Filtrasyon Su Örnekleri ve Çevre DNA Ekstraksiyon için bir Filtre Kartuşu Kullanımı
25 Kasım 2016
Su örneklerinin bir filtre kartuşu ile filtrelenmesi ve filtreyi çıkarmak için muhafazayı kesmek zorunda kalmadan çevresel DNA'nın (eDNA) çıkarılması için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, balıklardan alınan eDNA'yı metabarkodlama için geliştirilmiştir, ancak diğer organizmalardan alınan eDNA'ya da uygulanabilir.
Bu protokolün genel amacı, su örneklerini bir filtre kartuşu ile filtrelemek ve filtreyi çeşitli suda yaşayan organizmalardan eDNA'yı metabarkodlamadan çıkarmak için muhafazayı kesmek zorunda kalmadan çevresel DNA'yı çıkarmaktır. Bu yöntem, biyolojik çeşitliliğin izlenmesi ve topluluk ekolojisi gibi ekolojik alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, filtre kartuşlarının daha büyük su hacimlerini barındırabilmesi ve filtrasyon ve DNA ekstraksiyonunun steril bir şekilde gerçekleştirilebilmesidir.
Bu prosedüre başlamak için, bir aspiratör pompasının giriş konektörüne yüksek vakum hortumu takın. Borunun diğer ucunu bir manifolda takın. Manifolddaki üç kırmızı T-valfin kapalı konumda olduğundan emin olun.
Ardından, temiz bir eldiven seti giyin. Vakumlu kauçuk borunun üst ucuna bir dişi luer bağlantısı yerleştirin. Ardından, alt uca bir vakum konektörü yerleştirin.
Dişi luer bağlantısını dikkatlice filtre kartuşunun bir çıkış portuna takın. Ardından, vakum konektörünü bir silikon tıpaya takın. Hazırlanan plastik torbaya bir litre numune suyu dökün.
Vidalı kapağı erkek luer kilit konektörü ile kapatın. Ardından, monte edilmiş filtre kartuşunun bir giriş portunu erkek luer-lock konektörü ile dikkatlice bağlayın. Tüm bağlantıların güvenli olduğundan emin olun.
Ardından, plastik torbayı ağ panelindeki iki çataldan asın. Manifoldun giriş portuna bir silikon tıpa yerleştirin. Ardından aspiratörü açın.
Filtreleme için kırmızı T-valflerini açın. Filtre kartuşu kuruyana kadar manifoldu çalıştırın. Ardından kırmızı T-valfleri kapatın.
İstenilen miktarda suyu filtrelemek için tüm bu işlemi tekrarlayın. Numune alınan suyun tamamı filtrelendikten sonra, filtre kartuşunu plastik torbadan ve vakum kabından dikkatlice çıkarın. Kartuşun her iki ucunu da uygun luer kapaklarıyla kapatın.
Ardından, solvent geçirmez bir kalem kullanarak kartuşu ve giriş luer kapağını etiketleyin. DNA ekstraksiyonu yapmaya hazır olana kadar 20 santigrat derecede saklayın. Dört litreden büyük numuneler için, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi on litrelik bir kitap şişesi hazırlayın.
Filtrelenecek su örneğini ekleyin. Ardından, on mililitrelik bir pipet ucunu kitap şişesinin valfine sıkıca yerleştirin. Filtre kartuşunun giriş portunu pipet ucuna sıkıca yerleştirin.
Ardından, manifoldun giriş portuna bir silikon tıpa yerleştirin. Aspiratörü açın. Ardından, filtreleme için kırmızı T-valflerini açın.
Filtre kartuşu kuruyana kadar manifoldu çalıştırın. Filtreleme tamamlandıktan sonra kırmızı T-valflerini kapatın. Kartuşu plastik torbadan ve vakum konektöründen dikkatlice çıkarın.
Ardından kartuşun her iki ucunu da uygun luer kapaklarıyla kapatın. Kartuşu ve giriş luer kapağını etiketlemek için solvent geçirmez bir kalem kullanın. DNA ekstraksiyonu yapmaya hazır olana kadar 20 santigrat derecede saklayın.
Bir inkübatörü 56 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, menteşeli kapağı 2.0 mililitrelik bir tüpten kesin ve kapağı atın. Giriş luer kapağını filtre kartuşundan çıkarın.
Ardından, giriş portunu 2.0 mililitrelik tüpe yerleştirin. Kendinden sızdırmaz bir film kullanarak, kartuş ile toplama borusu arasındaki bağlantıyı sıkıca kapatın. Ardından, kombine üniteyi 15 mililitrelik konik bir tüp için bir santrifüj adaptörüne yerleştirin.
Filtrede kalan sıvıyı çıkarmak için kartuşu 5000 kez g'de bir dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandıktan sonra, toplama tüpünü filtre kartuşundan çıkarın ve tüpü atın. Ardından, giriş bağlantı noktasını yeniden kapatın.
Daha sonra, 20 mikrolitre protein A-Case solüsyonu, 220 mikrolitre fosfat tamponlu salin ve 200 mikrolitre tampon AL'yi karıştırın. Giriş kapağını çıkarın ve karışımı bir pipet kullanarak kartuşa ekleyin, pipeti tamamen giriş portuna yerleştirin. Giriş portunu yeniden özetleyin. Ardından, filtre kartuşunu döner bir çalkalayıcıya yerleştirin.
Döner çalkalayıcıyı önceden ısıtılmış inkübatöre yerleştirin ve çalkalayıcıyı 20 dakika boyunca 20 rpm'ye ayarlayın. Kuluçka sırasında, solvent geçirmez bir kalemle yeni bir 2.0 mililitrelik tüpü etiketleyin. Ardından, 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.
Kuluçka tamamlandıktan sonra giriş kapağını çıkarın. Ardından, giriş portunu yeni 2.0 mililitrelik tüpe yerleştirin. Konik boruyu bir vidalı kapakla kapatın.
Ekstrakte edilen DNA'yı toplamak için 5000 kez g'de bir dakika santrifüjleyin. Ardından, sterilize edilmiş forseps kullanarak 2.0 mililitrelik tüpteki kartuşu çıkarın. Tüpü kapatın ve ekstrakte edilen DNA'yı metin protokolünde belirtildiği gibi saflaştırın.
Bu prosedürde, dört farklı hacimde deniz suyu, iki benzersiz filtre kullanılarak aynı manifold üzerinde filtrelenir ve daha sonra eDNA ekstrakte edilir. Filtre kartuşu, cam elyaf filtrelerden ortalama %50 daha fazla tür tespit etti. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir.
Bu videoyu izledikten sonra, su numunelerinin bir filtre kartuşu ile nasıl filtreleneceğini ve filtreyi çeşitli suda yaşayan organizmalardan metabarkodlama eDNA'sından çıkarmak için muhafazayı kesmek zorunda kalmadan eDNA'nın nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, gövdeyi kesmeye gerek kalmadan çevresel DNA (eDNA) ekstraksiyonu yapmak için filtre kartuşu kullanılarak su örneklerinin filtrelenmesine yönelik bir yöntemi özetlemektedir. Temel olarak balıklardan eDNA metabarkodlaması için tasarlanmış olup, diğer sucul organizmalar için de uygulanabilir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Çevresel DNA (eDNA) analizi
- Metabarkodlama teknikleri
- Ekolojik izleme
Arka Plan
- eDNA, biyolojik çeşitlilik ve topluluk ekolojisi hakkında bilgiler sağlar.
- Geleneksel yöntemler, filtrelere erişmek için genellikle invaziv teknikler gerektirir.
- Bu yöntem, daha büyük su hacimlerinin işlenmesine olanak tanır.
- Filtrasyon ve DNA ekstraksiyonu steril bir ortamda gerçekleştirilebilir.
Çalışmanın Amacı
- eDNA ekstraksiyonu için invaziv olmayan bir yöntem geliştirmek.
- Sualtı ekosistemlerinde biyolojik çeşitlilik izlemesini kolaylaştırmak.
- eDNA metabarkodlama verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Yüksek vakum hortumunun bir aspiratör pompasına bağlanması.
- Hortumun kontrollü vanaları olan bir manifolta bağlanması.
- Su örneklerinin bir filtre kartuşu aracılığıyla filtrelenmesi.
- Yuva açılmadan filtreden eDNA ekstraksiyonu yapılması.
Ana Sonuçlar
- Protokol, daha büyük su hacimlerinden eDNA'yı başarıyla ekstrakte eder.
- Filtrasyon ve ekstraksiyon süreci boyunca steriliteyi korur.
- Balıkların ötesinde çeşitli sucul organizmalar için uygulanabilirdir.
- eDNA metabarkodlama çalışmalarının güvenilirliğini artırır.
Sonuçlar
- Bu yöntem, su örneklerinden eDNA ekstraksiyonunu kolaylaştırmaktadır.
- Biyoçeşitlilik değerlendirmesi için güçlü bir araç sunarak ekolojik araştırmaları destekler.
- Gelecekteki uygulamalar, çevresel izlemenin diğer alanlarına da genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Filtre kartuşları kullanılarak büyük hacimli su örneklerinden çevresel DNA'nın (eDNA) verimli bir şekilde ekstraksiyonu, sucul sistemlerde invaziv olmayan, yüksek kapasiteli biyolojik çeşitlilik izlemesine olanak tanır. Bu yaklaşım, habitatları bozmadan tür varlığına ilişkin sağlam ve kantitatif veriler sağlayarak erken keşif ve hedef doğrulamayı destekler. Yöntemin ölçeklenebilirliği ve sterilitesi, çevresel biyobelirteçler ve ekolojik assayler geliştiren veya doğrulayan biyofarma ekipleri için doğrudan önem taşımaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- eDNA'yı moleküler bir okuma olarak kullanarak sucul biyoçeşitliliğin hipotez odaklı sorgulanmasına olanak tanır.
- Büyük su hacimlerinden kapsamlı tür verileri toplayarak ekolojik hedeflerin fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Standartlaştırılmış, invaziv olmayan örnekleme yoluyla çevresel biyobelirteç geliştirmede tahminsel güveni kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Metabarkodlama ve moleküler analiz iş akışları için doğrulanmış eDNA örneklerini hazırlar.
- Steriliteyi koruyarak ve kontaminasyon riskini minimize ederek analiz tekrarlanabilirliğini ve standardizasyonunu artırır.
- Tür saptama ve miktar belirleme amacıyla çevresel örneklerin ölçeklenebilir, yüksek kapasiteli taramasını sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Ekosistem sağlığının non-invaziv izlenmesine olanak tanıyarak translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Çevresel örneklemeden moleküler analize kadar süreklilik sağlayarak, ekolojik analizlerin riskle uyumlu şekilde geliştirilmesini destekler.
- Kantitatif ve tekrarlanabilir eDNA verileri sunarak, preklinik çevresel çalışmalardaki mekanistik belirsizliği azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu filtrasyon ve ekstraksiyon protokolü, çevresel örnekleme ve moleküler analiz geliştirme arayüzünde bütünleşerek, erken keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan iş akışlarını desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Sucul biyolojik çeşitlilik çalışmalarında hipotez testlerini ve yolakların netleştirilmesini destekler.
- Tarama: Güvenilir alt analizler için analize hazır, kontaminasyonu minimize edilmiş eDNA örnekleri sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı ve istatistiksel analizler için kantitatif tür tespit çıktıları sunar.
- Translasyonel Araştırma: Ekosistem sağlığı biyobelirteçleri ve non-invaziv izleme stratejileriyle uyumluluğu sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli sucul eDNA uygulamaları için yeniden kullanılabilir ve ölçeklenebilir bir protokol oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Ekolojik hedef doğrulamasında öngörü güvenini artırır ve belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: eDNA iş akışlarının standardizasyonunu, sterilitesini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Bilgilendirilmiş devam/durdur kararlarını ve sermaye açısından verimli analiz geliştirme süreçlerini destekler.
- Portföy Etkisi: Çevresel biyobelirteç ve analiz programlarının risk ayarlı önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Steril teknik ve moleküler ekoloji iş akışlarında uzmanlık gerektirir.
- Vakum filtrasyonu, inkübatörler ve santrifügasyon altyapısına erişim gerektirir.
- Numune taşıma ve etiketleme için ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Çeşitli sucul ortamlara ve numune hacimlerine uyarlanabilir.
- Doğrulanmış alt akış DNA saflaştırma ve analiz protokollerine bağımlıdır.
Biyofarma Sıkça Sorulan Sorular
Chapters in this video
0:05
Title
0:46
Assembly of the Filtration System
1:37
Filtration of Water Samples ≤4 L Using the Filter Cartridge
3:05
Filtration of Water Samples >4 L Using the Filter Cartridge
4:23
Extraction of eDNA from the Filter
6:57
Results: MiFish Metabarcoding of eDNA
7:23
Conclusion
