Name: Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Keşfedin lipid açısından zengin yem hazırlama ve canlı görüntüleme yöntemlerini Danio rerio larvalarında. Bu teknik metabolizma ve gastrointestinal biyoloji araştırmalarında diyetal lipit alımını nicelendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, görüntüler için Meng-Chieh Shen'e, el yazması hakkında yararlı yorumlar sağladığı için Jennifer Anderson'a ve bu tekniklerin geliştirilmesine katkılarından dolayı Farber laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. Bu çalışma NIDDK-NIH ödül RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (Zebra Balığı Fonksiyonel Genomik Konsorsiyumu: PI Stephen Ekker ve Co-PI S.A.F) ve F32DK096786 (JPO) tarafından finanse edilmiştir. Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. G. Harold ve Leila Y. Mathers Yardım Vakfı tarafından S.A.F laboratuvarına ve Carnegie Bilim Enstitüsü bağışına ek destek sağlandı.

Bu protokoller Bilim Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Carnegie Institution (protokol no. 139) tarafından onaylanmıştır. 1. Hayvan hazırlanması <ol><li> 14 saat 28 ° C&#39;de yetişkin ve larvaları korumak: 10 saat aydınlık: karanlık döngüsü. Kabuk serbest Artemia (decapsulated olmayan taramalarla, 14 dpf&#39;e başlayarak) ve ticari mikropelletler ile günde iki kez yetişkin besleyin. </li><li> Bu protokoller AB kökenli doğal yumurtlama tarafından toplanan 6-7 dpf larvaları kullanımı için optimize edilmiştir. Protokoller diğer yaştan ve her kökenden larvalar için modifiye edilebilir. eksojen yiyecek önce 6 dpf vermeyin. </li><li> Embriyo medya Tricaine (EM) ile larva, oda sıcaklığında (RT) (4 mg, 100 ml EM başına / ml Tricaine 4.2 mi) anestezisi. </li></ol> Lipid zengin Yumurta Sarısı Feed 2. Hazırlık <ol><li> Hazırlayın ve tavuk yumurta sarılarını saklayın. 12 tavuk yumurtası sarısı ve beyaz ayırın. , Kısım 1 mi 1.5 içinde sarısı Havuz1 yıla kadar -80 ° C up ml tüpler ve mağaza (12 sarısı ~ 80 alikotları yapacaktır). beyazlar, mağaza havuz ve lipid-fakir, proteince zengin yem olarak kullanmak. </li><li> İstenirse Hazırlama Floresan bir lipid analoğu (ler) Yumurta sarısı beslemesine eklenmesini sağlar. <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, opak cam tüplerde, kısım (aşağıdaki nota çözücüler tartışmaya bakınız) / ml 0.1 ug% 100 etanol veya% 100 kloroform içinde alınan, toz haline getirilmiş Floresan bir lipid analoğu Askıya parafilm ile kaplayın ve saklayın. Nedeniyle organik çözücü, hızlı buharlaştırma, uzun süreli depolama için ~ 400 ul daha az kısım birimleri kullanmayın. Not: bir lipid analoğu olan, etanol içinde süspanse edildiği takdirde, kloroform fazla N2 altında daha hızlı kurur, bir lipid analoğu olan büyük miktarlarda kullanılır. bir lipid analoğu olan, etanol içinde süspanse edilir ise, adım 2.2.4 lipozom besleme eklemeden önce kurutuldu ve yeniden süspansiyon haline olmak zorunda değildir, ancak toplam etanol konsantrasyonu 0 geçmemelidir.Lipozom besleme içinde% 1 etanol, potansiyel olarak karıştırıcı fizyolojik etkilerini önlemek için. </li><li> Floresan yağlı asit analoglan için: EM 20 ml% 5 yumurta şansı emülsiyonun toplam hacmi hazırlayın. Bu kaynaktan canlı konfokal görüntüleme ve gıda alımı deneylerinde ya da 1 ug / ml 6.4 uM 4,4-difloro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indasen bir son konsantrasyon (BODIPY Cı 16) 5 ml lik kısımlar halinde hazırlanması stereomikroskop görüntüleme için BODIPY C12. 1.5 ml&#39;lik plastik tüp içine Floresan bir lipid analoğu istenilen miktarda aktarın. Tüpün dışına lipid darbe özen N2 akışı altında lipid kurutun. </li><li> Hemen tüpün tarafı aşağı akışı pipetleme 5 ul% 100 etanol içinde tekrar süspansiyon, 95 ul EM ekleyin ve iyice karıştırın. Not: Karışım homojen görünmelidir; renkli lipit tüp tarafta kalır veya sıvı clumpy belirirse, lipit tamamen çözülmüş ve daha etanol gerektirir değil. fro tüp korumakbuz üzerinde m ışık ve mağaza. </li><li> Floresan kolesterol analog: Canlı görüntüleme çalışmaları için 5 mi% 0.5-5, yumurta sarısı, emülsiyon 2.4 ug / ml kolesterol bir son konsantrasyon hazırlar. 1.5 ml&#39;lik plastik tüp içine kolesterol istenilen miktarda aktarın. Tüpün dışına lipid darbe özen N2 akışı altında lipid kurutun. </li><li> Hemen sonra, tüp iki aşağı akış pipetleme saflaştınldı H2O RT% 1 yağ asidi içermeyen BSA 85 ul karışımı ile RT% 100 etanol içinde 15 ul içinde süspanse Işıktan tüp korumak ve buz üzerinde saklayın. </li></ol></li><li> Yumurta Sarısı Lipozom Besleme hazırlayın. <ol><li> 50 ml konik tüp içinde EM yumurta sarısı bir çözülmüş kısım ekleyin. 1-2 dakika boyunca seyreltilmiş yumurta sarısı karışımını Vortex; Karışım, homojen bir emülsiyon olarak görünür. </li><li> Yeni, taze 50 ml konik tüp protein holdingler kaldırmak ve toplamak için ince mesh süzgeç vasıtasıyla karışımı dökün. </li><li> Darbe SONICAlipozom oluşturmak için RT&#39;de: a dörtte inç konik mikrotip (6 W çıkış yoğunluğu her set arasında 5-10 sn duraklatma 5 kez (5 x 1 sn, 1 sn kapalı)) yumurta karışımını te. Sonikatör güç ayarları bağımlı enstrüman ve bu nedenle her enstrüman ve mikro uç için optimizasyon gerektirir. Not: Sürekli kullanıma kadar homojenliği sağlamak için oda sıcaklığında lipozom karışımı sallayın. </li></ol></li><li> arzu edildiği takdirde, yumurta sarısı lipozomlara Floresan bir lipid analoğu ekleyin. Hemen Sonikasyon sonrasında, lipozomlar içine dahil 30 saniye boyunca yüksek hızda lipozom karışımı ve girdap içine hazırlanmış lipid pipetleyin. folyo tüp sararak ışıktan karışımı korumak ve oda sıcaklığında sallanan devam ediyor. </li></ol> 3. Besleme Paradigma <ol><li> Besleme için Larva hazırlayın. <ol><li> beslenme engelleyebilir belirgin morfolojik kusurlar için besleme, ekran larva başlamadan önce. 60 mm x 15 mm Petri kapları veya 6 veya 12-kuyu pla Transfer larvalarıTES EM asgariye düşürmek ve hazırlanan lipozom çözeltisi, 5 ml ile değiştirin. </li><li> Gerekirse, EM 5 mi EM ve / veya 5 mi% 5 yumurta akı için beslenmemiş kontrol larvaları transferi ve paralel olarak tedavi. </li></ol></li><li> Yavaşça flüoresan lipid analogları varsa ışıktan korumak için devam ederken gıda alımını teşvik etmek için yem boyunca kuluçkaya rocker larvaları (30 rpm&#39;de 29-31 ° C) sallayın. Larvalar ihtiyacı ışığa maruz kalması durumunda, bir renkli cam inkübatör kapaklı maruziyeti en aza indirmek. </li><li> besleme süresinin sonunda, EM 3 kez özgürce yüzme larva durulayın. Not: Larva besleme sırasında herhangi bir noktada lipozomlar alıcı başlayabilir. bu larvalar aynı anda beslenme başlaması önemlidir ise, gıda alımı için ekran besleme 1 saat sonra (3.4) ve beslemeyi tamamlamak için yumurta sarısı emülsiyonu ile besleme başlamıştır tek larvaları dönün. </li><li> az sayıda gıda alımı için bu noktada larvaları Ekran ea olmayabilirt (genellikle ~% 0-5). Onlar beslenen olmadığını belirlemek için buz üzerinde bir metal blok üzerinde anestezi ya da hafif soğutulmuş olan larva bağırsak inceleyin: lipozomlar tüketilen larva karanlık bir bağırsak (Şekil 1) sahip olacaktır. </li><li> Hemen gıda alımı için görüntü veya işlem larvaları. Alternatif olarak, bir yerde taze EM larva ve 28 ° C&#39;de inkübe metabolik işleme oluşmasına izin vermek. </li></ol> Canlı Görüntüleme Larva Montaj 4. <ol><li> Montaj Medya hazırlayın. <ol><li> % 3 metil selüloz: -20 ° C &#39;de yıllık yakın kaynama EM, girdap, 4 ° C&#39;de 2-3 gün tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında kaya ve mağaza 25 ml 0.75 g metil selüloz ekleyin. 4 ° C&#39;de dondurma ve eritme işlemlerine ait döngülerin tekrar hava kabarcıkları kaldırır. larva montaj sırasında buz üzerinde% 3 metil selüloz saklayın. </li><li> % 1.2 düşük montaj agaroz için: 0.3 g ilave 25 ml EM agaroz düşük eritmek ve 2 ml t içine kaynatın, kısım getirerek çözmekUBE ve sıcaklıkta bir blok üzerinde 26-28 ° C&#39;de muhafaza. Kullanılmayan tam bölünen miktarları, oda sıcaklığında saklandı veya -20 ° C ve kullanım sırasında tekrar kaynatılır edilebilir. Agaroz larvalarının maruz ya da ısıtmalı aşırı olabilir önce işlemek için yeterli serin olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Düşük büyütme, orta hacimli canlı görüntüleme için, buz üzerinde metal bir blokta bir doku üzerinde bir cam slayt yerleştirin ve slayt soğumasını bekleyin. yapıştırılmış bir balıkçı satırı poker kullanarak,% 3 metil selüloz üzerine larva transferi, slayt üzerine (buz üzerinde 4 ° C&#39;de muhafaza edilmiştir)% 3 metil selüloz bol miktarda uygulayın (0.41 mm çapında misina bir cam kılcal tüp sonu) bu metil selüloz seyreltilebilir olmayan (böylece aşırı EM drenaj) ve istenen şekilde larva konumlandırmak için troth oluşturun. </li><li> kısa vadeli (&lt;20 dk), bir dik yağ emersion amacı ile yüksek büyütmeli canlı görüntüleme, yöntem barınağa lamel ile larva monte edin. <ol><li> siyanoakrilat bazlı tutkal (Superglue) kullanınBir cam slayt bir ucuna aa 22 mm x 30 mm&#39;lik bir örtücü cam ekleyin. lamel bitişik slaytta% 3 metil selüloz ince bir çizgi koymak ve geniş bir delik Pasteur pipetiyle slayt larva transfer etmek için bir poker kullanın. o metil selüloz sulandırmak olmayacak şekilde aşırı EM çıkarın. </li><li> Bir poker kullanarak, yavaşça lamel yanında başlarını (sağ görüntü safra kesesi kadar yan, yukarı karaciğer daha fazla görüntüye sol taraf) onların yüzüne metil selüloz içinde larva yerleştirin. </li><li> nazikçe ikinci lamel köşelerinde ve spot superglue larvaları köprü monte lamel lamel ve slayt diğer bir kenarını yerleştirin. Bu adım sırasında veya bu larvalar yaralanmamış kalırken görüntüleme böylece amacı ile aşırı baskı uygulamak etmemeye dikkat edin. </li></ol></li><li> Uzun vadede, dik daldırma amacı ile yüksek büyütmeli görüntü, agaroz larva monte edin. agaroz sonra aktarmak% 1.2 düşük eriyik küçük bir kana bir larva ekleBir petri agaroz küçük bir hacme larva. <ol><li> Hızla Agaroz katılaşır önce poker ile larva yerleştirin. Agaroz 2-3 dakika kurumasını ve kurumasını önlemek için taze EM ile tam agaroz kapsayacak şekilde izin verin. </li></ol></li><li> Uzun vadede, ters amacı ile yüksek büyütmeli görüntü, agaroz bir cam alt çanak larvalarını monte edin. <ol><li> Buz üzerinde bir metal blok soğutun. Aşırı soğutma ve larva donmayı önlemek için bir doku ile ayrılmış metal blok üzerinde çanak yerleştirin. çanak bir larva transferi ve bir doku ile fitilleme ile EM kaldırın. </li><li> larva üstünde 28 ° C düşük erime agaroz (% 1.2) bir damla yerleştirin ve hemen bir poker (aşağı en iyi görüntüye sol tarafında karaciğer, safra kesesi aşağı görüntüye sağ tarafı) ile yerleştirin. Soğuk bloktan çanak çıkarın 2-3 dk kurumasını bekleyin ve agaroz kapsayacak şekilde taze EM yeterli hacim kazandırmak (~ 2-5 ml). </li></ol></li></ol> 5. Gıda Alımıtahlil <ol><li> 6.4 uM BODIPY C16 ihtiva eden bir yumurta şansı lipozom Beslemenin sonunda, plastik bir 1,5 ya da 2 ml tüp içinde 10 yıkanmıştır larva az havuz EM çıkarın ve donma ek. örnekler birkaç ay boyunca ışıktan korunan -80 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Not: Eğer mümkünse, birden çoğaltır toplamak. (Kullanılan aynı kavrama ideal olarak larva) arka lipit floresan normalleştirmek için bu adımda beslenmemiş larvaları toplamak için önemlidir. </li><li> Modifiye Bligh-Dyer lipit çıkarma 3,21 gerçekleştirin. <ol><li> Buz üzerinde örnek (2 O kullanılabilir Alternatif olarak arıtılmış, lH), 100 | il homojenizasyon tamponu (20 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) ekleyin. (: 1 sn kapalı 1 sn 5 sn toplam) bir mikrotip sonikatör ile buz üzerinde homojenize. Bu larvaların tamamen homojenize olup olmadığını kontrol edin; değilse, tekrarlayın. 13 ml&#39;lik atılabilir bir camdan yapılmış bir kültür tüpüne transfer (diğer cam tüpler kullanılabilir). Not: kloroform tehlikelidir; Tüm takip eden lipit eski yerineBir kimyasal kaput oda sıcaklığında çekiş adımlar. </li><li> (: Metanol kloroform) 2: Kullanılan homojenizasyon tamponu her 100 ul için 1 375 ul ekleyin. Vortex 30-60 sn, kullanılan 100 ul homojenizasyon tamponu başına kloroform ve vorteks 30 sn 125 ul ekleyin, 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 200 mM Tris pH 125 ul ekle 7,5 kullanılan 100 ul homojenizasyon tamponu (ışıktan korunan 2,000 x g, 5 dakika, RT) vorteks 30 saniye ve santrifüj başı. Dikkatle santrifüj örnekleri kaldırın. Bir üst faz sulu bir larva kalıntılardan bir arayüz, ve bir alt organik faz (lipidler içerir) olarak iki faza ayrılır. </li><li> temiz bir cam pipet ile alt organik fazı toplamak ve temiz bir 13 ml&#39;lik cam tüp içine aktarın. Not: arayüzde sulu fazı ve larva enkaz önlemek için özen gösterin; kirlenme meydana gelirse, santrifüj adımı ve hatırlamak tekrarlayın. Üst, sulu faz atın; o kaldırmak ve bu atmak yararlı olabilirOrganik fazı toplama önce aşaması. Örnek 1 aya kadar -80 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> ışıktan koruyarak, vakum altında organik faz (0.12 atm) kurutun. lipid çözünürlüğü azaltacaktır gibi sıvı buharlaştırılarak sonra numuneleri kuru devam etmeyin. 2&#39;de lipitleri tekrar süspansiyon: buz üzerinde ve mağaza: 1 (metanol kloroform). kloroform uygun hacmi: metanol çözeltisi kullanılan algılama yöntemine bağlı olarak değişir; düşük başlangıç ​​ve gerektiği gibi sulandırmak devam ediyor. Genel kural 10 havuza larva için 10 ul kullanmaktır. </li></ol></li><li> Bir kanalize TLC plaka üzerine eşit aralıklı aralıklarla tüm numune hacimleri nokta ve rutin biyomoleküler görüntüleme (örneğin, bir floresan plaka okuyucu) için kullanılan bir lazer tarayıcı ile plaka tarayın. 510-665 nm 500-650 nm ve maksimum emisyon bir maksimum eksitasyon sahip maddeler listesine dahil Floresan bir lipid analoglan için, 520 nm&#39;lik bir emisyon toplama 488 nm lazer ve kullanımı. <ol><li> görüntüleme yazılımı ile her noktada toplam floresan ölçmek. Not: Doğal eşleştirilmiş, beslenmemiş larva örneklerin floresan çıkarılarak arka plan lipit floresan meydana Doğru. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Carten, J. D., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+system+swims+into+focus%3A+using+the+zebrafish+to+visualize+intestinal+metabolism+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lipidol%22%5BJournal%5D)">A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo.</a> Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).</li>
<li>Babin, P. J., Vernier, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+lipoproteins+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma lipoproteins in fish.</a> J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).</li>
<li>Marza, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+and+nutritional+regulation+of+a+zebrafish+gene+homologous+to+mammalian+microsomal+triglyceride+transfer+protein+large+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit.</a> Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).</li>
<li>Stoletov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+lipid+accumulation%2C+lipoprotein+oxidation%2C+and+macrophage+lipid+uptake+in+hypercholesterolemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish.</a> Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+effects+of+high-carbohydrate+feeding+of+larvae+on+adult+glucose+metabolism+in+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio.</a> Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+a+combined+high+cholesterol+diet+and+high+glucose+environment+on+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature.</a> PLoS One. 8 (12), 81485(2013).</li>
<li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+and+attenuation+of+oxidized+lipid+accumulation+in+hypercholesterolemic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish.</a> J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li>
<li>Matthews, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFalpha-dependent+hepatic+steatosis+and+liver+degeneration+caused+by+mutation+of+zebrafish+S-adenosylhomocysteine+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase.</a> Development. 136 (5), 865-875 (2009).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC Physiol. 10, 21(2010).</li>
<li>Chu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Akt1+enhances+adipogenesis+and+leads+to+lipoma+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish.</a> PLoS One. 7 (5), 36474(2012).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).</li>
<li>Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+approaches+to+the+study+of+zebrafish+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition.</a> ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).</li>
<li>Farber, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+digestive+physiology+using+fluorescent+phospholipid+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters.</a> Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).</li>
<li>Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+yolk+lipid+processing%3A+a+tractable+tool+for+the+study+of+vertebrate+lipid+transport+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism.</a> Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).</li>
<li>Otis, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+apolipoprotein+biology%3A+comprehensive+expression+analysis+and+a+role+for+ApoA-IV+in+regulating+food+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake.</a> Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).</li>
<li>Bligh, E., Dyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).</li>
<li>Otis, J. P., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+vertebrate+digestive+function+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism.</a> Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).</li>
<li>Andre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fatty+acid+binding+protein+gene+expression+reveals+the+cephalocaudal+patterning+during+zebrafish+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis.</a> Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PLoS One. 7 (12), 52549(2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada açıklanan teknikler araştırmacılar, bir lipit bakımından zengin yem ile larva Zebra balığı tedavi canlı larva diyet lipit işleme görselleştirmek ve larva besin alımını ölçmek için izin verir. başarı sağlamak için, özel dikkat birkaç kritik adımlar verilmelidir. Ticari tavuk yumurtası değişir; Potansiyel değişkenliği en aza indirmek için biz omega-3 yağ asitleri için zenginleştirilmiş değil kafes ücretsiz tavuk organik yumurta tüm testleri gerçekleştirmek. Düşük besleme oranları daha genç 6 gıda alımını (yani,...

bağırsak diyet lipit işleme düzenleyen mekanizmalar, karaciğer karmaşık lipit sentezi ve lipoprotein metabolizmasını kontrol eder ve bu organların besin alımını kontrol etmek için merkezi sinir sistemi ile çalışmak nasıl tam olarak anlaşılamamıştır. Obezite, kalp-damar hastalıkları, diyabet ve alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının mevcut salgın hastalıklar ışığında bu biyoloji aydınlatmak için biyomedikal ilgi çekicidir. Hücre kültüründe Çalışmalar ve fareler diyet lipidler ve hastalık ve Zebra balığı (Danio rerio) arasındaki mekanik ilişkileri anlayışımız çoğunluğu sağladı bu çalışmayı tamamlamak için ideal bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Zebra balığı, yüksek omurgalılar 1,2 benzer gastrointestinal (Gİ) organları, lipid metabolizmasını ve lipoprotein ulaşım var hızla geliştirmek ve genetik uysal vardır. Larva zebrafish optik netlik in vivo çalışmalar kolaylaştırır, bir particulahücre dışı ortamın olarak GI sistemin çalışması için r avantajı (yani, safra, Mikrobiyota, endokrin sinyal) ex vivo. uyarınca, genetik, izlenebilir ve vesile birleştiren araştırma vücut ile Zebra balığı larvalarının görüntüleme yaşamak için modellemek için neredeyse imkansız bir diyet manipülasyonlar (yüksek yağ 3,4, kolesterol 5 ve -Karbonhidrat diyetler 6,7), ve kardiyovasküler hastalık 8 modelleri çeşitliliği, diyabet 9,10, karaciğer yağlanması 11-13 ve obezite 14-16, metabolik anlayışlar bir dizi sağlamak için ortaya çıkıyor. Metabolik araştırma içine larva Zebra balığı geçiş önemli bir yönü zebrabalıkları ve Zebra balığı benzersiz güçlü istismar yeni testlerin gelişmesine diğer model hayvanlarda geliştirilen tekniklerin optimizasyonu olduğunu. Bu protokol teknikleri Lipi larva zebrafish beslemek için geliştirilmiş ve optimize edilmiş sunulurD-zengin yemek, hücre içi çözünürlük bütün vücut diyet lipit işleme görselleştirmek ve gıda alımını ölçün. o yağ ve kolesterol (lipidler ~ tavuk yumurtası,% 60 trigliserit kolesterol ~% 5 olduğu sarısı, ve% 35% 58 fosfolipit vardır oluşturan yüksek seviyede içerdiği tavuk yumurta sarısı lipit bakımından zengin bir yemek oluşturmak için seçildi ). Zebra balığı diyetler ve beslenme alayları laboratuarları 17 arasında standardize edilmemiştir olarak tavuk yumurta sarısı, tipik ticari zebrabalıkları Mikropellet gıdalar (~% 15 lipidler) ve belirli yağ asitleri türlerin bilinen yüzdeleri ile standartlaştırılmış bir yem olduğu avantajı daha fazla yağ sağlar. Ayrıca, yumurta sarısında Resim Floresan bir lipid analoglan ince katman kromatografisi yoluyla metabolizmasını araştırmak taşıma ve diyet lipidlerin 18 birikimini, hayati boya 3 ve karmaşık lipidlere kovalent eklenmesi ile, her iki hareket ederek lipid damlacıkları olarak resim hücresel bileşenleri görselleştirmek (TLC) 19 </sup&gt; Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) (SAF yayınlanmamış veri) ve toplam besin alımı 20 için sayısal bir tahlil sağlar.

<table><tbody><tr><td>Trikain (etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Larva zebra balığı için anestezi</td></tr><tr><td>Tavuk yumurtası</td><td>N/A</td><td>N/A Organik</td><td>, kafessiz yumurtalar, omege-3 yağ asitleri için zenginleştirilmemiş</td></tr><tr><td>Ultrasonik işlemci 3000 sonikatör</td><td>Misonix, Inc.</td><td>S-3000</td><td>Yumurta sarısı lipozomları yapmak için</td></tr><tr><td>Sonabox akustik muhafaza</td><td>Misonix, Inc.</td><td>432B</td><td>Yumurta sarısı lipozomları yapmak için</td></tr><tr><td>1/8" konik mikro uçlu</td><td>Misonix, Inc.</td><td>419</td><td>Yumurta sarısı lipozomları yapmak için</td></tr><tr><td>Amber şişeler (4 ml, cam)</td><td>National Scientific</td><td>13-425</td><td>Lipid depolama; şişeler, üstü açık kapaklar ve septa kapağı içerir</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini&nbsp;</td><td>Benchmark</td><td>1222U12</td><td>Yemler için kuluçka çalkalayıcı</td></tr><tr><td>BODIPY FL C16&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3821</td><td>Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Hekzadekanoik Asit)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C12&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3822</td><td>Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Dodekanoik Asit)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3834</td><td>Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Pentanoik Asit)</td></tr><tr><td>BODIPY FL C5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D2183</td><td>Floresan lipid analogu; (4,4-Difloro-5,7-Dimetil-4-Bora-3A,4A-Diaza-S-Indacene-3-Propiyonik Asit)</td></tr><tr><td>TopFluor kolesterol&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipidler A.Ş.</td><td>810255</td><td>Floresan lipid analogu; 23- (dipirroteneboron diflorür) -24-norkolesterol</td></tr><tr><td>TopFluor kolesterol çözünürlüğü için</td><td>yağ asidi içermeyen BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0281-1G</td></tr><tr><td>Metil selüloz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387</td><td>Canlı larva görüntüleme için montaj ortamı; 75 x 25 x 1 mm</td></tr><tr><td>Düşük erime agaroz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Canlı larva için montaj ortamı Görüntüleme; 22 x 30</td></tr><tr><td>VWR mikroskop slaytları&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>16004-422</td><td>Canlı görüntüleme için larvaların montajı</td></tr><tr><td>Lameller&nbsp;</td><td>Kapak Camı</td><td>12-544A</td><td>Canlı görüntüleme için montaj larvaları</td></tr><tr><td>Süper yapıştırıcı</td><td>Loctite</td><td>LOC01-30379</td><td>Canlı görüntüleme için montaj larvaları</td></tr><tr><td>FluoroDish (cam tabanlı tabak)</td><td>World Precision Instruments, Inc.&nbsp;</td><td>FD35-100</td><td>Canlı görüntüleme için larvaların montajı; 35 mm çanak, 23 mm cam, 0,17 mm cam kalınlığı&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Leica Microsytems</td><td>SP-2, SP-5</td><td>Yüksek büyütmeli canlı görüntüleme için</td>mikroskop</tr><tr>Düşük <td>büyütmeli canlı görüntüleme için</td><td>Stereoskop</td><td>Nikon</td><td>SM21500</td> Mikroskop</tr><tr><td>Cam kültür tüpleri&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>73500-13100</td><td>Lipid ekstraksiyonu; (13 x 100 mm; 13 ml)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Plus&nbsp;</td><td>ThermoQuest</td><td>SC210A</td><td>Lipid ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Kanallı TLC plakaları</td><td>Whatman Scientific</td><td>WC4855-821</td><td>Gıda alımı testi; LK5D Silika Jel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um kalınlığında; </td></tr><tr><td>Durdurulan Kanallı TLC plakaları</td><td>Analtech, Inc.</td><td>66911</td><td>Gıda alımı testi; Whatman Scientific TLC plakaları için doğrudan değiştirme</td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Değişken Modlu Görüntüleyici</td><td>GE Healthcare</td><td>9410</td><td>Gıda alımı tahlili için floresan plaka okuyucu</td></tr><tr><td>ImageQuant yazılımı</td><td>GE Healthcare</td><td>29000605</td><td>Gıda alım tahlilinin analizi</td></tr><tr><td>5 3/4' Geniş çaplı, borosilikat tek kullanımlık pastör pipetleri&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Kimble</td><td>63A53WT</td><td>Larvaların aktarılması</td></tr></tbody></table>

larva zebra balığı için paradigma besleme yüksek yağlı: besleme, canlı görüntüleme ve gıda alımı miktarının belirlenmesi

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebra balığı, diyetle alınan lipid işleme ve metabolik hastalıkların bir modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Bu protokol, larva zebra balığının, embriyo ortamında yumurta sarısının sonikasyonla oluşturulmasıyla oluşturulan tavuk yumurta sarısı lipozomlarının bir emülsiyonundan oluşan, lipit açısından zengin bir öğünün nasıl besleneceğini açıklar. Larvaları yumurta sarısı tüketimi için taramak için ayrıntılı talimatlar verilmiştir, böylece beslenemeyen larvalar deneysel sonuçları karıştırmaz. Tavuk yumurtası sarısı lipozomları, yağ asitleri ve kolesterol dahil olmak üzere floresan lipid analogları ile çivilenebilir ve bu da diyet lipid işlemesinin hem sistemik hem de hücre altı görselleştirilmesini sağlar. Yüksek ve düşük büyütmede hem dik hem de ters objektiflerle kısa ve uzun süreli canlı görüntülemeye elverişli olan larvaları monte etmek için çeşitli yöntemler açıklanmaktadır. Ek olarak, floresan lipid analogları ile beslenen larvaların lipitlerini ekstrakte ederek, lipitleri ince bir tabaka kromatografi plakası üzerinde tespit ederek ve floresanı ölçerek larva besin alımını ölçmek için bir test sunulmaktadır. Son olarak, prosedürlerin kritik yönleri, önemli kontroller, belirli deneysel soruları ele almak için protokolleri değiştirme seçenekleri ve potansiyel sınırlamalar tartışılmaktadır. Bu teknikler sadece odaklanmış, hipotez odaklı araştırmalara değil, aynı zamanda diyet lipid metabolizmasını ve gıda alımının kontrolünü incelemek için çeşitli ekranlara ve canlı görüntüleme tekniklerine de uygulanabilir.

29-31 ° C&#39;de bir rocker verildiğinde, sağlıklı larvaların (≥95%) çoğunluğu 1 saat içinde yemek. yumurta sarısı emülsiyonu tüketen üzerine, larva bağırsak rengi koyulaşır. Çok koyu bağırsaklar 2 saat (Şekil 1) görülebilir. Larvalar beslenmemiş ya da beslemek için başarısız olursa, bağırsak açık kalır. Larva beslenen yumurta beyazı sergi renkli karartmak değil şişmiş bağırsak lümen. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54735/54735fig1.j...

Zebra balığı, diyetle alınan lipid işleme ve metabolik hastalıkların değerli bir modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Lipid açısından zengin larva yemlerinin protokolleri, diyet floresan lipid analoglarının canlı görüntülenmesi ve gıda alımının miktarının belirlenmesi açıklanmıştır. Bu teknikler çeşitli tarama, görüntüleme ve hipoteze dayalı sorgulama tekniklerine uygulanabilir.

Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Bu deneysel protokolün genel amacı, larva Zebra balıklarını, larvalardaki görsel lipid alım dinamiklerini izlemek ve diyete bağlı lipid alımını nicelleştirmek için floresan bir lipid analoğu ile zenginleştirilebilen, lipid açısından zengin bir öğünle beslemektir. Bu yöntem, diyetteki lipidlerin nasıl metabolize olduğu ve gıda alımının nasıl düzenlendiği gibi metabolizma ve gastrointestinal biyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, floresan lipid analoglarının diyetteki lipozomlar aracılığıyla verimli bir şekilde iletilebilmesidir.Zebra balığı larvalarının optik berraklığı, mikroskobinin hücre altı lipid işlemesini ortaya çıkarmasına olanak tanır. Başlamak için, 0,5 µg/µL son konsantrasyon elde etmek amacıyla, bir miligram toz floresan lipid analoğunu iki mililitre %100 kloroform içinde süspansiyona getirin. Analoğu, solventle uyumlu ve Teflon contalı vidalı kapaklara sahip amber renkli cam tüplere alikotlayın.Bu stokları dondurucuda saklayın. 1,5 mililitrelik bir tüpe 0,5 microgram per microliter konsantrasyonundaki floresan lipid analoğu stokundan 10.4 microliter ekleyin ve lipidi tüpten dışarı püskürtmemeye dikkat ederek bir nitrojen akımı altında kurutun. Kurutulmuş lipidi, tüpün kenarlarından aşağıya doğru pipetleyerek beş microliter %100 etanol içinde hemen yeniden süspande edin.Ardından, 95 µL embriyo ortamı ekleyin ve karışım homojen görünene kadar pipetle aşağı yukarı çekerek iyice karıştırın. Tüpü ışıktan koruyun ve ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde saklayın. Floresan kolesterol lipozom çözeltisi hazırlamak için, yumurta sarısı emülsiyonuna eklendiğinde 2,5 µg/mL nihai konsantrasyon oluşturacak miktarda floresan kolesterol analoğu stok çözeltisini 1,5 mL'lik bir tüpe ekleyin.Kolesterol stokunu, daha önce olduğu gibi azot akımı altında kurutun. Floresan kolesterol analoğunu, tüpün kenarından pipetleyerek hemen 15 µL oda sıcaklığındaki %100 etanol içinde yeniden süspande edin. Ardından, 85 µL %1 yağ asidi içermeyen BSA ve su ile karıştırın.Lipidin yem içinde homojen dağılımını ve tüm larvalar için eşit erişilebilirliğini sağlamak amacıyla, floresan lipid analoğunu yumurta sarısı emülsiyonuna eklemeden önce etanol ve embriyo ortamında tamamen çözünür hale getirmek esastır. Tüpü folyo ile ışıktan koruyun ve buz üzerinde saklayın. Besleme solüsyonunu hazırlamak için, 50 mililitrelik konik tüpe 19 mililitre embriyo ortamı ve ardından bir mililitrelik yumurta sarısı alikotu ekleyin.Homojen bir emülsiyon elde etmek için karışımı bir ila iki dakika boyunca vorteksleyin. Protein konglomeralarını uzaklaştırmak için karışımı ince bir süzgeçten geçirerek taze bir 50 mililitre konik tüpe toplayın. Ardından, yumurta karışımını altı watt gücünde, 1/4 inch konik mikro uç kullanarak beş kez, bir saniye açık, bir saniye kapalı olacak şekilde darbeli sonikasyona tabi tutun.Sonikasyon programını dört kez daha tekrarlayın. Bu işlem, kullanım anına kadar homojenliği korumak için sürekli olarak çalkalanması gereken lipozomları oluşturur. Sonikasyonun hemen ardından, beş mililitre lipozom karışımına uygun miktarda floresan lipid analogları ekleyin.Floresan lipid analoglarının lipozomlara dahil edilmesi için yüksek hızda 30 saniye boyunca vorteksleyin. Tüpü folyo ile sararak karışımı ışıktan koruyun ve tekrar sallayıcıya yerleştirin. Bir besleme kabına elli larva ekleyin, embriyo ortamını uzaklaştırın ve 5 milliliters yem ekleyin.Besin alımını teşvik etmek için larvaları inkübe edilmiş bir sarsıcıda nazikçe sallayın ve floresan lipid analogları kullanılıyorsa ışıktan koruyun. Besleme süresinin sonunda, larvaları beş mililitre embriyo ortamında üç kez yıkayın. Larvaları immobilize etmek için, buz üzerine bir metal blok yerleştirin, aşırı soğumayı önlemek için üzerine bir peçete örtün ve ardından soğutmaları için larvaları üzerindeki embriyo ortamı içeren tabağa yerleştirin.Larvaları bir diseksiyon mikroskobunda 10x büyütmede gözlemleyin ve hangilerinin lipozom besinini tükettiğini belirleyin. Lipozom tüketen larvaların bağırsakları koyulaşmış olacaktır. Larvaların beslenip beslenmediğini belirlemek için koyulaşmış bağırsak kontrolü yapmak kritiktir.Genellikle larvaların yüzde bir ila beşi beslenmeyecek ve bunlar tespit edilip uzaklaştırılmazsa deneysel sonuçları karıştırabilecektir. Ters objektif ile uzun süreli, yüksek büyütmeli görüntüleme için, önce larvaları buz üzerindeki metal bir blokta soğutun. Bir larvayı cam tabanlı bir kaba aktarın ve embriyo ortamını bir doku yardımıyla emdirerek uzaklaştırın.Larvanın üzerine 42 °C sıcaklıkta, düşük erime noktalı %1,2'lik agarozdan bir damla yerleştirin ve hemen bir poker yardımıyla konumlandırın. Kabı soğuk bloktan çıkarın ve agarozun iki ila üç dakika boyunca beklemesini sağlayın. Son olarak, agarozu örtecek ve kurumayı önleyecek miktarda taze embriyo medyumu ekleyin.Numuneler artık görüntüleme için hazırdır. Lipozom beslemesinin sonunda, yıkanmış en az 10 larvayı 1,5 mililitrelik bir tüpte toplayın. Embriyo ortamını uzaklaştırın ve ardından larvaları hızlı dondurun.Kontrol olarak, 10 aç larva içeren ayrı bir tüpte işlemi tekrarlayın. Numuneyi buz üzerinde tutarak, her tüpe 100 µL homogenizasyon tamponu ekleyin ve ardından mikro uçlu bir sonikatör ile homogenize edin. Dokuyu 13 mL'lik bir kültür tüpüne aktarın.Her bir homojenizasyon tamponu bulamacına 375 µL kloroform-metanol karışımı ekleyin. 30 ila 60 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 125 µL daha kloroform ekleyin ve 30 saniye boyunca vorteksleyin.Ardından, 125 µL 200 mM TRIS pH 7.5 ekleyin, 30 saniye boyunca vorteksleyin ve ardından ışıktan korunmuş şekilde 2000 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Ayrışmış fazları bozmamak için örnekleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Temiz bir cam pipet kullanarak alt organik fazı toplayın ve temiz bir 13 mL cam tüpe aktarın.Üstteki sulu fazın veya ortadaki larva kalıntısı fazlarının transfer edilmesinden dikkatlice kaçının ve bunları atın. Organik fazı, ışıktan koruyarak 0,12 atmosferik basınçta vakum altında kurutun ve sıvı buharlaştığında işlemi durdurmaya özen gösterin. Tek bir örneği 10 µL oranında ikiye bir kloroform-metanol karışımında yeniden süspande edin ve örnek hacminin tamamını kanallı, ince tabaka kromatografi plakasına damlatın.Kalan örneklerle, eşit aralıklarla damlatma yaparak işlemi tekrarlayın. Son olarak, plakayı floresan bir plaka okuyucu ile tarayın. Deneysel koşullar altında sarsıntılı platformda (rocker) beslenen larvaların incelenmesi, yumurta sarısı emülsiyonu tüketmiş balıklarda tipik olarak görülen koyulaşmış bağırsakları göstermektedir.Beslenmemiş larvaların bağırsakları genellikle şeffaftır, bu nedenle besleme süresi boyunca diyet formülünü tüketmemiş olanlar kolayca ayırt edilebilir. Floresan lipid analoğu ile beslenen bir larva, bu diyet lipidinin taşınmasını ve birikmesini görselleştirir. Burada, sekiz saatlik beslemeden sonra floresan sinyali tüm sindirim organlarında görülmektedir.Çeşitli lipid analogları, kompleks lipidlere farklı şekillerde metabolize oldukları için benzersiz hücresel yapı setlerine dahil olur ve böylece bunları görünür kılar. Burada, Floresan-C16 ve C12 analogları lipid damlacıklarını işaretler. Floresan-C5 ise hepatik ve pankreatik kanalları, lipid damlacıklarını, hücresel membranları ve arteriyel ağları işaretler.Ve Floresan-C2 analoğu karaciğer ve pankreas kanallarını ve hücresel membranları etiketler. Yabani tip ile Apolipoprotein A4B1'i aşırı ifade eden transgenik larvaların beslenmesini incelemek için larval besin alım deneyleri kullanılmış ve dört saatlik beslemeler boyunca transgenik larvaların yabani tipten daha az beslendiği görülmüştür. Beslemeler, eşleştirilmiş, beslenmemiş kontrol larvaları kullanılarak normalize edilmiştir.Besleme sonrası Apo A4'ü aşırı eksprese eden transgenik larvaların ve yabanı tip larvaların floresans miktarlarının belirlenmesi, transgenik larvalarda yabanı tipe kıyasla alımın önemli ölçüde azaldığını göstermektedir. Yönteme hakim olunduğunda, yumurta sarısı floresan lipid analog yemi yaklaşık 15 dakikada hazırlanabilir. Gıda alımı, 10 ila 12 havuzlanmış örnekten yaklaşık dört saatte nicelendirilebilir.Bu prosedür uygulanırken, deforme olmuş çene, gelişmemiş bağırsak veya azalmış mobilite gibi gıda alımını engelleyebilecek gelişimsel kusurlar açısından larvaların taranması gerektiğini unutmamak önemlidir. Belirli proteinlerin ve hücre sinyalizasyon yollarının gıda alımını ve lipid metabolizmasını nasıl düzenlediği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, farmasötik tedaviler veya genom mühendisliği gibi yöntemler bu deneysel protokole dahil edilebilir. Bu teknik geliştirildikten sonra, gastrointestinal fizyoloji ve hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların larval Zebrafish'lerde diyete bağlı lipid transportunu ve birikimini görselleştirmelerinin yolunu açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, lipid açısından zengin zebra balığı larva yemi hazırlama, larvalarda gıda alımını tarama, kısa ve uzun süreli görüntüleme için larvaları sabitleme ve gıda alımını nicelleştirme konularında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sonikatörle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken kulak koruyucu ekipman kullanılmalıdır.

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Standart embriyo mikroenjeksiyonu ve stereomikroskopi ekipmanları kullanılarak, zebrafish larvalarının mikrogavage işlemi için yeni bir yöntem sunuyoruz. Mikrogavage işleminin, çeşitli materyallerin kontrollü miktarlarda özellikle zebrafish larvalarının intestinal lümenine iletilmesi için kullanışlı, güvenli ve etkili bir teknik olduğunu gösteriyoruz.

Zebra balığı larvalarının Microgavage

Bu videoda av yakalama testi anlatılmaktadır. Video, belirli nöronların lazer ablasyonundan sonra zebra balığı larvalarının av yakalama davranışını inceleme yöntemini tartışıyor.

Av Yakalama Deneyi: Zebra Balığı Larvalarının Av Yakalama Davranışını İncelemek İçin Bir Yöntem

Video, zebra balığı larvalarının kaçınma ve timotaksis testini anlatıyor. Video, zebra balığı larvalarının görsel caydırıcı uyarana yanıt olarak davranışlarını inceler.

Zebra Balığı Kaçınma ve Timotaksis Deneyi: Caydırıcı Görsel Uyarana Yanıt Olarak Larva Davranışını İncelemek İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

Kaynak: Flores, E. ve diğerleri. Zebrafish larvalarında gıda kaynaklı enfeksiyonlar için protozoan paramecium caudatum aracı olarak kullanılması. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, zebrafish larvalarında floresan E. coli enfekte paramecia ile beslenerek gıda kaynaklı bakteriyel bağırsak enfeksiyonu modeli oluşturma yöntemini göstermektedir.

Zebrafish larvalarında Bağırsak Enfeksiyonunun Gıda Kaynaklı Bakterilerle Modellenmesi

Laboratuvarımız 7 günlük eski Zebra balığı larvaları birkaç farklı davranışların tespiti için yararlı bir yeni yüksek verimli otomatik görüntüleme sistemi geliştirdi. Sistem, larva çevresel toksik ya da eczacılık maruz kalmış sonra davranış ince değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

Burada, larva zebra balığı ve koca kafa minnow lokomotor aktivite ve bir otomatik izleme yazılımı kullanarak photomotor yanıt (PMR) incelemek için bir protokol mevcut. Ortak toksikoloji biyoanalizler dahil, bu davranışların analizleri kimyasal bioactivity incelemek için bir tanı aracı sağlarlar. Bu iletişim kuralı kafein, modeli neurostimulant kullanılarak açıklanmıştır.

Davranışsal yanıt profilleri larva balık incelenmesi için deneysel protokol: nöro-uyarıcı kafein uygulamaya

Bu iletişim kuralı fluorescently etiketli gıda yüksek üretilen iş moda larva zebra balığı bağırsak yoluyla transit süresini ölçmek için hedeftir.

Yüksek işlem hacmi ölçüm larva zebra balığı kullanarak Gut Transit süre

Zebra balığı (Danio rerio) yaygın olarak kullanılan omurgalı hayvan için bir model mikrobiyal kolonizasyon ve Patogenez hale gelmektedir. Bu iletişim kuralı protozoon Terliksi Hayvan caudatum gıda kaynaklı hastalık içinde zebra balığı larva için bir araç olarak açıklar. P. caudatum kolayca bakteri içselleştirmesi ve doğal preying davranış ile larva zebra balığı tarafından alınan.

Protozoon Terliksi Hayvan caudatum zebra balığı larva gıda kaynaklı enfeksiyonlar için bir araç olarak kullanma

Burada, larva zebra balıklarının üç boyutlu floresan mikroskobu kullanılarak in vivo tüm beyin görüntülemesi için bir protokol sunulmaktadır. Deneysel prosedür numune hazırlama, görüntü toplama ve görselleştirmeyi içerir.

İn Vivo Üç Boyutlu Floresan Mikroskobu Kullanılarak Zebra Balığı Larvalarının Tüm Beyin Görüntülemesi

Bu çalışma, yetişkin zebrabalıklarda kesin, invaziv olmayan, vücut kütlesine dayalı oral ilaç dağıtımını mümkün kılan jelatin bazlı bir beslenme yöntemini sunmaktadır. Protokol, güvenilir besleme kabulünü ve prensip kanıtı olarak MK-801'in başarılı bir şekilde teslim edilmesini gösteriyor; bu da beklenen davranışsal etkileri ortaya çıkardı.

Balıklarda Oral İlaç Dağıtımına Basit ve Kesin Bir Yem Tabanlı Yaklaşım

Keşfedin lipid açısından zengin yem hazırlama ve canlı görüntüleme yöntemlerini Danio rerio larvalarında. Bu teknik metabolizma ve gastrointestinal biyoloji araştırmalarında diyetal lipit alımını nicelendirmeye olanak tanır.

Larva Zebra balığı için Paradigma Besleme Yüksek yağlı: Besleme, Canlı Görüntüleme ve Gıda Alımı miktarının belirlenmesi

Daha fazla video keşfet