Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Bu yöntemin genel amacı, floresan işaretli bir assay kullanarak membran proteinlerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu nicelendirmektir. Bu tekniğin temel avantajı, akış sitometrisi assay'lerinin tek bir deneyde büyük miktardaki canlı hücreler üzerinde nicelendirilebilir son noktalar sağlamasıdır. Bu tekniğin etkileri, kardiyak ventriküler aritmilerin teşhis ve tedavisine kadar uzanmaktadır; çünkü bu patolojiler genellikle kardiyak iyon kanallarının trafiğinde defektlere yol açan genetik mutasyonlarla ilişkilidir.

Genellikle bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, protein fonksiyonuna zarar vermeyen ve konjuge antikor varlığında güçlü bir floresan sinyal üreten, epitop için uygun bir ekstrorsal insersiyon bölgesi belirlemekte zorlanırlar. Bu prosedürü, laboratuvarımdan araştırma asistanı Benoite Bourdin uygulamalı olarak gösterecek. Başlamak için, DNA konstrüktlarını hücre içi C-terminusunda mCherry ile çift olarak etiketleyin.

Ayrıca, membran proteinlerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu tahmin etmek için floresan antikor kullanılarak ölçülebilen, hücre dışına bakan ek bir hemaglutinin epitopu eksprese edin. Ardından, TSA201 hücrelerini standart teknikler kullanarak %90 konfluense ulaşana kadar bir plakta kültüre edin. Her örnek için transfeksiyon reaktiflerini iki tüpte hazırlayın.

Birinci 1,5 mililitrelik tüpü dört mikrogram DNA ve 250 mikrolitre serumu azaltılmış besiyeri ile, ikinci tüpü ise 10 mikrolitre lipozom aracılı transfeksiyon reaktifi ve 250 mikrolitre serumu azaltılmış kültür besiyeri ile hazırlayın. İki tüpü nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Ardından, birinci ve ikinci tüpün içeriklerini nazikçe birleştirin ve lipozom DNA komplekslerini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.

Kompleksleri kültüre edilmiş hücrelere ekleyin ve kültür kabını hafifçe sallayın. Kabı 24 saat boyunca 37 °C'de ve %5 karbondioksit atmosferi altında inkübe edin. Transfeksiyon reaktifinin eklenmesinden 24 saat sonra, ortamı kültür kabından uzaklaştırın ve hücreleri 400 µL önceden ısıtılmış Trypsin-EDTA ile dikkatlice yıkayın.

Ardından, 400 µL Trypsin-EDTA ekleyin ve hücrelerin kapla bağının kopmasını sağlamak için kabı beş dakika boyunca inkübe edin. Hücreler ayrıldıktan sonra, hücrelere penisilin veya streptomisin içermeyen bir mililitre soğuk kültür ortamı ekleyerek enzim sindirimini durdurun. Yüzeydeki tüm hücreleri yıkamak için ortamı plaka üzerine dört ila beş kez nazikçe pipetleyin.

Ardından, hücreleri steril 1,5 mililitrelik tüplere toplayın ve derhal buza yerleştirin. Sonraki adımlar için buz soğukluğunda solüsyon kullanın ve yüzey epitopunun içselleşmesini önlemek için hücreleri dört derecede tutun. Ayrıca, floresan sinyalin fotobeyazlamasını sınırlandırmak için hücrelerin ışığa maruz kalmasını azaltın.

Ardından, hücreleri çöktürmek için tüpleri santrifüjleyin. Daha sonra, oluşan süpernatantı dikkatlice aspire ederek atın. Tek hücre süspansiyonu hazırlamak için çökeleği bir mililitre PBS kullanarak yeniden süspanse edin.

Ardından, tüpleri kısa süreliğine santrifüjleyin. Kültür ortamını tamamen uzaklaştırmak için hücreleri bir kez daha çöktürün ve yeniden süspanse edin. Sonrasında, hücre peletini 600 microliters PBS içinde yeniden süspanse edin.

Hücre konsantrasyonunu ölçün ve mililitre başına en az üç milyon hücre olacak şekilde ayarlayın. Ardından, hücreleri yeni 1,5 mililitrelik tüplere bölün. Spesifik boyamayı spesifik olmayan boyamadan ayırt etmek için ve ayrıca hücre dışı ve hücre içi boyamalar için uygun kontrolleri eklediğinizden emin olun.

İzotop kontrol antikoru, arka plan boyama seviyesini değerlendirmeye yardımcı olacaktır ve primer antikorla izotop ve florofor açısından eşleşmelidir. Kontrol izotop antikoru ile floresan antikoru aynı konsantrasyonda kullanmak önemlidir. Membran proteinlerinin hücre yüzeyi ekspresyonunu tahmin etmek için, önce yalnızca hücre dışına bakan HA epitopunu floresan ışığa konjuge bir antikor kullanarak işaretleyin.

Ardından, tüpe mililitre başına beş mikrogram olacak şekilde FITC-konjuge monoklonal anti-HA antikoru ekleyin. Hücreleri kısa süre vorteksleyin ve ardından karanlıkta bir sallama platformunda inkübe edin. Hücreleri karanlıktan çıkarın ve 900 microliters PBS ekleyin.

Ardından, hücreleri çöktürmek için tüpü santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin. Daha sonra, çökeleği bir mililitre PBS içinde yeniden süspandirerek ve hücreleri kısa süre vorteksleyerek hücreleri yıkayın. Sonrasında, hücreleri tekrar çöktürmek için santrifüj adımını tekrarlayın.

Bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için bu yıkama adımını toplam üç kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 500 µL PBS içinde yeniden süspanse edin ve tek hücre süspansiyonunu beş mililitrelik bir akış sitometrisi tüpüne aktarın. Örnek analiz edilene kadar hücreleri dört °C'de, karanlıkta tutun.

Toplam proteinin hücre içi ekspresyonunu tahmin etmek için, ardından permeabilize edilmiş hücreleri işaretleyin. Bu işlem, hücre permeabilizasyonu için saponin bazlı bir tampon eklenerek, hücre dışı işaretlemeye benzer bir protokol kullanılarak gerçekleştirilir. Hücreleri çöktürün, süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri, hazırlanan stoktan doğrudan 100 microliter fiksasyon permeabilizasyon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.

Hücreleri karanlıkta, dört derece Celsius'ta 20 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, 100 µL taze hazırlanmış permeabilizasyon yıkama tamponu ekleyin ve hücreleri kısa süreliğine vorteksleyin. Sonrasında, hücreleri pelletleyin ve permeabilizasyon yıkama tamponu kullanarak iki kez daha yıkayın.

Ardından, 5 µg/mL konsantrasyonda FITC-konjuge monoklonal anti-HA antikoru ve 100 µL permeabilizasyon yıkama tamponu ekleyin. Hücreleri kısa süreli vorteksleyin ve karanlıkta, 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında, 100 µL permeabilizasyon yıkama tamponu ekleyin.

Hücreleri çöktürün ve daha önce gösterilenle aynı tampon çözeltinin 100 microlitersi ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücreleri 500 microliters PBS içinde yeniden süspande edin ve tek hücre süspansiyonunu beş mililitrelik bir akış sitometrisi tüpüne aktarın. Permeabilize edilmemiş ve permeabilize edilmiş hücreleri aynı gün akış sitometrisinden geçirin.

Başlamak için, akış sitometrisi analiz yazılımını çalıştırın ve akış sitometrisi sırasında oluşturulan fcs dosyalarını içeri aktarın. İlk örneğe tıklayın ve yan saçılma (side scatter) ile ileri saçılma (forward scatter) grafiğinde kapılama (gating) işlemine başlayın. Ardından, döküntüleri, ölü hücreleri veya agregatları elemek için canlı hücrelerin etrafına elips simgesini kullanarak P1 kapısını çizin.

Ardından, mCherry'ye karşı FITC floresan yoğunluğunun tüp parametresi kontur grafiğini çizin. P2 kapısını FITC ve mCherry pozitif hücrelerin etrafına, P3 kapısını ise floresan negatif hücre popülasyonunun etrafına ayarlayın. Sonra, P2 ve P3 kapılarını seçin ve orijinal çalışma alanı penceresindeki istatistik ekleme simgesine tıklayın.

Sayıya (count) ve ardından ortalamaya (mean) tıklayın. Son olarak, kapı parametrelerini ve istatistikleri sitometre ile incelenen tüm örneklere uygulayın. Bu protokol, TSA201 hücrelerinde CaV Alpha 2 Delta 1'in toplam ve hücre yüzeyi ekspresyonu üzerinde N-glikozilasyonun rolünü karakterize etmek için kullanılmıştır.

Hücre yüzeyi protein ekspresyonuna erişmek için, dört bölgede, 16 bölgede veya hiçbir bölgede N-glikozilasyon bölgeleri bozulmamış non-permeabilize hücrelerde HA ölçüldü. FITC seviyeleri vahşi tipte ve dört bölgede N-glikozilasyon bölgeleri bozulmuş hücrelerde güçlüydü, ancak 16 bölgesi bozulmuş hücrelerde yalnızca arka plan seviyeleri saptandı. Permebilize hücreler için FITC floresansı tüm koşullarda arttı; bu durum, tüm transfekte edilmiş, HA-etiketli CaV Alpha 2 Delta 1 proteinlerinin boyandığını ve anti HA FITC antikoru ile tespit edildiğini göstermektedir.

Ayrıca, mCherry floresan seviyeleri permeabilize edilmiş ve edilmemiş hücreler için benzerdi; bu durum, permeabilizasyonun göreceli mCherry sinyalini değiştirmediğini göstermektedir. Hücre permeabilizasyonundan sonra gerçekleştirilen analizler, 16 lokasyonu bozulmuş hücreler için toplam protein ekspresyonunun da, ister permeabilize edilmiş hücrelerdeki FITC floresansından ister permeabilize edilmiş ve edilmemiş hücrelerde ölçülen konstitütif mCherry floresansından çıkarılsın, önemli ölçüde azaldığını göstermiştir. Bu prosedüre ek olarak, iyon kanallarının ekspresyonu ve fonksiyonunu ilişkilendirmek amacıyla ekstra fizyolojik kayıtlar gerçekleştirilebilir.

Bu teknik aynı zamanda tıp alanındaki araştırmacıların; genetik mutasyonların,leter-translasyonel modifikasyonların, mikroRNA'ların, küçük GTPazların etkisini ve şaperonların, rekombinant veya doğal hücrelerde eksprese edilen membran proteinlerinin taşınmasındaki rolünü incelemelerine olanak sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, rekombinant hücrelerde DNA transfeksiyonunun nasıl yapılacağı, NTAC ve permeabilize edilmiş hücrelerin nasıl boyanacağı ve örnekler üzerinde veri analizinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız. Canlı hücrelerle çalışmanın, transfeksiyon için laminer akışlı kabin içerisinde çalışma ve kimyasallarla uğraşırken eldiven giyme gibi önlemler gerektirdiğini unutmayın.