</td><td>Bioshop</td><td>PEG335.1</td><td></td></tr><tr><td>polietilenglikol 8000</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp düz tabanlı 96 kuyulu plaka</td><td>ebioscience</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher scientific</td><td>FB-120-110</td><td></td></tr><tr><td>Eon mikroplaka spektrometresi</td><td>Biotek</td><td>11-120-611</td><td>Bu ekipman, Gen5 veri analiz yazılımını kullanır.</td></tr><tr><td>Gen5 veri analiz yazılımı</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodyum dodesil sülfat</td><td>Bioshop</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>bromofenol mavisi</td><td>Bioshop</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Bioshop</td><td>GLY001</td><td></td></tr><tr><td>Protein tuzdan arındırma sütunları</td><td>Thermoscientific</td><td>89849</td><td></td></tr><tr><td>Glisin Bioshop</td><td></td><td>GLN001</td><td></td></tr><tr><td>prekast %12 poliakrilamid jel</td><td>bio-rad</td><td>456-1045</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı leke reaktifi</td><td>EMD Millipore 553215</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel yuvası EZ görüntüleyici</td><td>bio-rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Beyaz Işık Numune Tepsisi</td><td>bio-rad</td><td>1708272&nbsp;</td><td>Coomassie mavisi lekeleri için jel dock EZ görüntüleyici ile birlikte kullanılır</td></tr><tr><td>Protein merdiveni</td><td>bio-rad</td><td>1610375</td><td></td></tr></tbody></table>

deneysel otoimmün ensefalomyelİt Çalışmaları basit ve etkin Üretim ve fare miyelin oligodendrosit glikoprotein saflaştırılması

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multipl skleroz (MS), miyelini hedef alan otoimmün yanıtların bir sonucu olarak ortaya çıktığı düşünülen, merkezi sinir sisteminin (MSS) kronik inflamatuar bir hastalığıdır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), CNS otoimmün hastalığının en yaygın hayvan modelidir ve tipik olarak miyelin proteinlerinin immünodominant CD4+ T hücre epitoplarını temsil eden kısa peptitlerle bağışıklama yoluyla indüklenir. Bununla birlikte, B hücreleri işlenmemiş proteini doğrudan tanır ve kısa peptit ile bağışıklama, doğal proteini tanıyan B hücrelerini aktive etmez. MS'de B hücresini tüketen tedavilerin son klinik çalışmaları, insanlarda hastalığa yol açmada B hücrelerinin rolü olduğunu öne sürdüğü için, otoantijenin B hücresi tarafından tanınmasını içeren hayvan modellerine acil bir ihtiyaç vardır. Bu amaçla, miyelin oligodendrosit glikoproteininin (MOG) fare versiyonunun hücre dışı alanını ve ayrıca saflaştırma amacıyla bir His-etiketinin N-terminal füzyonlarını ve çözünürlüğü artırmak için tioredoksin proteinini (MOG etiketi) içeren yeni bir füzyonproteini ürettik. Tüm etiket dizilerinin çıkarılmasına izin vermek için bir tütün aşındırma virüsü (TEV) proteaz bölünme bölgesi dahil edildi ve geriye yalnızca saf MOG1-125 hücre dışı alan bırakıldı. Burada, büyük miktarlarda saf MOGetiketi veya MOG1-125 üretmek için yalnızca standart laboratuvar ekipmanını kullanan basit bir protokolü açıklıyoruz. Bu protokol sürekli olarak 200 mg'dan fazla MOGetiket proteini üretir. MOGetiketi veya MOG1-125 ile bağışıklama, yerli fare MOG'unu tanıyan patojenik B hücrelerini içeren bir otoimmün yanıt oluşturur.

Saflaştırma işlemi tamamlandıktan sonra, örnekler adım 1.4, 2.1, 3.4 toplanır ve adım 6.4 son ürün, bir protein jeli (Şekil 3A) üzerinde çalıştırılmalıdır. MOG etiketi ilk T O / N numunede 31.86 kDa bandı olarak görünür, ancak 0 T, ve nihai saf ürün tek bant olmalıyım. MOG etiket protein doğru olarak katlandığında olup olmadığını test etmek için, MOG etiket protein FACS ile MOG-protein spesifik B hücreleri etiketleme...

Fare Miyelin Oligodendrosit Glikoproteini içeren büyük miktarlarda bir füzyon proteini üretmek ve saflaştırmak için yalnızca temel laboratuvar ekipmanını kullanan basit bir protokolü açıklıyoruz. Bu protein, hem T hem de B hücreleri tarafından yönlendirilen deneysel otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için kullanılabilir.

Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Bu protokolün genel amacı, deneysel otoimmün ensefalomiyelit veya EAE indüklemek için kullanılabilecek olan miyelin oligodendrosit glikoproteininin veya MOG'un hücre dışı alanına dayalı protein üretmektir. Bu protokol, herhangi bir laboratuvarın EAE indüklemek için bir antijen olarak kullanmak üzere MOG proteini üretmesini mümkün kılar. Bu protokolün temel avantajı, özel protein işleme ekipmanlarına dayanmaması, bunun yerine hemen hemen her immünoloji laboratuvarında bulunan standart ekipmanların kullanılabilmesidir.Bu protokol, fare versiyonuna dayalı MOG tag proteini için optimize edilmiştir; saflaştırma için bir histidin etiketi içeren diğer MOG protein ekspresyon sistemleri için de çalışmalıdır. Beş mililitre sterilize edilmiş besiyerini BL 21 MOG tag gliserol stoğu ile inoküle edin ve 37 °C'de, 200 RPM'de gece boyunca inkübe edin. 500 mililitre steril LB içeren iki adet 500 mililitrelik erlenmeyer flaskının her birine 500 µL 100 mg/mL ampisilin ekleyin. Gece boyu kültüre edilen ortamdan bir mililitreyi LB besiyeri içeren iki flaskın her birine aktarın.37 °C'de ve 200 RPM'de beş saat boyunca veya optik yoğunluk 0,6'ya ulaşana kadar inkübe edin. İstenen hücre yoğunluğuna ulaşıldığında, her kültür balonuna 0,5 mL 1 M IPTG ekleyin. Balonu 37 °C'de ve 200 RPM'de dört saat, ardından oda sıcaklığında ve 75 RPM'de gece boyunca inkübe edin.Kültürleri, yüksek hızlı santrifüjle uyumlu 250 mililitrelik şişelere eşit şekilde dağıtın ve şişeleri bu noktadan itibaren buz üzerinde tutun. Bakteri hücrelerini 4 °C'de, 22,000 ×g hızında 15 dakika boyunca çöktürün. Tüm bakteri peletlerini toplam 30 mililitre lizat tamponu içerisinde yeniden süspande edin ve birleştirin.Bu hacmi yüksek hızda santrifüj yapabilen yaklaşık 50 milliliter hacimli yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Bu tüpü 30 dakika boyunca 30 degree Celsius sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirin. İnkübasyon süresi boyunca, hücreleri yeniden süspand etmek için tüpü iki kez çalkalayın.İnkübasyonun ardından tüpü buza taşıyın ve çözeltiyi 20 kilohertz frekansında ve %70 genlikte, üç saniye açık ve üç saniye kapalı olacak şekilde beş pulses boyunca sonikasyona tabi tutun; çözeltiyi, turları arasında buzda soğumasını sağlayarak toplam altı tur beş pulses şeklinde sonike edin. Ardından, çözeltiyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 24.000 ×g hızda santrifüjleyin, daha sonra peleti 30 milliliters Buffer A içinde yeniden süspande edin ve çözeltiyi 4 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası çözeltiyi daha önce olduğu gibi buz üzerinde sonike edin, ardından çözeltiye 17.2 grams guanidine HCl ekleyin.MOG etiketli proteini çözünür hale getirmek için örneği buz üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Nikel reçinesini yüklemek ve dengelemek için, öncelikle reçine içeren her tüpe 40 milliliters su ekleyerek reçineyi yıkayın. Tüpleri bir sallayıcı üzerine yatay olarak yerleştirin ve dört degrees Celsius sıcaklıkta beş dakika boyunca ajite edilmelerini sağlayın.İşlem tamamlandığında, tüpleri 4 °C'de sekiz dakika boyunca 4500 ×g hızında santrifüjleyin. Peleti rahatsız etmemek için süpernatantı pipetleyerek uzaklaştırın. Ardından her tüpe 40 mL yükleme tamponu ekleyin.Tüpleri bir sallayıcıya aktarın ve daha önce yapıldığı gibi tekrar santrifüjlemeden önce 4 °C'de 15 dakika boyunca ajite olmalarını sağlayın. Süpernatanı uzaklaştırın ve tüplere 40 mL tampon B ekleyin. Tüpleri bir sallayıcıya aktarın ve reçine içeren tüpleri bir kez daha santrifüjlemeden önce 4 °C'de beş dakika boyunca ajite olmalarını sağlayın.MOG etiketli proteini saflaştırmak için, çözünür hale getirilmiş proteinin tamamını nikel reçine içeren birinci tüpe aktarın. Karıştırdıktan sonra, tüpü dört santigrat derecede bir saat boyunca bir sallayıcıya yatay olarak yerleştirin. Tüpü dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 4500 ×g hızında santrifüj ettikten sonra, bu süpernatanı ikinci nikel reçine tüpüne aktarın ve daha önce olduğu gibi inkübe edin.Bu sırada, ilk tüpteki nikel reçinesini 40 milliliters evrim tamponu içinde yeniden süspande edin ve tüpü, daha önce olduğu gibi santrifüjlemeden önce beş dakika boyunca dört degrees Celsius'ta bir rocker üzerine yatay olarak yerleştirin. Bahsedilen MOG etiketli proteini içeren süpernatanı, üzerinde saflaştırılmış MOG etiketli protein yazan 250 milliliter'lik bir şişeye aktarın. Bu şişeyi dört degrees Celsius'ta muhafaza edin.Her elüsyon adımında, elde edilen süpernatanı bu şişede toplayın. İlk tüpte bulunan nikele 40 mililitre şerit tamponu ekleyin ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca yatay bir sarsıcıya yerleştirin. Tüpü santrifüjleyin, süpernatanı atın ve nikel reçineyi daha önce olduğu gibi yeniden doldurun.İşlem tamamlandığında, birinci tüpte yapıldığı gibi ikinci tüp ile devam edin. Çözünür hale getirilmiş proteinin yüklü nikel reçineye absorpsiyonu ve elüsyonu şeklinde toplam dört tur uygulanması, proteinin büyük kısmını geri kazanacaktır. Yaklaşık 30 santimetre uzunluğunda yılan derisi diyaliz tüpü kesin.Yılan derisinin ucunu üç kez katlayıp katlanmış ucu hemostatla sıkarak bir ucunu kilitli hemostatlar ile sabitleyin. Yılan derisini seyreltilmiş MOG etiketli protein ile doldurun. Ardından, hava kabarcıklarını açık uçtan dışarı iterek yılan derisinden uzaklaştırın.Son olarak, tüpün diğer ucunu ikinci bir kilitleme hemostatı kullanarak kapatın. Ardından, büyük bir kovayı bir litre 1x asetat tamponu ve 4 M guanidin ile doldurun. MOG etiketli protein içeren en fazla iki diyaliz tüpü kesitini kovanın içine yerleştirin.Hemostatları, manyetik karıştırma çubuğunun dipte engelsiz dönebilmesi için boşluk bırakacak şekilde bantla kovanın yan tarafına sabitleyin. Kovayı, dört derece santigrat (°C) sıcaklıktaki bir odada manyetik karıştırıcı plakaya yerleştirin ve yavaş bir dönme hızına ayarlayarak çalıştırın. Diyaliz işlemi, tampontaki guanidin miktarını kademeli olarak azaltmak için minimum üç gün sürer.Tüpün başlangıçta sağlam olduğundan ve uçlarının güvenli bir şekilde kapalı olduğundan düzenli olarak emin olun. Dört ila beş saat sonra, diyaliz kovasına bir litre 1x asetat tamponu ekleyin. Kovada toplam dört litre olacak şekilde, bu işlemi her dört ila beş saatte bir toplam üç kez tekrarlayın.Kovadaki tamponun yarısı boşaltıldıktan sonra, bir litre 1x asetat tamponu ile yeniden doldurun, hortumları ve manyetik karıştırıcıyı yerleştirin. Son olarak, kovadaki dört litrelik hacmin tamamını dört litre taze 1x asetat tamponu ile değiştirin ve dört ila beş saat boyunca karıştırın. En iyi sonuçlar için, bu adımı protein konsantrasyonu işleminin yapılacağı gün gerçekleştirin.MOG etiketli proteini konsantre etmek için, bir kalemin içini alüminyum folyo ile kaplayın ve alüminyum folyonun üzerini bir bir oranında PEG 3350 ve PEG 1000 ile örtün. PEG 3350, konsantrasyon sırasında protein agregasyonunu önlemeye yardımcı olabilir ve etkili bir kriyokoruyucudur. MOG etiketli protein içeren yılan derisi tüpü alüminyum folyonun üzerine yerleştirin ve üzerini PEG 8000 ile kaplayın.Bunu oda sıcaklığında bekletin ve hacim, tahmini son hacme eşit veya ondan daha düşük olana kadar hacmi düzenli olarak kontrol edin. Konsantrasyon işlemi sırasında kalem aşırı derecede suyla doyarsa, alüminyum folyo ve PEG ile yeni bir kap hazırlayın. Saflaştırma protokolü boyunca alınan protein örnekleri veya saflığı doğrulamak için SDS page jelinde çalıştırılan örnekler kullanılır.31,86 kilodalton ağırlığındaki yüksek saflıktaki MOG etiketi gösteren temsili bir jel görüntülenmektedir. MOG etiket proteininin doğru katlandığını doğrulamak için; MOG etiket proteininin, ya yabani tip C57 black six farelerinden ya da MOG proteinine özgü bir immünoglobulin ağır zinciri eksprese eden IgH MOG farelerinin lenf düğümlerinden alınan CD19 pozitif, CD4 negatif, dokuz B hücresine bağlanması akış sitometrisi kullanılarak değerlendirilmiştir. Bu protokolün başlangıçtan sona tamamlanması için en az 10 gün gereklidir.İzolasyon prosedürü boyunca proteini takip etmek, nelerin saklanması ve nelerin atılması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Nikel reçinesini şarj etmek için kullanılan nikel sülfat hekzahidratın son derece tehlikeli olduğunu ve solunmasını veya cilt ya da gözlerle temasını önlemek için önlem alınması gerektiğini unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, kendi MOG etiketli proteininizi nasıl üreteceğiniz ve saflaştıracağınız konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Saflaştırıldıktan sonra, MOG tag proteini komple Freund adjuvanı ile emülsifiye edilebilir ve EAE'yi indüklemek için immünizasyon olarak kullanılabilir. MOG tag ile indüklenen EAE; CD4 veya CDAT hücreleri veya B hücreleri gibi çoklu hücre tiplerinin merkezi sinir sistemi otoimmünitesindeki rolünü incelemek için kullanılabilir. MHC ile kısıtlı olan kısa peptitlerin aksine, protein antijeni herhangi bir fare suşunda kullanılabilir.

simple-efficient-production-purification-mouse-myelin-oligodendrocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, bir murin modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyeliti (EAE) indüklemek için bir antijen adjuvan emülsiyonu oluşturmak için etkili bir homojenizasyon tekniğini göstermektedir. Emülsiyon, inaktive edilmiş bir patojenik bakteri içeren sürekli bir yağ fazı ile çevrili su fazında bir otoantijen - miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG) içerir. Emülsiyon, uzun süreli bir bağışıklık tepkisi için sürekli bir antijen salınımı sağlar.

Otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için bir antijen adjuvan emülsiyonunun hazırlanması

Video, miyelin oligodendrosit glikoproteinleri ve inaktive edilmiş Mycobacterium tuberculosis'in bir kombinasyonunu enjekte ederek bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelit indüksiyonunu göstermektedir. Model, araştırmacıların hastalık mekanizmalarını incelemelerine ve terapötik müdahaleleri test etmelerine olanak tanır.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit İndüksiyonu

Bu video, beyne göç eden otoreaktif T hücrelerini aktive etmek için miyelin türevi peptitleri bir adjuvan ile enjekte ederek deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indükleme yöntemini göstermektedir. Boğmaca toksini, kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için uygulanır ve bu T hücrelerinin ve diğer bağışıklık hücrelerinin beyne girmesine izin verir. Bu bağışıklık hücreleri demiyelinizasyona neden olarak sinir iletiminin bozulmasına ve EAE gelişimine yol açar.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Oluşumu

Bu videoda, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) kullanılarak multipl sklerozun bir fare modeli oluşturulmuştur. Fareye, otoreaktif T hücrelerini aktive eden bir bağışıklık tepkisini tetikleyen bir nöronal peptit ve bir adjuvan içeren bir emülsiyon enjekte edilir. Bunu, otoreaktif T hücrelerinin beyne sızmasına izin vererek kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için bir boğmaca toksini (PTX) enjeksiyonu takip eder. Bu infiltrasyon, multipl sklerozun demiyelinizan durumunu taklit ederek...

Kaynak: Jain, R. W., et al. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit çalışmaları için fare miyelin oligodendrosit glikoproteininin basit ve verimli üretimi ve saflaştırılması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit (EAE) çalışmalarında kullanılan rekombinant bir Miyelin Oligodendrosit Glikoproteini (MOG) olan MOGtag'ın izolasyonunu ve saflaştırılmasını göstermektedir. Protokol, saflaştırılmış MOGtag elde etmek için bakteriyel liziz, sonikasyon, santrifüjleme ve nikel afinite...

Rekombinant Miyelin Oligodendrosit Glikoproteinlerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), çoklu skleroz kurulmuş bir hayvan modelidir. C57BL / 6 fareleri, merkezi sinir sistemi otoreaktif bağışıklık hücreleri tarafından neden olduğu artan gevşek felce neden, miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) peptit 35-55 (MOG 35-55) ile immünize edilir. Hastalığın başlama ve izleme için protokoller tartışılacaktır.

Miyelin Oligodendrosit Glikoprotein (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) C57BL / 6 Farelerde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit (EAE) Bağlı

Birincil fare oligodendrocytes, immunomagnetic izolasyonu vitro kültür için hücreleri hızlı ve spesifik yalıtım sağlar açıklar.

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

Bu protokol, miyelin oligodendrosit glikoprotein kullanılarak bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelitin indüklenmesini ve klinik bir skorlama sistemi kullanılarak hastalık sürecinin izlenmesini açıklamaktadır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit ile ilişkili semptomlar, hastalık sürecini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için fare femur mikro-bilgisayarlı tomografi analizi ve açık alan testi kullanılarak analiz edilir.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Çeşitli Değerlendirme Göstergeleri

Multipl sklerozun bir hayvan modeli olan deneysel otoimmün ensefalomiyeliti indüklemek için, fareler bir otoantijen ve Freund'un adjuvanını tamamlayan bir yağda su emülsiyonu ile bağışıklanır. Bu emülsiyonların hazırlanması için çeşitli protokoller mevcut olsa da, emülsiyon hazırlığı için hızlı, basit ve standartlaştırılmış bir homojenizasyon protokolü burada sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyeliti İndüklemek için Antijen/Adjuvan Emülsiyonlar Hazırlamak için Hızlı, Basit ve Standartlaştırılmış Bir Homojenizasyon Yöntemi

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan hastalığı ile güçlü bir humoral otoimmün yanıtı paylaşan bir multipl skleroz (MS) hayvan modelidir. Burada, EAE ile aşılanmış farelerin serumundaki otoantikorları ölçmek için basit ve esnek bir ELISA protokolü bildiriyoruz.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Öğrenin fare Myelin Oligodendrosit Glikoprotein saflaştırma ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit üretimi için standart laboratuvar ekipmanlarıyla güvenilir protein üretim yöntemini.

Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması

Daha fazla video keşfet