Hibrid-Cut: Dirençli Bir Bitki Doku Örnekleri Bir Geliştirilmiş Kesit Yöntemi

Hibrid kesim doku kesitleme yönteminin genel amacı, anatomik ve biyolojik çalışmalar için uygun doku örnekleri oluşturmak için kesitli inatçı bitki dokularının, sert liflere ve silika kristallerine sahip olanların bütünlüğünü iyileştirmektir. Yüksek düzeyde kristal ve silika içeren bitkiler, kesit alma sırasında ciddi parafin yırtılması ve sorun yaşayabilir. Bu yöntem doku bütünlüğünü önemli ölçüde artırır.

Bu tekniğin ana avantajı, kriyostatta ultra düşük sıcaklık altında kesitlemenin parafin bloğunu sertleştirerek kristal kesme problemini önemli ölçüde azaltmasıdır. Bu tekniğin uygulanması, diğerlerinin yanı sıra yerinde hibridizasyon, FISH ve dahili değerlendirmeye kadar uzanabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü parafin bloğunun bir aşamaya sıkıca yapışmasını sağlamak için atılan adımlar zor olabilir.

Başlamak için, beş yapraklı aşamada olgun phalaenopsis orkide bitkilerini seçin. Yaprakları orta kaburga boyunca yırtarak dikkatlice çıkarın. Keskin bir neşter kullanarak, aksiller tomurcukları monopodial sistemdeki üçüncü veya dördüncü yaprağın tabanından dikkatlice çıkarın.

Numuneleri hemen 15 mililitre buz gibi PFA fiksatif içeren bir cam parıldama şişesine yerleştirin. Fiksatifteki numunelere 15 ila 20 dakika boyunca dört santigrat derecede bir vakum uygulayın. Numunelerden küçük baloncuklar salınacaktır.

Vakumun serbest bırakılmasından sonra numunelerin çoğu batana kadar bu adımı tekrarlayın. Son olarak, elektrikli süpürgeyi gece boyunca tutun ve ertesi gün yavaşça bırakın. Daha sonra, sabit numuneleri 15 mililitre PBS'ye batırın ve 15 dakika boyunca buzun üzerine koyun.

Numuneleri bir dizi artan konsantrasyonda 15 mililitre etanol içinde kurutun. %30, %50, %70, %85, %95 ve son olarak %100Numuneleri 15 mililitre iki ila bir hacim etanol ve ksilen ikame karışımı ile oda sıcaklığında sızın. Numuneleri aşağıdakilerin her birinden 15 mililitre içine sırayla yerleştirerek sızmaya devam edin.

Etanol ve ksilen ikamesinin bir ila bir hacim karışımı, bir ila iki hacim ila hacim etanol ve ksilen ikamesi karışımı ve son olarak saf ksilen ikamesi. Daha sonra dokuları 60 santigrat derecede bir fırında inkübe edin. Numuneleri 60 santigrat derecede 15 mililitre ksilen ikamesi ve parafin karışımı ile sızdırın.

Son olarak, parafini 15 milimetre saf parafin içinde her biri 60 santigrat derecede 12 saat boyunca iki kez sızdırın. Ertesi gün bu adımı tekrarlayın. Gömmeye başlamak için önce metal kalıpları 62 santigrat dereceye ısıtın ve ardından kalıp tabanına yaklaşık 13 mililitre erimiş balmumu dökün.

Isıtılmış forsepslerle, bir doku örneğini kalıba aktarın ve istenen konuma yönlendirin. Kalıbı dikkatlice soğutma plakasına taşıyın ve balmumu katılaşana kadar bekletin. Ardından, parafin numune bloğunu, üstte yamuk bir yüzey bulunan uygun boyutta bir sütun halinde kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın.

Kriyostat aşamasının merkezine 800 mikrolitre optik kesme sıcaklığı bileşiği veya OCT ekleyin. Parafin bloğunu sahneye yerleştirin ve doku bloğunu hızlı bir şekilde istenen konuma yönlendirin. Parafin bloğunu ve aşamasını bir kristalat odasına aktarın.

OCT'yi 10 dakika boyunca eksi 42 santigrat derecede hızlı bir şekilde dondurun. Ardından, kristat adaptörünü ve oda sıcaklığını sırasıyla eksi 20 santigrat dereceye ve eksi 16 santigrat dereceye soğutun. Bloğu ve sahneyi kristat adaptörüne takın.

Şimdi, dokuları 10 mikrometre kalınlığa kadar bölümlere ayırın. Forseps kullanarak, doku bölümlerini alın ve poli-l-lizin kaplı bir slayt üzerinde 800 mikrolitre DEPC ile arıtılmış su üzerinde yüzecek şekilde yerleştirin. Slaytları 42 santigrat dereceye ayarlanmış bir sıcak plakaya aktarın.

Bölümlerin düzleşmesine izin verin ve kenarlardaki suyu emmek için filtre kağıdı kullanın. Dokunun slayta monte edilmesini sağlamak için numuneyi gece boyunca 42 santigrat derecede sıcak plaka üzerinde bırakın. Numuneleri deparafinize etmek için, önce monte edilmiş doku slaytlarını bir boyama rafına yerleştirin.

Bir boyama kavanozuna 150 mililitre ksilen ekleyin ve slayt rafını beş dakika daldırın. Daha sonra, numuneleri, oda sıcaklığında bir seferde üç dakika boyunca her biri 150 mililitre olan azalan etanol konsantrasyonlarına yerleştirerek yeniden sulandırın. Son olarak, örnekleri üç dakika boyunca çift damıtılmış suya batırın.

Slaytları 1,5 dakika boyunca 150 mililitre hematoksilen çözeltisine yerleştirerek numuneleri boyayın. Bir ila iki damla N hidroklorik asit içeren 150 mililitre çift damıtılmış suda birkaç saniye durulayın ve ardından slaytları kısa bir süre çift damıtılmış suyla yıkayın. Oda sıcaklığında üç dakika boyunca 150 mililitrelik bir dizi artan etanol konsantrasyonu kullanarak numuneleri bir kez daha kurutun.

Örnekleri beş dakika boyunca 150 mililitre ksilene batırın. Son olarak, her bir slayta nazikçe 600 mikrolitre ksilen bazlı montaj ortamı ekleyerek ve ardından numunenin üzerine bir kapak fişi yerleştirerek numuneleri monte edin. Bu yöntem kullanılarak, yüksek seviyelerde kristal içeren, tipik olarak kesitlenmesi zor olan aksiller tomurcuk da dahil olmak üzere, phalaenopsis orkidelerinin doku bölümleri oluşturuldu.

Protein cisimlerinin görselleştirilmesine izin veren ayrıntılı yapılar korunmuştur. Hibrit kesim ayrıca, çimlenmiş tohumun sürgün apikal meristeminin görselleştirilmesi için net bir kesit üretti. Bu görüntüler, pirinç ve buğday bitkilerinin enine yaprak bölümlerinin geleneksel parafin ve hibrit kesim kesitleme teknikleri kullanılarak hazırlanmasını göstermektedir.

Bu mahsuller tipik olarak yüksek düzeyde silika içerir ve bu da onları bölümlere ayırmayı zorlaştırır. Hibrid kesim bölümlerindeki doku bütünlüğü önemli ölçüde iyileştirildi ve parafin örneklerinde sıklıkla bozulan veya bulunması zor olan anahtar yapılar, hibrid kesim dokusunda bütünüyle korundu. Ek olarak, sadece parafin kesitli örneklerde yırtılma gözlendi.

Ek olarak, anatominin güçlü bir şekilde tutulması, hibrit kesim dokularını mekansal gen ekspresyon modellerinin çalışmaları için yararlı hale getirir. Burada, Aktin ve Siklin B1: 1 ile in situ hibridizasyon, phalaenopsis orkidelerinin ikinci ve üçüncü aksiller tomurcuklarının hibrit kesim bölümleri üzerinde gerçekleştirildi. Geliştirilmiş anatomik koruma, üçüncü aksiller tomurcukların gelişmekte olan meristematik hücrelerinde hedef genlerin daha yüksek ekspresyon seviyelerinin tespit edilmesine izin verdi.

Bu prosedürü denerken, parafin bloğunu sertleştirmek için eksi 16 santigrat derecede bir sıcaklığı korumak önemlidir. Bu, kaliteli doku kesiti ile sonuçlanmalıdır. Bu yöntem fikri, geleneksel parafin veya kriyoseksiyon yöntemini kullanarak orkidede başarılı kesit alma işlemini birçok kez gerçekleştiremedikten sonra aklımıza geldi.

Bu prosedürü takiben, gen mekansal lokalizasyonu ve fonksiyonunun araştırılması da dahil olmak üzere ek soruları yanıtlamak için in situ hibridizasyon ve FISH gibi tüm deneyler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, inatçı bitki örneğinde yüksek kaliteli doku kesitinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.