Protein Kalite Kontrol Sistemi incelenmesi D. diskodeyum Sıcaklık kontrollü Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak
2 Aralık 2016
Sosyal amip Dictyostelium discoideum, yakın zamanda protein yanlış katlanması ve proteostazı incelemek için bir sistem olarak kurulmuştur. Burada, D. discoideum'da sıcaklığa bağlı protein agregasyonunu ve hücresel stres tepkisini incelemek için yeni bir görüntüleme tabanlı metodoloji açıklıyoruz.
Bu görüntüleme tekniğinin genel amacı, Dictyostelium discoideum hücrelerinde ısı stresine bağlı hücresel bozulmaları gözlemlemektir. Bu yöntem, amip Dictyostelium discoideum'da ısı stresi tepkisi ve protein kalite kontrol mekanizmalarının anlaşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin dosya görüntülemesine uygulanan sıcaklığın sıkı ve hassas bir şekilde kontrol edilmesidir.
Prosedüre başlamak için, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi Dictyostelium hücrelerini hazırlayın. Görüntülemeden bir gün önce, hücreleri mililitre başına 10.000 hücreye kadar düşük floresan ortamına bölün. Görüntülemeden önce, hücreleri LFM'deki doku plakasından toplayın, ardından yeterli sayıda hücreyi cam tabanlı kaplara aktarın.
Hücrelerin 20 dakika oturmasına izin verin, ardından yerleşmemiş hücreleri çıkarmak için kullanılmış ortamı dikkatlice yeni ortamla değiştirin. 23 santigrat derecede stressiz koşullar altında görüntü hücreleri, en az altı görüş alanı elde eder. Hücrenin tüm hacmini yakalamak için bir ila 0,25 mikrometrelik adımlarla maksimum yedi mikrometrelik Z yığınları elde edin.
Ardından, toplam hücre sayısını değerlendirmek için bir referans parlak alan görüntüsü elde edin. Ardından, soğutma odasının sıcaklığını 30 santigrat dereceye ayarlayın. Sıcaklık göstergesi istenen değere ulaştıktan sonra, parlak alan kanalında manuel olarak yeniden netleme yapın.
Hızlandırılmış çekimi başlatmadan önce kaydedilen tüm FOV'ları kontrol edin, ardından zaman noktaları arasında beş ila 10 dakikalık bir zaman aralığı ile dört saatlik ısı stresi için hızlandırılmış bir çekim başlatın. İlk iki zaman noktasının alınması sırasında odaklamanın doğru olduğundan emin olmak için kontrol edin. Isı stresi tamamlandıktan sonra, sıcaklığı tekrar 23 santigrat dereceye düşürün.
Sıcaklık göstergesinin manuel olarak ayarlanmasını ve yeniden odaklanmasını bekleyin. Ardından, kurtarma aşamasında 10 ila 20 dakikalık zaman aralıklarında sekiz ila 10 saat boyunca zaman atlamalı videolar kaydedin. İlk zaman noktasının alınması sırasında odaklamanın doğru olduğundan emin olmak için kontrol edin.
Cell Counter eklentisi ile donatılmış görüntü işleme paketini açarak başlayın. Dosya'ya ve ardından Aç'a tıklayarak parlak alan görüntü yığınını yükleyin. Ardından, Hücre Sayacı eklentisini açın, Başlat'a tıklayarak görüntü yığınını yükleyin.
Uygun kutuyu tıklatarak sayaç türünü seçin. Bundan sonra, toplam hücre sayısını sayın, İşaretçileri Kaydet'i tıklayarak işaretçileri kaydedin. İşaretleyiciler kaydedildikten sonra, floresan görüntü hiper yığınının maksimum projeksiyonunu yükleyin.
Hücre Sayacı eklentisini açın ve İşaretçileri Yükle'ye tıklayarak işaretçileri yükleyin. Ardından, sitozolik odaklar için işaretleyici tipini seçin ve hücreleri sayın. Mevcut işaretçiler, tek tek hücrelerin konumu için kılavuz olarak kullanılabilir.
Sonuçlar'a tıklayarak dilim başına sayım sayısını alın, ardından daha fazla hesaplama için sayımları başka bir yere kaydedin. Bu çalışmada, Dictyostelium hücrelerinde GFP etiketli poliglutamin proteini Q103 dağılımı gözlenmiştir. Normal büyüme koşulları altında, Q103-GFP sitoplazmada yaygın olarak dağılır.
Isı stresi sırasında, Q103-GFP işaretleyicisi yapıları delmek için birleşir. Normal büyüme koşullarında stres salınımı ve büyüme üzerine bu yapılar çözülür. Q103-GFP'nin yeniden dağılımı ve ısı stresinin neden olduğu sitozolik odakların oluşumu, görüntü analizi kullanılarak ölçülür.
Isı stresi tepkisinin temsili sonuçları burada görülebilir. Devam eden ısı stresi ile sitozolik Q103-GFP odaklı hücre sayısı artar. Isı stresi sırasında, protein kalite kontrol sistemi aşırı yüklenir, bu nedenle agregasyona eğilimli proteinler çözünür bir durumda tutulamaz.
Isı stresinden sonra, sitozolik odaklara sahip hücrelerin sayısı azalır, bu da toplanan proteinlerin çözündüğünü düşündürür. Bu videoyu izledikten sonra, amip Dictyostelium discoideum'da ısı stresine bağlı bozulmaların nasıl izleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Görüntüleme boyunca, mikroskobunuzda bir donanım otofokusu yoksa, odağın uygun şekilde ayarlandığından emin olmayı unutmamak önemlidir.
Bu protokolde gösterilen sıcaklık kontrolü, ısı stresi tepkisi alanının ötesinde kullanılabilir. Sıcaklık kontrolü kullanılarak normal büyüme koşulları altında görüntüleme, fototoksik etkileri önemli ölçüde azaltabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, sosyal amip Dictyostelium discoideum'da sıcaklık kaynaklı protein agregasyonunu ve hücresel stres yanıtlarını incelemek için yeni bir görüntüleme metodolojisi sunmaktadır. Bu teknik, araştırmacıların ısı stresinin protein kalite kontrolü üzerindeki etkilerini gözlemlemesine olanak tanıyan hassas bir sıcaklık kontrolü sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Nörobilim
- Protein agregasyonu
Arka Plan
- Dictyostelium discoideum, stresle karşılaşıldığında verilen hücresel yanıtların incelenmesi için model bir organizma olarak kullanılır.
- Proteinlerin yanlış katlanmasını anlamak, çeşitli hastalıklar hakkında bilgi edinmek açısından kritik öneme sahiptir.
- Isı stresi, hücresel işlevi etkileyen protein agregasyonuna yol açabilir.
- Görüntüleme teknikleri, hücresel süreçlerin gerçek zamanlı gözlemi için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Isı stresinin neden olduğu hücresel pertürbasyonların gözlemlenmesi için bir yöntem geliştirmek.
- D. discoideum'daki ısı stres yanıt mekanizmalarını aydınlatmak.
- Stres koşulları altında protein kalite kontrolünün etkinliğini değerlendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Düşük floresanslı ortamda Dictyostelium hücrelerinin hazırlanması.
- Kontrollü sıcaklıklarda (23°C ve 30°C) görüntüleme.
- Hücresel yanıtların birkaç saat boyunca izlenmesi için zaman ayarlı görüntüleme.
- Protein agregasyonunu ve geri kazanımını nicelleştirmek için görüntü analizi.
Ana Sonuçlar
- Q103-GFP proteini, normal koşullar altında yaygın (diffüz) bir dağılım sergiledi.
- Isı stresi sırasında Q103-GFP, agregasyonu belirten noktasal yapılar oluşturdu.
- Stres sonrası agregat içeren hücre sayısının azalması, geri kazanımın gerçekleştiğini göstermektedir.
- Yöntem, protein agregasyonu ve çözünme dinamiklerini başarılı bir şekilde ortaya koydu.
Sonuçlar
- Görüntüleme tekniği, hücresel stres yanıtlarına dair bilgiler sağlar.
- Protein dinamiklerinin doğru gözlemlenmesi için sıcaklık kontrolü kritiktir.
- Bu metodoloji, hücresel stres araştırmalarının diğer alanlarına da uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Alaka
Dictyostelium discoideum üzerinde sıcaklık kontrollü canlı hücre görüntülemesi, stres altındaki protein kalite kontrol mekanizmalarının hassas bir şekilde sorgulanmasına olanak tanıyarak protein agregasyon yolları için erken aşama hedef doğrulamasını destekler. Bu yaklaşım, nörodejenerasyon ve proteostaz ile ilgili mekanistik çalışmalarda öngörü güvenini artırır. Yöntemin fototoksisiteyi azaltma ve dinamik protein agregasyonunu nicelleştirme yeteneği, keşif biyolojisinde portföy önceliklendirmesi için uygulanabilir içgörüler sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Validasyonu
- Canlı, strese yanıt veren bir modelde protein agregasyon dinamiklerinin doğrudan gözlemlenmesini sağlar.
- Isı kaynaklı proteotoksik strese karşı hücresel yanıtları nicelleştirerek mekanistik risk azaltma sürecini destekler.
- Agregasyon bozukluklarıyla ilgili protein kalite kontrol hedeflerinin fonksiyonel validasyonunu kolaylaştırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Protein agregasyonu ve çözünme olaylarının nicelleştirilmesi için valide edilmiş bir görüntüleme protokolü sunar.
- Fototoksisiteyi azaltarak, düşük ekspresyonlu proteinler için daha yüksek görüntüleme yoğunluklarına olanak tanır.
- Süreç sonrası tarama iş akışlarına uygun, tekrarlanabilir ve kantitatif okumaları destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Protein yanlış katlanması ve agregasyonuyla ilgili hastalık mekanizmalarıyla uyumludur.
- Keşif aşamasındaki mekanizmik çalışmalardan preklinik model geliştirmeye kadar süreklilik sağlar.
- Agregasyon hedefli terapötikler için riskten arındırılmış ilerleme kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu görüntüleme protokolü, erken dönem mekanistik çalışmalardan protein agregasyon hedeflerinin preklinik doğrulamasına kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre edilmiştir.
- Keşif Biyolojisi: Isı stresinin tetiklediği protein agregasyonunu nicelleştirerek proteostaz yollarını aydınlatır.
- Tarama: Analiz geliştirme süreci için tekrarlanabilir, kantitatif agregasyon metrikleri sunar.
- Analitik: Agregasyon olaylarının hücre düzeyindeki sayımlarını ve geri kazanım dinamiklerini sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Biyobelirteç uyumu için hastalıkla ilgili stres yanıtlarını modeller.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli protein kalite kontrol çalışmaları için standartlaştırılmış ve uyarlanabilir bir protokol sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Protein agregasyon yolakları için hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış görüntüleme ve analiz yoluyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Proteostaz üzerine kantitatif ve mekanistik veriler sağlayarak devam/durdur kararlarını bilgilendirir.
- Portföy Etkisi: Agregasyon hedefli programların riskle uyumlu önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Canlı hücre görüntüleme ve kantitatif görüntü analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Sıcaklık kontrollü mikroskopi ve uyumlu analiz yazılımı gereklidir.
- Görüntüleme parametreleri ve veri yorumlaması için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Protokol optimizasyonu ile agregasyona meyilli diğer protein modellerine uyarlanabilir.
- Yüksek hücre motilitesi ve fototoksisite hassasiyeti, dikkatli bir deneysel tasarım gerektirir.
