Name: Yağ Düzeylerinin Belirlenmesi A Yüzdürme tabanlı Yöntemi Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T11:15:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster L3 larvalarında yağ depolarını hızlı ve ekonomik bir şekilde taramak için yüzdürme tabanlı yöntemi. Bu teknik metabolizma ve obezite araştırmalarında genetik katkıları anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K.E.H. Moleküler Biyoloji Eğitim Bursu NIH-T32-GM08730 tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 ve AHA Award 12BGIA11930014 tarafından T.C. tarafından desteklenmiştir.

1. İlgi Genotiplerinde ile Sineklerin Gelen Yumurta Toplama NOT: İdeal haçlar 150 bakire sinek ve en az 75 erkek oluşur. Stok koleksiyonları en az 200 sinekler oluşmalıdır. <ol><li> üzüm tabak hazırlayın. <ol><li> 4 L&#39;lik bir şişede 1.5 L damıtılmış su ile 37.5 g agar ekleyin. </li><li> 121 ºC (250 ºF) 50 dakika süreyle otoklav su / agar karışımı. </li><li> Su / agar karışımı otoklavlama iken, 500 mi üzüm suyu için 50 g sükroz ilave ve sükroz çözünene kadar ısıtılmış bir karıştırma plakası üzerinde bir karıştırma çubuğu ile karıştırıldı. </li><li> Isı kapatın ve 70&#39;in altında ºC üzüm suyu / sakaroz karışımı soğutmak için karıştırma devam edin. bir alkol termometre ile iç sıcaklığını kontrol edin. </li><li> Üzüm suyu / sükroz karışımı ısınmaya bırakılmış ve çözünmesi için karıştırılmıştır (ör Tegosept) 3 g Drosophila anti-mantar maddesi ekleyin. </li><li> su / Agar karışım otoklav dışında olduğunda, şişeyi bazen dönen irtibatta soğumaya bırakın. </li><li&gt; Su / agar karışımı ve üzüm suyu / sakaroz karışımı birleştirin ve iyice karışık kadar karıştırın. </li><li> Küçük bir petri kabı (35 x 10 mm tarzı) kapak üzüm karışımı 10 ml - 8 eklemek için serolojik bir pipet kullanın. kapak duvarlarının yüksekliği dışbükey şekil oluşturmak için daha karışım yüksek taç izin verin. </li><li> üzüm plakaları 4 ° C&#39;de hava geçirmez bir kapta oda sıcaklığında 2 saat boyunca soğumaya ve daha sonra saklamanıza olanak sağlar. </li></ol></li><li> maya hamurunu hazırlayın. <ol><li> 50 ml konik bir tüp içinde 4 g canlı aktif kuru maya 6 ml fosfat tampon çözeltisi (PBS) ilave edin ve pürüzsüz hale gelene kadar bir spatül ile karıştırın. </li><li> Mağaza maya 4 ° C&#39;de yapıştırın. </li></ol></li><li> üzüm plakanın ortasına maya hamur küçük topak (yaklaşık 1/8 çay kaşığı) ekleyin. bir spatula ile herhangi bir pürüzlü kenarları pürüzsüz. </li><li> onlar ortam sıcaklığına ulaşana kadar bir kuluçka üzüm tabak yerleştirin. </li><li> bir yumurta toplama haznesi ve yer üzüm plaka w içine ilgi sinekler aktarınüstünde içe dönük i maya yapıştırın. Yumurta toplama haznesine bant üzüm plaka plaka dışarı düşmesine izin önlemek için. üzüm plaka altındaki önemli genotip ve tarih bilgilerini yazmak için emin olun. </li><li> sinekler üzüm plaka üzerinde yumurtalarını bırakmak için izin yumurta toplama haznesini upend. </li><li> Bir kutu yerleştirin veya yumurta toplama odaları üzerinde kapak ve 25 ºC bir kuluçka koyun. </li><li> 6 saat - sinekler 4 yumurtalarını bırakmak için izin verin. </li><li> Yumurta toplama odasının dışında üzüm plakasını alarak ve gıda onların şişenin içine geri sinekler aktararak toplama bitirin. üzüm plaka herhangi bir aşırı maya macunu temizlemek için bir spatula kullanın. 24 saat ~ 25 ° C&#39;de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde daha büyük bir petri tabağına deposu üzüm plakası. </li></ol> Deneysel Gıda 2. Aktarım Larvalar <ol><li> Deneysel yemek hazırlamak. NOT: Bu yemek tarifi Bloomington stok merkezi tarifi 18 dayanmaktadır. önemli değişikliklersahne dolaşıp zamanlaması ile değerlendirilen gıda besin değerini optimize etmek için maya miktarı artmış içerir (112 arası - 120 saat 25 ° C&#39;de yumurta toplandıktan sonra). sağlık ve deneysel larva gelişimi için bu tarifi doğru bulduk birlikte, herhangi bir gıda tarifi adım 3.10 listelenen örnekleri pozitif ve negatif kontroller, kabul edilebilir belirli bir kalibre edilmesidir. <ol><li> 1.600 mL distile su ölçün. </li><li> 134 g mısır unu, 10.6 gr Drosophila Agar tip II ve 1 L&#39;lik bir beher içinde suyun bir kısmı (~ 500 mi) karıştırın. Motorlu bir el mikseri ile 2 dakika boyunca karıştırın. </li><li> 70 g canlı aktif kuru maya, 18.4 g soya unu, 84.8 g malt özü, başka bir 1 L&#39;lik bir kap içinde bir miktar su (~ 500 mi) karıştırın. Motorlu bir el mikseri ile 2 dakika boyunca karıştırın. </li><li> her behere girdap ve 4 L&#39;lik bir şişeye dökün. beher yıkayın ve balona eklemek için kalan su kullanın. </li><li> döndürülerek karıştırılır, 140 ml hafif mısır şurubu ölçün ve balona ekleyin. &lt;/ Li&gt; <li> Sıvı ortamda 121 ºC (250 ºF) 50 dakika süreyle otoklav. </li><li> Otoklavlamadan sonra, 4 L&#39;lik bir beher içine gıda dökün ve soğumaya bırakın. motorlu el mikseri ile harmanlayarak soğutma sürecine yardımcı. </li><li> Şişe dokunun kadar soğuduktan sonra, 8.8 ml propiyonik asit ve 16.8 ml Drosophila mantar önleyici madde / etanol çözeltisi ilave edilir. İyice karıştırın. (Çözelti 70 ° C&#39;yi etmez emin, 380 g Drosophila mantar önleyici madde L 1-200 derece etanol eklenerek ve çözünene kadar sıcak bir plaka üzerinde karıştırıldı Drosophila mantar önleyici madde çözeltisi olun). </li><li> Gıda, yaklaşık 1 inç derin kadar şişe içine yiyecek dökün ve 2 için oda sıcaklığında soğumaya bırakın - 3 saat. 25 ºC &#39;de bir kuluçka şişeleri ve mağaza takın. Bir hafta içinde kullanın. </li></ol></li><li> Bunu skor gıda flakon üst tabakası içine bir spatula birkaç kez dalma. Bu yuva ve beslemek için larva yardımcı olacaktır. </li><li> 22-24 saat Yumurta toplama sahip sonrauçlu, aynı yaklaşık boyutu 50 birinci evre (L1) larvaları toplamak için küçük bir fırça kullanın. Deneysel Gıda larva yerleştirin. ve başka bir genotip devam etmeden önce fırça üzerinde kalan larvalar olmadığından emin mendil bir laboratuvar üzerinde fırça temizleyin. </li><li> 25 ºC bir kuluçka larva flakon yerleştirin ve geliştirmeye olanak sağlar. </li></ol> 3. Larva Fat Düzeylerinin Belirlenmesi <ol><li> çözümler hazırlayın. <ol><li> 1 L 10x PBS stok hazırlayın. <ol><li> Bir karıştırma çubuğu ihtiva eden bir 2 L&#39;lik bir kap içinde 800 ml suya 80 g NaCl, 2 g KCI, 14.4 g 2 Na HPO 4 ve 2,4 g KH 2 PO 4 ekleyin. Tüm tuzlar dahil kadar hiçbir ısı ile karıştırın. 7.4 pH değerini. su ile 1 L ses seviyesini artırmak. </li></ol></li><li> 2 L 1x PBS hazırlayın. 1800 ml su 200 ml 10 x PBS stok solüsyonu ekleyin. </li><li> % 20 / h sakaroz w yapmak için 1x PBS bu stok kullanın. </li></ol></li><li> gelen larvaların şişesini kaldır(Genellikle yumurta koleksiyonları beş gün sonra) flakonun tarafı yukarı dolaşıp 40 larva - inkübatör kez 20 vardır. Tarih ve saat tahlilinde hem de larvaları dolaşıp sayısını kaydeder. </li><li> 50 ml konik bir tüp 11.5 ml PBS ve 9 ml% 20 sukroz eklenerek deney çözeltisi hazırlayın. </li><li> Şişenin üst 1 inç - 0.5 olana kadar şişeye% 20 sukroz ekleyin. </li><li> yavaşça hala gıda burrowing serbest larva gıda üst tabakası karıştırmaya bir spatula kullanın. Bütün larvalar sukroz çözeltisi yüzeyine yükselir. </li><li> yavaşça adım 3,3 başlangıçtaki sakaroz konsantrasyonu larvaları aktarmak için forseps kullanabilir. </li><li> nazikçe bu çözüm larvaları karıştırmak için bir spatula kullanın. </li><li> konik tüp Cap ve iyice çözüm karıştırmak için birkaç kez upend. </li><li> konik tüp kapağını açmak ve nazik bir vorteks oluşturmak için girdap. </li><li> ya solüsyon veya si üstüne kayan, larva yerleşmek için izinalt yanaşma. Larvalar yerleşmek için 5 dakika - 2 bekleyin. NOT: Her iki yüzen veya batan kesinlikle değil larva hala varsa, bir şamandıraya veya platin ya da larva etiketlemek için bir eşik noktası olarak kullanmak için bir hattı almak. tüm genotipleri, bu aynı kriter uygulayın. Biz 19 mutantları tahlilin kalibrasyonu için bir negatif kontrol olarak kullanılabilecek bir pozitif kontrol ve lsd2 olarak kullanılabilir eden sınır. ADP ya da SiR2 17 mutan larva olarak konik tüp altındaki açı kullanılır. </li><li> yüzen larva sayısı ve test spesifik konsantrasyon kaydedin. </li><li> yoğunluğunu artırmak için deney solüsyonuna 1 mi,% 20 sükroz ekleyin. </li><li> Tekrarlayın 3,10 3.7 adımları tekrarlayın. yüzen larva sayısı ve bu yeni konsantrasyon kaydedin. </li><li> larvaların en az% 95 yüzen kadar adımları 3.12 ve 3.13 devam edin. </li><li> PBS ile dolu bir diseksiyon çanak içine tüm larvaların toplamak için forseps kullanabilir. </li><li> obsHerhangi bir küçük larva, pupa öncesi, pupa veya genotipler arasında başka bir fark olup olmadığını bir mikroskop ve not altında erve larvaları. NOT: İdeal olarak, tüm larva homojen ve aynı gelişim aşamasında görünmelidir. Sadece bu koşullar altında uygun yağ ölçümleri gözlenmiştir. </li><li> larvaların toplam numarasını kaydedin. </li><li> forseps kullanarak, kuru mendil, bir laboratuara 10 larva transferi. Bir ependorf tüp Etiket ve tüp içinde 10 larva yerleştirin. </li><li> Sıvı nitrojen içinde larvaları dondurma. -20 ° C&#39;de tüp saklayın. </li></ol>

<ol><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+the+golden+bug%2C+emerges+as+a+tool+for+human+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li>
<li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+in+Drosophila+development+and+disease+Using+Drosophila+System+to+Study+Lipid+Metabolism+Lipids+Function+in+Drosophila+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).</li>
<li>Ruden, D. M., Lu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+conservation+of+metabolism+explains+howDrosophila+nutrigenomics+can+help+us+understand+human+nutrigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Nutr%22%5BJournal%5D)">Evolutionary conservation of metabolism explains howDrosophila nutrigenomics can help us understand human nutrigenomics.</a> Genes Nutr. 1 (2), 75-84 (2006).</li>
<li>Wolf, M. J., Rockman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila%2C+genetic+screens%2C+and+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Drosophila, genetic screens, and cardiac function.</a> Circ. Res. 109, 794-806 (2011).</li>
<li>Trinh, I., Boulianne, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+obesity+and+its+associated+disorders+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling obesity and its associated disorders in Drosophila.</a> Physiology (Bethesda). 28 (2), 117-124 (2013).</li>
<li>Azeez, O. I., Meintjes, R., Chamunorwa, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+body%2C+fat+pad+and+adipose+tissues+in+invertebrates+and+vertebrates%3A+the+nexus%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Fat body, fat pad and adipose tissues in invertebrates and vertebrates: the nexus.</a> Lipids Health Dis. 13, 71(2014).</li>
<li>Dourlen, P., Sujkowski, A., Wessells, R., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+transport+proteins+in+disease%3A+New+insights+from+invertebrate+models%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid transport proteins in disease: New insights from invertebrate models.</a> Prog. Lipid Res. 60, 30-40 (2015).</li>
<li>Hildebrandt, A., Bickmeyer, I., Kühnlein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+Drosophila+body+fat+quantification+by+a+coupled+colorimetric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliable Drosophila body fat quantification by a coupled colorimetric assay.</a> PLoS One. 6 (9), e23796(2011).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68, 105-115 (2014).</li>
<li>Al-Anzi, B., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+measurement+of+triglycerides+cannot+provide+an+accurate+measure+of+stored+fat+content+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Colorimetric measurement of triglycerides cannot provide an accurate measure of stored fat content in Drosophila.</a> PLoS One. 5 (8), e12353(2010).</li>
<li>Thanh, N. T. K., Stevenson, G., Obatoml, D., Bach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Lipids+in+Animal+Tissues+by+High-Performance+Thin-Layer+Chromatography+with+Densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Planar+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Determination of Lipids in Animal Tissues by High-Performance Thin-Layer Chromatography with Densitometry.</a> J. Planar Chromatogr. 13, 375-381 (2000).</li>
<li>Borrull, A., Lopez-Martinez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 117, 274-280 (2015).</li>
<li>Shui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+one+step+analysis+of+cellular+lipidomes+using+liquid+chromatography+coupled+with+mass+spectrometry%3A+application+to+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Toward one step analysis of cellular lipidomes using liquid chromatography coupled with mass spectrometry: application to Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe lipidomics.</a> Mol. Biosyst. 6, 1008-1017 (2010).</li>
<li>Farvid, M. S., Ng, T. W. K., Chan, D. C., Barrett, P. H. R., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+adiponectin+and+resistin+with+adipose+tissue+compartments%2C+insulin+resistance+and+dyslipidaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes.+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Association of adiponectin and resistin with adipose tissue compartments, insulin resistance and dyslipidaemia.</a> Diabetes. Obes. Metab. 7 (4), 406-413 (2005).</li>
<li>Urbanchek, M. G., Picken, E. B., Kalliainen, L. K., Kuzon, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+force+deficit+in+skeletal+muscles+of+old+rats+is+partially+explained+by+the+existence+of+denervated+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Specific force deficit in skeletal muscles of old rats is partially explained by the existence of denervated muscle fibers.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56A (5), B191-B197 (2001).</li>
<li>Mosher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+between+Drosophila+Arc1+and+a+specific+population+of+brain+neurons+regulates+organismal+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordination between Drosophila Arc1 and a specific population of brain neurons regulates organismal fat.</a> Dev. Biol. 405 (2), 280-290 (2015).</li>
<li>Reis, T., van Gilst, M. R., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+buoyancy-based+screen+of+drosophila+larvae+for+fat-+storage+mutants+reveals+a+role+for+Sir2+in+coupling+fat+Storage+to+Nutrient+Availability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A buoyancy-based screen of drosophila larvae for fat- storage mutants reveals a role for Sir2 in coupling fat Storage to Nutrient Availability.</a> PLoS Genet. 6 (11), e1001206(2010).</li>
<li>Current Bloomington Recipe for Drosophila Medium. , Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University. Available from:
 <a target="_blank" href="http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm">http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm</a> (2014).</li>
<li>Teixeira, L., Rabouille, C., Rørth, P., Ephrussi, A., Vanzo, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Perilipin%2FADRP+homologue+Lsd2+regulates+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Drosophila Perilipin/ADRP homologue Lsd2 regulates lipid metabolism.</a> Mech. Dev. 120 (9), 1071-1081 (2003).</li>
<li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+13C+Isotope+Labeling+Strategy+Reveals+the+Influence+of+Insulin+Signaling+on+Lipogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">A 13C Isotope Labeling Strategy Reveals the Influence of Insulin Signaling on Lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

10 - lipit düzeyleri 8 ölçmek için geliştirilmiş olan teknikler çok sayıda bulunmaktadır. Ancak, bu yöntemlerin her biri yukarıda özetlenen yüzdürme-bazlı deney ile ele bazı önemli dezavantajları ile birlikte geliyor. İlk olarak, bu deney, son derece hızlıdır. 60 dk - tam bir konsantrasyon gradyanı test fazla 30 sürer. Bu, şu anda kullanılmakta olan tekniklerin en çok büyük bir gelişmedir. bunları analiz etmek lipidler ve başka birkaç saat izole etmek için 9 saat - örneğin, MS ile lipit ...

Drosophila melanogaster genetik ve diğer temel biyolojik soruların çalışmada bir yüzyılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Drosophila birçok insan hastalıklarının çalışmada güçlü bir araç olduğunu son birkaç on yıl içinde, bu netlik kazanmıştır. İnsan hastalıklarıyla bağlantılı genlerin% 80 bir tanımlanmış uçucu ortologu 1 etmek - - 70 de 4, Drosophila kompleks hastalıkların çalışma için basitleştirilmiş yapılmamış çevrilebilir bir sistem sağlar. Özellikle Metabolizma böyle çalışmaya yararlanmıştır. Sadece iyi uçar ve insanlar arasında korunmuş metabolizmanın genetik olarak, ama ilgili organ ve hücre tipleri, aynı zamanda 2,5 çok benzerdir. Örneğin, memeli karaciğer ve beyaz yağ dokusunda 6 yapılanlar hem triasilgliseridler (TAG) ve glikojen, fonksiyonlar benzer sinek mağazaların vücut yağ. Insan obezite için bir model olarak Drosophila kullanarak büyük ölçüde lipit anlayışımızı geliştirdimetabolizma ve obezite 7 genetiği. gelişme larva bu besleme adanmış ve enerji depolama pupariation sırasında kullanılmak üzere depolama veya kullanım besin ayrılmasını çalışmak için özellikle yararlıdır. Şu anda, Drosophila yağ depolama düzeylerinin belirlenmesi birçok farklı sayısal yöntemler vardır. En yaygın olarak kullanılan yöntem birleştiğinde kolorimetrik (CCA) 8,9 olduğunu. CCA İnsan serumundaki TAG düzeylerinin belirlenmesi için geliştirilmiş ve sonunda renkli bir ürün üreten bir redoks-bağlanmış reaksiyonda elde edilen çeşitli reaksiyonlara tabi olacak trigliseritlerin omurgasından serbest gliserol öncül faaliyet göstermektedir. ışığının belirli dalga boyu Absorbans, gliserol mevcut başlangıç ​​miktarını belirlemek için ölçülür. Bununla birlikte, gliserol da TAG ilave olarak mono- ve diasilgliseridler serbest bırakılabilir ve bu nedenle, S doğru bir göstergesi olabilirizlenmekte vücut yağ 9. Ayrıca, ezilmiş yetişkin sineklerin göz pigmenti bazı absorbans okumaları müdahale ve sonuçları 9,10 karmaşık hale getirebilir. Bu nedenle, CCA eşlik yoğunluk 10,11 nicelendirilebilir en lipit ailelerinin ayrılmasını sağlar, ince tabaka kromatografisi (TLC) ile doğrulanması gerekir. Ancak, steroller gibi bazı lipit sınıfları analiz edilemez ve farklı bir şekilde 12 sayısal olmalıdır. Kütle spektrometrisi (MS) önemli hücresel lipidlerin 12,13 bütün sınıfları ölçmek için doğru bir yöntemdir. Ancak, MS tarafından analiz için gerekli lipid çıkarma prosedürleri hem zaman alıcı (çoğu almayı neredeyse bir tam gün) ve yüksek maliyetlidir. Burada hızlı ve ucuza Drosophila melanogaster L3 larvaları organizma yağ düzeylerini belirlemek için alternatif bir yöntem mevcut. Aşağıda sunulan yöntem yağ dokusu ve yağsız doku arasındaki yoğunluk farkı patlatır. memeli faT hücre 1.06 g / ml, 15 yoğunluğunda olarak, yaklaşık 0.9 g / ml 14 ise, iskelet kası bir yoğunluğa sahiptir. Bu fark, yağ yüksek mağaza hayvanlar onları sabit yoğunluklu bir çözelti içinde daha iyi bir yüzer sağlayacak yağ alt mağazalar, hayvanların daha düşük bir yoğunluğa sahip olacağı anlamına gelir. Bu özellik, pahalı olmayan ve invazif olmayan hem de olan Hayvanların büyük sayıda son derece hızlı taranması için izin verir. Yüzdürme tabanlı analiz yanı sıra obezitenin 16,17 yeni genetik ve nörolojik düzenleyiciler tanımlamak için yağ seviyelerinin bilinen düzenleyicileri değiştiren fenotipleri onaylamak için ikisi de kullanılır olmuştur.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Welch'in Orijinal %100 Üzüm Suyu Sükroz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>S512</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-259</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>200 kanıt</td></tr><tr><td>Ekmek mayası</td><td>Fleichmann's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow Mısır Unu</td><td>Quaker</td><td></td><td>Zenginleştirilmiş degerminated</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Tip II</td><td>Apex</td><td>66-104</td><td></td></tr><tr><td>Soya Unu</td><td>ADM Özel Malzemeler</td><td>062-100</td><td></td></tr><tr><td>Malt Özü</td><td>Breiss</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Hafif Mısır Şurubu</td><td>Karo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propiyonik Asit</td><td>VWR</td><td>U330-09</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher</td><td>50147491</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat susuz</td><td>Fisher</td><td>S3933</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher</td><td>P330-500</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm petri plakası</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Konik Fisher</td><td>50-869-569</td><td></td></tr></tbody></table>

yağ düzeylerinin belirlenmesi a yüzdürme tabanlı yöntemi<em&gt; drosophila</em

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Drosophila melanogaster, yağ regülasyonu çalışmasında önemli bir deneysel sistemdir. Şu anda Drosophila'da depolanmış yağ seviyelerini ölçmek için çok sayıda teknik mevcuttur, ancak çoğu pahalı ve / veya zahmetlidir ve açık sınırlamaları vardır. Burada, L3 Drosophila larvalarında organizma yağ seviyelerini hızlı ve ucuz bir şekilde belirlemek için bir yöntem sunuyoruz. Teknik, yağ ve yağsız dokular arasındaki yoğunluk farklılıklarına dayanır ve yağ ve yağsız fenotiplerin hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Bu yöntemin doğruluğunu, nötr lipid ekstraksiyonu ve kütle spektrometresi (GCMS) ile birleştirilmiş gaz kromatografisi ile belirlenen vücut yağ yüzdesi ile karşılaştırarak doğruladık. Ayrıca, larvaların toplanması ve senkronizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra ilgili deneysel tarifleri de özetliyoruz. Aşağıda sunulan teknik, en yaygın kullanılan lipid kantitasyon yöntemlerindeki büyük eksikliklerin üstesinden gelir ve larvaların bütünlüğünü korurken L3 larvalarını yağ düzenleme fenotipleri için hızlı ve hassas bir şekilde taramak için güçlü bir yol sağlar. Bu test, Drosophila kullanılarak metabolizma ve yağ regülasyonu çalışmaları için geniş uygulamalara sahiptir.

Şekil 1 canlılık bazlı analiz genetik manipüle larva hem yüksek ve düşük yağ depolarını algılayabilir nasıl bir örnek temsil eder. Şekil 1A larva beyindeki nöronların belirli bir alt kümesi (E347) bu uyarma veya susturulması gösterir uyarır alt ve üst yağ sırasıyla saklar. Aynı genetik arka plan kontrolü her iki durumda da kullanılmıştır. 1B yoğunluk deneyi ile elde edilen bu fenotip GCMS ile nötral lipid çıkarma ve ölçümü pekiştirilmişt...

Burada üçüncü instar (L3) Drosophila melanogaster larva evresi içinde organizma yağ seviyelerini ölçmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, değişmiş yağ mağazaları ile larva ayırt etmek için yağ dokusunun nispeten düşük yoğunluğa patlatır. Yüzdürme-tabanlı analiz, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik tarama için değerli bir araçtır.

Yağ Düzeylerinin Belirlenmesi A Yüzdürme tabanlı Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

Bu analizinin genel amacı, genetikteki değişiklikler, diyet veya tedavi nedeniyle meydana gelebilecek yağ depolama seviyelerindeki herhangi bir değişikliği belirlemektir. Bu yöntemler, obezite yatkınlığına yönelik genetik veya nöronal katkılar gibi metabolizma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, şu anda kullanılan diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında hızlı, ekonomik ve oldukça tekrarlanabilir olmasıdır.Bu yönteme veya gezici evre larva ile çalışmaya yeni başlayan kişiler, farklı genotiplerin gelişim süreçlerinin oldukça değişken olabilmesi nedeniyle bu protokolde zorluk yaşayabilirler. Bu prosedüre başlamak için, bir ızgara plağının ortasına küçük bir miktar maya macunu ekleyin. Varsa pürüzlü kenarları bir spatula yardımıyla düzeltin.Ardından, ilgili sinekleri bir yumurta toplama haznesine aktarın ve üzerine, maya pastası bulunan ızgaralı plakayı içe bakacak şekilde yerleştirin. Daha sonra, ızgaralı plakanın düşmesini önlemek için onu yumurta toplama haznesine bantlayın. Izgaralı plakanın altına önemli genotip ve tarih bilgilerini yazdığınızdan emin olun.Ardından, sineklerin ızgara plakasına yumurta bırakmalarını sağlamak için yumurta toplama haznesini ters çevirin. Daha sonra, yumurta toplama haznesini açık bir kutuyla kapatın ve sineklerin yumurta bırakmasına izin vermek için kapatılmış yumurta toplama haznesini 25 °C sıcaklıktaki bir inkübatöre dört ila altı saatliğine yerleştirin. İşlem tamamlandığında, ızgara plakasını yumurta toplama haznesinden çıkarın ve sinekleri orijinal besin şişelerine geri aktarın.Izgara plaka üzerindeki fazla maya macununu temizlemek için bir spatula kullanın. Ardından, ızgara plakayı daha büyük bir Petri kabı içerisinde, nemlendirilmiş bir inkübatörde 25 degrees celsius sıcaklıkta 24 saat boyunca saklayın. Bu prosedürde, larvaların içine girmesini ve beslenmesini sağlamak için gıdanın üst tabakasına spatula ile birkaç kez bastırarak çizikler oluşturun.Yumurta toplama işleminden 22 ila 24 saat sonra, yaklaşık olarak aynı boyutta olan 50 adet birinci instar larvayı toplamak için küçük bir boya fırçası kullanın ve larvaları deneysel besin şişesine yerleştirin. Yaklaşık olarak aynı boyuttaki larvaların seçilmesi ve deneysel besine aktarılması çok önemlidir. Bu, larval gelişiminin sıkı bir şekilde koordine edilmesini sağlayacaktır.Ardından, boya fırçasını bir laboratuvar mendili ile temizleyin ve başka bir genotipe geçmeden önce fırça üzerinde larva kalmadığından emin olun. Sonrasında, larva tüpünü 25 °C sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin ve gelişimlerine izin verin. Tüpün kenarlarında 20 ila 40 larvanın gezindiğini gördüğünüzde, larva tüpünü inkübatörden çıkarın.Analizin tarihini ve saatini ve ayrıca gezen larva sayısını kaydedin. Ardından, 50 mililitrelik konik bir tüpe 11,5 mililitre PBS ve dokuz mililitre %20 sükroz ekleyerek deneysel çözeltiyi hazırlayın. Flakonun üst kısmından bir inç mesafe kalana kadar flakona %20 sükroz ekleyin.Hala içinde gömülü olan larvaları serbest bırakmak için bir spatula kullanarak gıdanın üst tabakasını nazikçe karıştırın. Tüm larvalar sükroz çözeltisinin yüzeyine çıkacaktır. Ardından, larvaları nazikçe başlangıç sükroz çözeltisine aktarın ve hafifçe karıştırın.Larvaları deneysel çözeltiye aktarırken, larvaları sıkmamaya veya delmemeye dikkat edin. Bu durum analiz sonuçlarını değiştirebilir. Konik tüpün kapağını kapatın ve çözeltiyi iyice karıştırmak için tüpü birkaç kez alt üst edin.Ardından konik tüpün kapağını açın ve hafif bir vorteks oluşturmak için tüpü dairesel hareketlerle sallayın. Larvaların ya çözeltinin üstüne çıkması ya da dibe çökmesi için iki ila beş dakika bekleyin. Yüzen larva sayısını ve test edilen spesifik sakkaroz konsantrasyonunu kaydedin.Ardından, yoğunluğunu artırmak için deney çözeltisine 1 mL %20 sukroz ekleyin. Sonrasında, larvaları nazikçe karıştırmak için bir spatula kullanın. Bunu takiben, konik tüpün kapağını kapatın ve çözeltiyi iyice karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.Ardından, konik tüpün kapağını açın ve hafif bir vorteks oluşturmak için tüpü dairesel şekilde sallayın. Yüzen larva sayısını ve yeni konsantrasyonu kaydedin. Larvaların en az %95'i yüzene kadar bu işleme devam edin.Konik tüpe, üstten bir inç boşluk kalacak şekilde %20 sükroz ekleyin. Ardından, tüm larvaları PBS ile doldurulmuş bir diseksiyon kabında toplayın. Prosedürlerin uygun şekilde gerçekleştirildiğinden emin olmak için larvaları mikroskop altında inceleyerek küçük larvalar, prepupalar, pupalar veya genotipler arasında herhangi bir fark olup olmadığını kontrol edin.Ardından toplam larva sayısını kaydedin. Sonrasında, kurutulmaları için 10 larvayı bir laboratuvar mendiline aktarın. Bir mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin ve larvaları tüpe yerleştirin.Ardından, larvaları sıvı azotla hızlıca dondurun ve tüpü -20 °C'de saklayın. Burada, kaldırma kuvvetine dayalı analiz yönteminin, genetik olarak manipüle edilmiş larvalarda hem daha yüksek hem de daha düşük depolanmış yağı nasıl tespit edebileceğine dair bir örnek gösterilmektedir. Bu şekil, larval beyindeki belirli bir nöron alt kümesinin uyarılmasının veya susturulmasının, sırasıyla daha düşük ve daha yüksek depolanmış yağı tetiklediğini göstermektedir.Her iki durumda da aynı genetik arka plan kontrolü kullanılmıştır. Burada, yoğunluk analizi ile elde edilen bu fenotipin, nötral lipid ekstraksiyonu ve GCMS ile miktar tayini yoluyla nasıl doğrulandığına dair bir örnek verilmiştir. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde 30 dakika içinde tamamlanabilir ve diğer genotiplerle eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir.Bu prosedürü uygularken, deneysel larvaların gelişimlerini mümkün olduğunca senkronize etmeyi hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından larvalar, larvalardaki spesifik lipid tipi sınıfları gibi ek bilgiler elde etmek amacıyla gaz kromatografisi kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemlerde kullanılmak üzere sıvı azot ile hızlıca dondurulabilir. Bu teknik, geliştirilmesinin ardından, metabolizma alanındaki araştırmacıların Drosophila'da obeziteye yönelik genetik ve/veya nöronal katkıları keşfetmelerine zemin hazırlamıştır.Bu videoyu izledikten sonra, depolanmış yağ seviyelerindeki değişimler için genotiplerin nasıl hızlıca taranacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-buoyancy-based-method-of-determining-fat-levels-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, sinek hareketini ölçmek için basit bir yöntemi açıklar ve gerçekleştirilen tırmanma testini gösterir. Sinek tırmanma testi, negatif bir jeotaksi tepkisine dayanan genel bir motor fonksiyon testidir.

Sinek Tırmanma Deneyi: Drosophila melanogaster'de Genel Hareketi Test Etmek İçin Bir Yöntem

Bilim adamları, farklı deneysel koşulların sineklerin ömrünü nasıl etkilediğini ölçmek ve deneysel sonuçları ölçmek için süreçte hayatta kalma eğrileri oluşturmak için Drosophila yaşam süresi protokolünü kullanır. Numune protokolü, değişen konsantrasyonlarda endokrin bozucu kimyasallara veya 17-α-etinilestradiol (EE2) gibi EDC'lere maruz kalmanın uzun ömür üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanan testi içerir.

Drosophila melanogaster için Yaşam Süresi Protokolü: Sinek Uzun Ömürlülüğündeki Farklılıkları Belirlemek için Hayatta Kalma Eğrileri Oluşturma

Drosophila melanogaster uzun ömürlü düzenleme moleküler temelini keşfetmek için güçlü bir model organizmadır. Bu protokol bir tekrarlanabilir, uzun ömürlü yanı sıra potansiyel tuzaklar nüfus tabanlı ölçme ve bunlardan kaçınmanın yolları üreten katılan adımları görüşecek.

In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Burada yüksek verimli tarama sağlayan, Drosophila uçuş performans hızlı ve doğru bir ölçümü için bir yöntem tarif eder.

Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Gelişmekte olan embriyoya Drosophila küçük moleküllerin giriş yeni bileşikler, ilaçlar, toksinler ve biyolojik aktivitesini karakterize edici hem de temel geliştirme yolunu tarama için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Açıklanan yöntemler burada Drosophila embriyo modelin programını genişleterek, bu yaklaşımın doğal engelleri aşmak adımları özetlemektedir.

Geçirgenliği için bir yöntem<em&gt; Drosophila</emKüçük Molekül Faaliyet Tahliller için&gt; Embriyolar

Hipoksi normal atmosferik oksijen düzeyleri altında karşılaşan Drosophila melanogaster larva tanımlamak için basit bir tahlil protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı tembellik veya yavaş büyüme gibi örtüşen fenotipleri göstermek başka mutantlar dan ayırt edici olmak hipoksik larva sağlar.

Bir oyuk/tünel tahlil için algılama hipoksi Drosophila melanogaster larva içinde

Bu protokol, Drosophila'nın embriyodan yetişkine kadar her gelişim aşamasındaki canlılığını değerlendirmek için tasarlanmıştır. Yöntem, farklı genotiplerin veya büyüme koşullarının canlılığını belirlemek ve karşılaştırmak için kullanılabilir.

Drosophila Melanogaster'In Embriyodan Yetişkine Canlılığını Değerlendirmek Için Doğrudan ve Basit Bir Yöntem

Drosophila alkol duyarlılığını ölçmek için geçerli yöntemler sinek grupları test etmek için tasarlanmıştır. Çok sayıda tek sinekte alkol sedasyon hassasiyetini değerlendirmek için basit, düşük maliyetli, yüksek iş çıkışlı bir çalışma salıyoruz. Yöntem özel araçlar gerektirmez ve ortak malzemeler kullanılarak herhangi bir laboratuvarda yapılabilir.

Bireysel Drosophila melanogaster Alkol Sedasyon Süresini Ölçmek için Yüksek İşLenme Yöntemi

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Öğrenin Drosophila melanogaster L3 larvalarında yağ depolarını hızlı ve ekonomik bir şekilde taramak için yüzdürme tabanlı yöntemi. Bu teknik metabolizma ve obezite araştırmalarında genetik katkıları anlamaya yardımcı olur.

Yağ Düzeylerinin Belirlenmesi A Yüzdürme tabanlı Yöntemi

Daha fazla video keşfet