Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi

Zebra balığı, diyetle alınan lipid işleme ve metabolik hastalıkların değerli bir modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Lipid açısından zengin larva yemlerinin protokolleri, diyet floresan lipid analoglarının canlı görüntülenmesi ve gıda alımının miktarının belirlenmesi açıklanmıştır. Bu teknikler çeşitli tarama, görüntüleme ve hipoteze dayalı sorgulama tekniklerine uygulanabilir.

Bu deneysel protokolün genel amacı, larvaları görsel lipid alım dinamiklerine monte etmek ve diyetle lipit alımını ölçmek için bir floresan lipid analoğu ile çivilenebilen lipid açısından zengin bir öğün olan larva Zebra balığını beslemektir. Bu yöntem, diyet lipitlerinin nasıl metabolize edildiği ve gıda alımının nasıl düzenlendiği gibi metabolizma ve gastrointestinal biyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, floresan lipid analoglarının diyet lipozomlarında verimli bir şekilde verilebilmesidir.

Zebra balığının optik berraklığı, mikroskobun hücre altı lipid işlemesini ortaya çıkarmasını sağlar. Başlamak için, mikrolitre başına 0.5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon için iki mililitre% 100 kloroformda bir miligram toz floresan lipid analoğunu askıya alın. Analogu, bir Teflon conta içeren çözücü ile uyumlu vidalı kapaklı kehribar cam tüplere ayırın.

Bu stokları dondurucuda saklayın. 1,5 mililitrelik bir tüpe mikrolitre başına 0,5 mikrogram floresan lipid analog stoğunun 10,4 mikrolitresini ekleyin ve lipitin tüpten dışarı üflenmemesine dikkat ederek bir nitrojen akışı altında kurutun. Kurutulmuş lipidi, tüpün kenarlarından aşağıya doğru bir akış pipetleyerek beş mikrolitre% 100 etanol içinde hemen yeniden süspanse edin.

Daha sonra 95 mikrolitre embriyo besiyeri ekleyin ve karışım homojen görünene kadar yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Tüpü ışıktan koruyun ve ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde saklayın. Bir floresan kolesterol lipozom çözeltisi yapmak için, yumurta sarısı emülsiyonuna eklendiğinde mililitre başına 2.5 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1.5 mililitrelik bir tüpe yeterli miktarda floresan kolesterol analog stoğu ekleyin.

Kolesterol stoğunu daha önce olduğu gibi bir azot akışı altında kurutun. Floresan kolesterol analogunu 15 mikrolitre oda sıcaklığında% 100 etanol içinde tüpün yanından aşağı doğru bir akış pipetleyerek hemen yeniden süspanse edin. Ve 85 mikrolitre% 1 yağ asidi içermeyen BSA ve su ile karıştırın.

Lipidin yemde homojen dağılımını ve hatta tüm larvalar için kullanılabilirliği sağlamak için floresan lipid analoğunun yumurta sarısı emülsiyonuna eklenmeden önce etanol ve embriyo ortamında tamamen çözündürülmesi esastır. Tüpü folyo ile ışıktan koruyun ve buz üzerinde saklayın. Besleme çözeltisini yapmak için, 50 mililitrelik konik bir tüpe 19 mililitre embriyo ortamı ekleyin ve ardından bir mililitrelik yumurta sarısı alikotu ekleyin.

Homojen bir emülsiyon elde etmek için karışımı bir ila iki dakika vorteksleyin. Protein konglomeralarını çıkarmak için karışımı ince bir süzgeçten geçirin ve 50 mililitrelik taze bir konik tüpe toplayın. Daha sonra, yumurta karışımını beş kez, bir saniye açık, bir saniye kapalı, altı watt'ta 1/4 inç konik mikro uç ile sonikleştirin.

Sonikasyon programını dört kez daha tekrarlayın. Bu, homojenliği korumak için kullanılana kadar sürekli olarak sallanması gereken lipozomları oluşturur. Sonikasyondan hemen sonra lipozom karışımının beş mililitresine uygun miktarda floresan lipid analogları ekleyin.

Floresan lipid analoglarını lipozomlara dahil etmek için 30 saniye boyunca yüksek hızda girdap. Tüpü folyoya sararak karışımı ışıktan koruyun ve külbütöre geri koyun. Bir besleme kabına elli larva ekleyin, embriyo ortamını çıkarın ve 5 mililitre yem ekleyin.

Yiyecek alımını teşvik etmek için, larvaları kuluçkaya yatırılmış bir külbütörde hafifçe sallayın ve floresan lipid analogları kullanılıyorsa ışıktan koruyun. Beslenme süresinin sonunda, larvaları beş mililitre embriyo ortamında üç kez yıkayın. Larvaları hareketsiz hale getirmek için, buzun üzerine metal bir blok yerleştirin, aşırı soğumayı önlemek için bir dokuyu kaplayın ve ardından larvaları soğuması için üstüne embriyo ortamının kabına yerleştirin.

Larvaları diseksiyon mikroskobu altında 10x'te gözlemleyin ve hangilerinin lipozom beslemesini tükettiğini belirleyin. Lipozomları tüketen larvalar kararmış bir bağırsağa sahip olacaktır. Kararmış bir bağırsak olup olmadığını kontrol ederek bir larvanın beslenip beslenmediğini belirlemek çok önemlidir.

Tipik olarak, larvaların yüzde biri ila beşi yemek yemer ve tanımlanıp çıkarılmazsa deneysel sonuçları karıştırabilir. Ters objektifli uzun süreli, yüksek büyütmeli görüntüleme için, önce larvaları buz üzerinde metal bir blok üzerinde soğutun. Bir larvayı cam tabanlı bir tabağa aktarın ve embriyo ortamını bir doku ile fitilleyerek çıkarın.

Larvaların üzerine 42 santigrat derece düşük eriyik %1.2 agarozdan bir damla damlatın ve hemen bir poker ile konumlandırın. Çanağı soğuk bloktan çıkarın ve agarozun iki ila üç dakika oturmasına izin verin. Son olarak, agarozu kaplamak ve kurumayı önlemek için yeterli hacimde taze embriyo ortamı ekleyin.

Numuneler artık görüntüleme için hazırdır. Bir lipozom beslemesinin sonunda, 1.5 mililitrelik bir tüpte en az 10 yıkanmış larva toplayın. Embriyo ortamını çıkarın ve ardından larvaları dondurun.

Kontrol olarak 10 beslenmemiş larva ile ayrı bir tüpte tekrarlayın. Numuneyi buz üzerinde tutarak, her tüpe 100 mikrolitre homojenizasyon tamponu ekleyin ve ardından bir mikro uçlu sonikatör ile homojenize edin. Dokuyu 13 mililitrelik bir kültür tüpüne aktarın.

Her homojenizasyon tamponu bulamacına metanole 375 mikrolitre bir ila iki kloroform ekleyin. 30 ila 60 saniye girdap yapın ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 125 mikrolitre daha kloroform ekleyin ve 30 saniye boyunca girdap yapın.

Daha sonra, 125 mikrolitre 200 milimolar TRIS pH 7.5 ekleyin, 30 saniye girdap yapın ve ardından ışıktan korunarak beş dakika boyunca 2000 kez g'de santrifüjleyin. Ayrı fazları bozmamak için numuneleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Temiz bir cam pipet kullanarak, alt organik fazı toplayın ve 13 mililitrelik temiz bir cam tüpe aktarın.

Üst sulu veya orta larva kalıntı fazlarından herhangi birini aktarmaktan dikkatlice kaçının ve bunları atın. Organik fazı vakum altında 0.12 atmosfer basıncında kurutun, ışıktan korurken, sıvı buharlaştıktan sonra durmaya dikkat edin. Tek bir numuneyi 10 mikrolitrelik iki ila bir kloroformda metanole yeniden süspanse edin ve tüm numune hacmini kanallı, ince tabakalı bir kromatografi plakasına yerleştirin.

Kalan örneklerle tekrarlayın, eşit aralıklarla lekeleyin. Son olarak, plakayı bir floresan plaka okuyucu ile tarayın. Deneysel koşullar altında bir rocker'da beslenen larvaların incelenmesi, yumurta sarısı emülsiyonunu tüketen balıklara özgü koyulaşmış bağırsakları gösterir.

Beslenmemiş larvalar genellikle açık bağırsaklara sahiptir, bu nedenle beslenme döneminde diyet formülünü tüketmeyenler kolayca ayırt edilir. Floresan lipid analoğu ile beslenen bir larva, bu diyet lipidinin taşınmasını ve birikimini görselleştirir. Burada, floresan sinyali, sekiz saatlik beslenmeden sonra sindirim organları boyunca görülür.

Çeşitli lipid analogları, kompleks lipidlere diferansiyel olarak metabolize edildikleri için benzersiz hücresel yapı kümelerine dahil edilir ve böylece görselleştirilir. Burada, Floresan-C16 ve C12 analogları lipid damlacıklarını etiketler. Floresan-C5, karaciğer ve pankreas kanallarını, lipid damlacıklarını, hücresel zarları ve arteriyel ağları etiketler.

Ve Floresan-C2 analogu, hepatik ve pankreas kanallarını ve hücresel zarları etiketler. Larva gıda alım testleri, Apolipoprotein A4B1'i aşırı eksprese eden transgenik larvalara karşı vahşi tip larvaların beslenmesini incelemek için kullanıldı ve dört saatten fazla beslemede transgenik larvaların vahşi tipten daha az yediğini gösterdi. Üremeler normalize edilmiş, eşleştirilmiş, beslenmemiş kontrol larvaları kullanılmıştır.

Beslenmeyi takiben Apo A4'ü aşırı eksprese eden yabani tip ve transgenik larvaların floresansının ölçülmesi, yabani tipe kıyasla transgenik larvalar tarafından yutulmasının önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Ustalaştıktan sonra, yumurta sarısı floresan lipid analog beslemesi yaklaşık 15 dakika içinde hazırlanabilir. Gıda alımı, yaklaşık dört saat içinde 10 ila 12 havuzlanmış numune arasında ölçülebilir.

Bu prosedürü denerken, larvaları hatalı biçimlendirilmiş bir çene, az gelişmiş bir bağırsak veya azalmış hareketlilik gibi gıda alımını bozabilecek gelişimsel kusurlar açısından taramayı unutmamak önemlidir. Farmasötik tedaviler veya genom mühendisliği gibi yöntemler, spesifik proteinlerin ve hücre sinyal yollarının gıda alımını ve lipid metabolizmasını nasıl düzenlediği gibi ek soruları yanıtlamak için bu deneysel protokole dahil edilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, gastrointestinal fizyoloji ve hücre biyolojisi alanlarındaki araştırmacıların larva Zebra balıklarında diyetle lipit taşınmasını ve birikimini görselleştirmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, lipit açısından zengin bir larva Zebra balığı yeminin nasıl hazırlanacağını, larvaları gıda alımı için nasıl tarayacağınızı, larvaları kısa ve uzun süreli görüntüleme için nasıl monte edeceğinizi ve gıda alımını nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bir sonikatör ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu işlem yapılırken kulak koruması takılmalıdır.