Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini
28 Eylül 2016
Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.
Bu yöntemin genel amacı, floresan aralıklı bir tahlil kullanarak zar proteinlerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu ölçmektir. Bu tekniğin ana avantajı, akış sitometrisi tahlillerinin tek bir deneyde büyük hacimli canlı hücreler üzerinde ölçülebilir uç noktalar sağlamasıdır. Bu tekniğin sonuçları, kardiyak ventriküler aritmilerin teşhisi ve tedavisine kadar uzanır, çünkü bu patolojiler genellikle kardiyak iyon kanallarının kaçakçılığında kusurlara neden olan genetik mutasyonlarla ilişkilidir.
Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, protein fonksiyonlarına zarar vermeyen ve konjuge antikorun varlığında güçlü bir floresan sinyali üreten epitop için uygun bir dışsal yerleştirme yeri belirlemek için mücadele ederler. Bu prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Benoite Bourdin olacak. Başlamak için, hücre içi C-terminalinde mCherry ile DNA yapılarını çift etiketleyin.
Ayrıca, zar proteinlerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu tahmin etmek için bir floresan antikoru kullanılarak ölçülebilen, ekstra hücresel bir bakan hemmaglutinin epitopunu eksprese edin. Daha sonra, %90 birleşmeye ulaşana kadar standart teknikler kullanarak bir TSA201 hücre plakası kültürleyin. Her numune için transfeksiyon reaktiflerini iki tüpte hazırlayın.
Dört mikrogram DNA ve 250 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı içeren bir 1.5 mililitre tüp ve 10 mikrolitre lipozom aracılı transfeksiyon reaktifi ve 250 mikrolitre serum indirgenmiş kültür ortamı içeren ikinci bir tüp hazırlayın. İki tüpü yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, birinci ve ikinci tüpün içeriğini nazikçe birleştirin ve lipozom DNA komplekslerini oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Kompleksleri kültürlenmiş hücrelere ekleyin ve kültür kabını hafifçe sallayın. Çanağı tekrar 37 santigrat dereceye ve 24 saat boyunca %5 karbondioksit atmosferinin altına yerleştirin. Transfeksiyon reaktifinin eklenmesinden 24 saat sonra, ortamı kültür kabından çıkarın ve hücreleri 400 mikrolitre önceden ısıtılmış Tripsin-EDTA ile dikkatlice yıkayın.
Ardından, 400 mikrolitre Tripsin-EDTA ekleyin ve hücrelerin tabaktan ayrılmasını sağlamak için tabağı beş dakika inkübe edin. Ayrıldıktan sonra, hücrelere penisilin veya streptomisin içermeyen bir mililitre soğuk kültür ortamı ekleyerek enzim sindirimini durdurun. Yüzeydeki tüm hücreleri yıkamak için ortamı plakanın üzerine dört ila beş kez nazikçe pipetleyin.
Daha sonra hücreleri steril 1,5 mililitrelik tüplerde toplayın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Sonraki adımlar için, buz gibi soğuk çözelti kullanın ve yüzey epitopunun içselleşmesini önlemek için hücreleri dört derecede tutun. Ayrıca, floresan sinyalinin foto-ağartılmasını sınırlamak için hücrelerin ışığa maruz kalmasını azaltın.
Ardından, hücreleri peletlemek için tüpleri santrifüjleyin. Ardından, elde edilen süpernatanı dikkatlice aspire edin ve atın. Bir mililitre PBS kullanarak tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için peleti yeniden süspanse edin.
Ardından, tüpleri kısaca santrifüjleyin. Kültür ortamını tamamen çıkarmak için hücreleri bir kez daha pelet haline getirin ve yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre peletini 600 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin.
Hücre konsantrasyonunu ölçün ve mililitrede en az üç milyon hücreye ayarlayın. Ardından, hücreleri yeni 1,5 mililitrelik tüplere bölün. Spesifik boyamayı spesifik olmayan boyamadan ayırt etmek ve ekstra hücresel boyamayı ve ayrıca hücre içi boyamayı ayırt etmek için uygun kontrolleri eklediğinizden emin olun.
İzotop kontrol antikoru, arka plan boyama seviyesinin değerlendirilmesine yardımcı olacaktır ve birincil antikor, uğurlu izotop ve florofor ile eşleşmelidir. Kontrol izotop antikorunun ve floresan antikorunun aynı konsantrasyonda kullanılması önemlidir. Membran proteinlerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu tahmin etmek için, önce bir floresan ışık konjuge antikor kullanarak sadece ekstra hücresel bakan HA epitopunu etiketleyin.
Daha sonra, tüpe mililitre başına beş mikrogramda FITC konjuge monoklonal anti-HA antikoru ekleyin. Hücreleri kısa bir süre vorteksleyin ve ardından karanlıkta bir külbütör platformunda kuluçkaya yatırın. Hücreleri karanlıktan çıkarın ve 900 mikrolitre PBS ekleyin.
Daha sonra hücreleri peletlemek ve süpernatanı aspire etmek için tüpü santrifüjleyin. Daha sonra, peleti bir mililitre PBS'de yeniden süspanse ederek ve hücreleri kısaca girdaplayarak hücreleri yıkayın. Ardından, hücreleri tekrar peletlemek için santrifüj adımını tekrarlayın.
Herhangi bir bağlanmamış antikoru çıkarmak için bu yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve tek hücreli süspansiyonu beş mililitrelik bir akış sitometri tüpüne aktarın. Numune çalıştırılana kadar hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede tutun.
Toplam proteinin hücre içi ekspresyonunu tahmin etmek için, geçirgen hücreleri bir sonraki etiketleyin. Bu, hücre dışı etiketlemeye benzer bir protokol kullanılarak, ancak saponin bazlı bir hücre geçirgenleştirme tamponunun eklenmesiyle gerçekleştirilir. Hücreleri peletleyin, süpernatanı atın ve hücreleri doğrudan hazırlanan stoktan 100 mikrolitre fiksasyon geçirgenleştirme çözeltisinde yeniden süspanse edin.
Hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, 100 mikrolitre taze hazırlanmış geçirgenlik yıkama tamponu ekleyin ve hücreleri kısaca girdaplayın. Ardından, hücreleri pelet haline getirin ve geçirgenlik yıkama tamponunu kullanarak iki kez daha yıkayın.
Daha sonra, FITC konjuge monoklonal anti HA antikorunu mililitre başına 5 mikrogram ve 100 mikrolitre geçirgenlik yıkama tamponu ekleyin. Kısaca hücreleri girdaplayın ve hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 100 mikrolitre geçirgenlik yıkama tamponu ekleyin.
Hücreleri pelet haline getirin ve daha önce gösterildiği gibi aynı tamponun 100 mikrolitresinde üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve tek hücreli süspansiyonu beş mililitrelik bir akış sitometri tüpüne aktarın. Geçirgen olmayan ve geçirgen hücreleri aynı gün akış sitometresinden geçirin.
Başlamak için akış sitometrisi analiz yazılımını başlatın ve akış sitometrisi sırasında oluşturulan fcs dosyalarını içe aktarın. İlk örneğe tıklayın ve yan saçılma ve ileri saçılma grafiğinde geçit işlemini başlatın. Ardından, kalıntıları, ölü hücreleri veya agregaları ortadan kaldırmak için canlı hücrelerin etrafındaki elips simgesini kullanarak P1 kapısını çizin.
Ardından, mCherry'nin FITC floresan yoğunluğuna karşı tüp parametresi kontur grafiğini çizin. P2 kapısını FITC ve mCherry pozitif hücrelerin etrafına ve P3 kapısını floresan negatif hücre popülasyonunun etrafına yerleştirin. Ardından, P2 ve P3 kapılarını seçin ve orijinal çalışma alanı penceresindeki istatistik ekle simgesine tıklayın.
Sayıma tıklayın ve ardından ortalamaya tıklayın. Son olarak, gates parametrelerini ve istatistiklerini sitometre tarafından incelenen tüm örneklere uygulayın. Bu protokol, TSA201 hücrelerinde CaV Alfa 2 Delta 1'in toplam ve hücre yüzeyi ekspresyonu üzerindeki N-glikozilasyonun rolünü karakterize etmek için kullanıldı.
Hücre yüzeyine erişmek için protein ekspresyonu HA, dört bölgede, 16 bölgede veya hiç bölgede bozulmuş N-glikosilasyon bölgeleri olan geçirgen olmayan hücreler üzerinde ölçüldü. FITC seviyeleri vahşi tipte güçlüydü ve N-glikozilasyon hücrelerine sahip hücreler dört yerde bozuldu, ancak 16 lokasyonu bozulmuş hücrelerde sadece arka plan seviyeleri bulundu. Geçirgen hücreler için, FITC floresansı tüm koşullar için artmıştır, bu da tüm transfekte, HA etiketli, CaV Alpha 2 Delta 1 proteinlerinin boyandığını ve anti HA FITC antikoru tarafından tespit edildiğini gösterir.
Ek olarak, mCherry floresan seviyeleri, geçirgen ve geçirgen olmayan hücreler için benzerdi, bu da geçirgenliğin bağıl mCherry sinyalini değiştirmediğini gösterir. Hücre geçirgenliğinden sonra yapılan tahliller, 16 lokasyonu bozulmuş hücreler için toplam protein ekspresyonunun da önemli ölçüde azaldığını gösterdi, ister geçirgenleştirilmiş hücrelerdeki FITC floresansından ister geçirgen olmayan ve geçirgen hücrelerde ölçülen kurucu mCherry floresansından çıkarılsın. Bu prosedüre ek olarak, iyon kanallarının ekspresyonunu ve işlevini ilişkilendirmek için ekstra fizyolojik kayıtlar yapılabilir.
Bu teknik aynı zamanda tıp alanındaki araştırmacıların, genetik mutasyonların, posttranslasyonel modifikasyonların, mikroRNA'ların, küçük GTPazların ve rekombinant veya doğal hücrelerde eksprese edilen zar proteinlerinin kaçakçılığında şaperonların rolünü incelemelerinin yolunu açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, rekombinant hücrelerde DNA transfeksiyonunun nasıl yapılacağını, NTAC ve geçirgen hücrelerin nasıl boyanacağını ve numuneler üzerinde veri analizinin nasıl yapılacağını iyi anlamalısınız. Canlı hücrelerle çalışmanın, transfiksasyon için helaminal sıvıda çalışmak ve kimyasalları tutarken eldiven giymek gibi önlemler gerektirdiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, membran proteinlerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu akış sitometri analizleri kullanarak nicelleştirmek için bir yöntem sunmaktadır. Teknik, özellikle iyon kanalı trafiğini etkileyen genetik mutasyonlarla bağlantılı kardiyak aritmileri incelemek için uygundur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kardiyak aritmiler
- Iyon kanalı biyolojisi
- Akış sitometri teknikleri
Arka Plan
- Kalitimsel kardiyak aritmiler genellikle iyon kanallarındaki mutasyonlardan kaynaklanır.
- Bu mutasyonlar, iyon kanallarının yüzey teslimini bozabilir.
- Akış sitometri, büyük hacimlerde canlı hücre analizini sağlar.
- Epitop etiketleme için uygun ekleme bölgelerinin tanımlanması, başarılı deneyler için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Membrana protein ekspresyonunu nicelleştirmek için bir yöntem geliştirmek.
- Kardiyak ventriküler aritmilerin tanı ve tedavisini kolaylaştırmak.
- Iyon kanalı trafiği defektlerinin anlaşılmasına katkıda bulunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Nicelleştirme için akış sitometri analizlerinin kullanımı.
- DNA yapılarının intraselüler C-terminusunda mCherry ile çift etiketleme.
- TsA-201 hücrelerinde hücre yüzeyi protein ekspresyonunun değerlendirilmesi.
- Bir araştırma asistanı tarafından prosedürün gösterimi.
Ana Sonuçlar
- Toplam ve hücre yüzeyi protein ekspresyonunun başarılı nicelleştirilmesi.
- Etkili epitop ekleme bölgelerinin tanımlanması.
- Yöntemin canlı hücre analizi için uygulanabilirliğinin gösterimi.
- Genetik mutasyonlar ve iyon kanalı fonksiyonu arasındaki ilişkiye dair görüşler.
Sonuçlar
- Yöntem, membran proteinlerini incelemek için güvenilir bir yaklaşım sağlar.
- Kardiyak aritmileri anlamak için potansiyel etkileri vardır.
- Gelecekteki uygulamalar, etkilenen bireyler için terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of membrane protein expression is critical for de-risking ion channel targets in cardiac arrhythmia drug discovery. This flow cytometry method enables high-throughput, reproducible assessment of total and cell surface expression in live cells, supporting target validation and mechanistic de-risking. It provides quantitative endpoints that improve predictive confidence in early discovery by linking genetic variants to trafficking defects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying relative cell surface versus total expression of recombinant ion channels.
- Operational Value: Supports biological de-risking through objective, flow-based measurement of trafficking efficiency in tsA-201 cells.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying constructs with preserved surface expression despite genetic or posttranslational modifications.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts (mCherry for total, HA-FITC for surface) suitable for assay optimization.
- Operational Value: Delivers reproducible, large-volume analysis (10⁴–10⁶ cells) with minimal variability, enabling robust compound or mutant screening.
- Assay Readiness: Establishes a scalable, two-color flow cytometry platform adaptable to ion pumps, transporters, and other multi-spanning transmembrane proteins.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase expression data to functional outcomes by correlating surface levels with electrophysiological recordings.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes trafficking defects from gating alterations, clarifying disease-relevant mechanisms in ion channelopathies.
- Preclinical Model Support: Provides a disease-relevant system for evaluating how mutations affect membrane residency of cardiac L-type calcium channels.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, offering quantitative expression data that informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the variable of membrane trafficking from channel function through dual-tag quantification.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility, critical for evaluating large libraries of ion channel variants or modulators.
- Analytics: Delivers mean fluorescence intensity and percentage-positive readouts that allow direct comparison of expression conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing expression data that can be linked to functional assays in native or disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable flow cytometry workflow for membrane protein quantification across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by reducing ambiguity between expression and function.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across teams through a defined, antibody-based staining protocol.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of trafficking-defective variants, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying the proportion of expressed protein reaching the cell surface.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning to design C-terminally tagged constructs with extracellular epitope insertion.
- Dependent on flow cytometry instrumentation capable of detecting mCherry and FITC fluorescence with appropriate compensation.
- Necessitates standardization of antibody titration and permeabilization protocols across users to ensure consistent surface versus total signal discrimination.
- Involves adaptation considerations when extending to other membrane proteins, particularly regarding epitope accessibility and transfection efficiency.
- Limited by the need to validate that epitope tagging does not disrupt protein folding or function, requiring functional controls.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:08
Liposome Mediated Transient Transfection
2:35
Preparing Cell Samples for Staining
4:51
Extracellular Staining of Cell Samples
6:10
Intracellular Staining of Cell Samples
7:51
Data Analysis
8:55
Results: Simultaneaous Mutations of N-glycosylation Sites Disrupted Cell Surface Expression of CaVα2δ1
10:25
Conclusion
