Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, aynı peptoid dizisi içinde hem lizin hem de arginin tipi monomerleri tanıtmak ve bu bileşiklerin, ihmal edilen tropikal hastalık kutanöz leishmaniasis'in nedensel parazitleri olan Leishmania mexicana'ya karşı aktivitesini değerlendirmektir. Kutanöz leishmaniasis için yeni terapötiklere acilen ihtiyaç duyulmaktadır ve bu prosedür, peptoidlerin bu ihmal edilen tropikal hastalık için yeni bir potansiyel anti-enfektifler sınıfı olarak tanımlanmasına ve geliştirilmesine yardımcı olabilir. Bu protokolün temel avantajı, karışık katyonik işlevsellik içeren peptoidlerin sentezlenebilmesidir.

Bu, dizilerin biyolojik aktivitelerini modüle etmeye yardımcı olabileceği için oldukça arzu edilir. Bu, parazitin memeli formuna karşı test yapsa da, Leishmania mexicana'nın böcek aşamasına karşı da kullanılabilir veya memeli hücre hatlarına uygulanabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi gerçekten yararlıdır çünkü sentezin aşamalı doğasını ve ayrıca Leishmania mexicana'nın yaşam döngüsünün çeşitli noktalarındaki parazit kültürünü gösterir.

Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi dimetilformamid içinde çözeltiler hazırlayın. Ardından, iki fritli kapaklı 20 mililitrelik bir polipropilen reaksiyon kabına 0.1 milimol Fmoc korumalı rink amid reçinesi ekleyin. Beş mililitre dimetilformamid ekleyin ve kabı oda sıcaklığında 60 dakika bekletin.

Ardından, katı faz ekstraksiyon vakum platformu kullanarak DMF'yi boşaltın. Daha sonra, iki mililitre hazırlanmış piperidin çözeltisi ekleyin. Kabı oda sıcaklığında 450 RPM'de bir çalkalayıcı platformuna yerleştirin ve beş dakika çalkalayın.

Vakum istasyonunu kullanarak çözeltiyi boşaltın. Daha sonra iki mililitre piperidin solüsyonu ekleyin ve aynı koşullarda 15 dakika çalkalayın. Çalkalama tamamlandıktan sonra, çözeltiyi bir vakum istasyonu aracılığıyla boşaltın.

İki mililitre DMF ekleyin ve reçineyi yıkamak için 30 saniye karıştırın. DMF'yi boşaltın ve yıkamayı üç kez tekrarlayın. Submonomer sentezine başlamak için, bir mililitre hazırlanmış bromoasetik asit çözeltisi ve 0.2 mililitre hazırlanmış DIC çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında 20 dakika çalkalayın. Ardından, çözeltiyi boşaltın ve her seferinde iki mililitre DMF kullanarak üç kez yıkayın. Bir mililitre hazırlanmış amin çözeltisi ekleyin.

Daha sonra reçineyi oda sıcaklığında 60 dakika çalkalayın. Solüsyonu boşaltın ve reçineyi her seferinde iki mililitre DMF kullanarak üç kez yıkayın. Ardından, bir mililitre bromoasetik asit çözeltisi ve 0.2 mililitre DIC çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında 20 dakika çalkalayın. Ardından, çözeltiyi boşaltın ve her seferinde iki mililitre DMF kullanarak üç kez yıkayın. Guanidin ile işlevselleştirilmiş bir monomer eklemek için, reçineye bir mililitre korumasız diamin çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında 60 dakika çalkalayın. Daha sonra çözeltiyi boşaltın ve reçineyi iki mililitre DMF ile üç kez yıkayın. 0.5 mililitre hazırlanmış 2-asetil dimedon çözeltisi ekleyin.

Oda sıcaklığında 60 dakika çalkalayın. Daha sonra çözeltiyi boşaltın ve reçineyi iki mililitre DMF ile üç kez yıkayın. İstenilen dizi elde edilene kadar submonomer sentezine devam edin.

Daha sonra, dört mililitre hazırlanmış hidrazin çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında üç dakika çalkalayın. Solüsyonu boşaltın ve üç kez tekrarlayın. Ardından, her yıkama için iki mililitre DMF kullanarak reçineyi üç kez yıkayın.

Peptoid dizisindeki serbest amin başına DIPEA ve altı eşdeğer pirazol-1-karboksamidin ekleyin. Oda sıcaklığında 60 dakika çalkalayın. Çalkalama tamamlandıktan sonra çözeltiyi boşaltın.

Her yıkama için iki mililitre diklorometan kullanarak reçineyi üç kez yıkayın. Reçineyi 10 dakika havayla kurutun ve ileride kullanmak üzere saklayın. Sentezin ilerlemesini kontrol etmek için amin ilavelerinden sonra bir test parçalama gerçekleştirilebilir.

Son bölünmeye başlamak için, sentez için kullanılan aynı fritlenmiş reaksiyon kartuşuna dört mililitre bölünme kokteyli ekleyin ve kabı kapatın. Oda sıcaklığında 90 dakika çalkalayın. Daha sonra fritlenmiş reaksiyon kabını kullanarak, bölünme kokteylini reçineden yuvarlak tabanlı bir şişeye süzün.

Döner bir buharlaştırıcı kullanarak bölünme kokteylini buharlaştırın. Peptoidi çökeltmek için iki mililitre susuz dietil eter ekleyin. Bir pipet kullanarak dietil eteri çıkarın ve atın.

Ardından, dietil eter çökeltmesini üç kez tekrarlayın. Çökeltme tamamlandıktan sonra, ham peptoidi 10 mililitre hazırlanmış asetonitril ve asitleştirilmiş su çözeltisi içinde çözün. Önceden tartılmış bir kaba aktarın.

Daha sonra eksi 20 santigrat derecede dondurun ve ters fazlı HPLC ile saflaştırmaya hazır kuru bir toz haline liyofilize edin. Leishmania mexicana parazitlerini kültürledikten ve aksenik amastigot aşamasına dönüştürdükten sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi bileşik stok çözeltileri hazırlayarak sitotoksisite testine başlayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi 96 oyuklu bir plakanın üst sırasına iki mikrolitre beş milimolar peptoid stok çözeltisi, amfoterisin B kontrolü ve DMSO kontrolü ekleyin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak üst sıraya 48 mikrolitre taze orta malzemesi ekleyin. Diğer tüm sıralara 25 mikrolitre taze orta malzemesi ekleyin. Ardından, üst sıradan 25 mikrolitre çözelti pipetleyerek, aşağıdaki sıraya ekleyerek ve karıştırarak seri bir seyreltme gerçekleştirin.

Alt sıradan pipetlenen son 25 mikrolitreyi atarak tüm plaka için seyreltmeleri tekrarlayın. Ardından, bir parazit kültürünü 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. 447 kez g'de beş dakika santrifüjleyin.

Eski ortamı dökün ve 10 mililitre taze ortam ekleyin. Daha sonra bir pipet kullanarak, yeni ortamdaki parazit peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Neubauer geliştirilmiş bir hemositometre kullanarak sayın ve kültürü mililitre başına sekiz milyon parazite seyreltin.

Kültür seyreltildikten sonra, her oyuğa 25 mikrolitre parazit ekleyin. Plakayı 32 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, her kuyucuktan 40 mikrolitre çözelti çıkarın.

Her oyuğa 90 mikrolitre taze ortam ekleyin ve 24 saat boyunca 32 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, her bir oyuğa 10 mikrolitre resazurin bazlı hücre canlılığı çözeltisi ekleyin. Dört saat boyunca 32 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyon tamamlandıktan sonra, floresansı ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın. Ortalama arka planı kaldırarak ve normalizasyondan sonra kuyuların floresansını DMSO kontrollerine rezeksiyon ile karşılaştırarak verileri analiz edin. Bu çalışmada, her biri 120 miligram rink amid reçinesi kullanılarak iki peptoid sentezlenmiştir.

Ürünler, ters fazlı yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile saflaştırılır ve hedef kütleye karşılık gelen fraksiyonlar birleştirilerek beyaz tozlar halinde elde edilir. İki peptoid için toplanan miktar, %90'ın üzerindeki saf fraksiyonlar için yaklaşık% 30'luk verimlerle burada gösterilmiştir. Ürün saflığı, analitik bir ters fazlı HPLC kullanılarak değerlendirilir ve amid omurgasının emilimi olan 220 nanometrede görselleştirilir.

Peptoidlerin her ikisinin de homojen olduğu görülmektedir. L Mexicana'ya karşı sitotoksisite testlerinin temsili sonuçları burada gösterilmektedir. Bileşiklerin beş milimolar stok çözeltileri, hücre kültürü dereceli DMSO'da yapılır ve sağlam veriler sağlamak için en az iki kez üç kopya halinde test edilir.

Peptoid B'nin, her ikisinin de doza bağlı bir etkiye sahip olduğu canlı parazitlerin yüzdesini azaltmada peptoid A'dan daha etkili olduğu görülebilir. Bu yöntemi izledikten sonra, hem lizin tipi hem de arginin tipi monomerler içeren peptoidlerin nasıl sentezleneceğini, karakterize edileceğini ve saflaştırılacağını ve bunların Leishmania mexicana'ya karşı sitotoksisite deneylerinde nasıl kullanılacağını iyi anlamalısınız. Peptoidlere ikili katyonik işlevsellik ekleme yöntemimiz, yaygın olarak kullanılan peptoid sentezi submonomer yöntemine yalnızca bir ekstra basit adım ekler.

Bu yöntemi takiben, örneğin iki ila altı karbon uzunluğundaki yan zincirlerle kütüphane çeşitliliğini artırmaya yardımcı olmak için farklı uzunluklarda lizin veya arginin tipi alt monomerler eklenebilir. Peptoid sentezini denerken, istenmeyen ekleme veya silme ürünlerini önlemek için reçineyi adımlar arasında iyice yıkamayı unutmamak gerçekten önemlidir. Bu yöntem, araştırmacıların karışık katyonik olarak işlevselleştirilmiş peptoidlerin biyolojik aktivitesini keşfetmelerinin ve bu aktiviteyi yalnızca lizin veya arginin tipi monomerler içerenlerle karşılaştırmalarının yolunu açmaktadır.

Son olarak, bu protokolde kullanılan parazitlerin ve bazı reaktiflerin son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, her zaman yeterli kişisel koruyucu ekipman kullanmak ve uygun olduğunda çeker ocak veya mikrobiyolojik güvenlik kabini içinde çalışmak önemlidir.