Name: Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Öğrenin, flüoresan korelasyon spektroskopisi ile canlı bağışıklık hücrelerinin plazma membranlarında protein difüzyon hızını ölçme yöntemini. Bu teknik, immünoterapi stratejileri için membran reseptör dinamiklerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Zeiss Confocor 3 aracın bakımı için ve hücre ölçümleri konusunda yararlı ipuçları Dr. Vladana Vukojeviç, Moleküler Tıp Merkezi, Karolinska Enstitüsünde teşekkür ederim. Bu çalışmada, Magnus Bergvalls Stiftelse ve Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond gelen Vetenskapsrådet hibe (1629 hibe sayısı 2012-) tarafından finanse edildi.

<ol><li>Goni, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+structure+and+dynamics+of+cell+membranes%3A+an+update+of+the+Singer-Nicolson+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).</li>
<li>Bagawath-Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+Induce+Faster+Membrane+Diffusion+of+MHC+Class+I+and+the+Ly49A+Receptor+in+a+Subpopulation+of+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy+for+the+study+of+membrane+dynamics+and+protein%2Flipid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions.</a> Methods. 46, 116-122 (2008).</li>
<li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).</li>
<li>Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/lpor.200910041/abstract">Fluorescence correlation spectroscopy in vivo.</a> Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).</li>
<li>Lidke, D. S., Wilson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+act%3A+quantifying+protein+behaviour+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells.</a> Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).</li>
<li>Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+progress+in+single+particle+tracking%3A+from+methods+to+biophysical+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights.</a> Rep Prog Phys. 78, 124601(2015).</li>
<li>Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).</li>
<li>Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImFCS%3A+a+software+for+imaging+FCS+data+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization.</a> Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).</li>
<li>Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F-techniques%3A+advances+in+receptor+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">The F-techniques: advances in receptor protein studies.</a> Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 5, 155-157 (2008).</li>
<li>Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).</li>
<li>Haustein, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+correlation+spectroscopy%3A+novel+variations+of+an+established+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).</li>
<li>Widengren, J., Thyberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FCS+cell+surface+measurements--photophysical+limitations+and+consequences+on+molecular+ensembles+with+heterogenic+mobilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities.</a> Cytometry A. 68, 101-112 (2005).</li>
<li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3F+A+beginners%27+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).</li>
<li>Meinhardt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+NK+cell+magnetic+bead+isolation+methods+on+phenotype+and+function+of+murine+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells.</a> J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).</li>
<li>Bacia, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+dual-color+fluorescence+cross-correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy.</a> Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).</li>
<li>Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+coefficients+of+several+rhodamine+derivatives+as+determined+by+pulsed+field+gradient-nuclear+magnetic+resonance+and+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy.</a> J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).</li>
<li>Petrasek, Z., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+measurement+of+diffusion+coefficients+using+scanning+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).</li>
<li>Stromqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+FCCS+procedure+applied+to+Ly49A-MHC+class+I+cis-interaction+studies+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes.</a> Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).</li>
<li>Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/j100036a009">Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study.</a> J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).</li>
<li>Humpolickova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+diffusion+laws+within+cellular+membranes+by+Z-scan+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biophys J. 91, L23-L25 (2006).</li>
<li>Guo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian+approach+to+the+analysis+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+data+II%3A+application+to+simulated+and+in+vitro+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data.</a> Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).</li>
<li>Ries, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+suppression+of+sample-related+artifacts+in+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).</li>
<li>Chiu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+kinetics+of+the+androgen+receptor+shown+by+multimodal+Image+Correlation+Spectroscopy+%28mICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS).</a> Sci Rep. 6, 22435(2016).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290(2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

FCS Bu protokol bağışıklık hücrelerinin (murin, insan ya da diğer türlerin) her türlü yüzey moleküllerinin moleküler dinamiklerini değerlendirilmesi için de kullanılabilir. aşağı canlı hücrelerde tek-molekül çözünürlüğü FCS önlemler uzay-zamansal moleküler dinamik. Moleküler yoğunluğu, hem de ilgi konusu olan proteinlerin difüzyon hızı ve kümelenme dinamiği, otomatik korelasyon eğrisi elde edilebilir. floresan etiketleme başarılı FCS deneyler için önemli hususlardan biridir. Hücre zarı üzeri...

Birçok bağışıklık hücreleri fonksiyonlarını moleküler difüzyon ve zarlar içinde etkileşimler güveniyor. Biyolojik zarlar karmaşıktır ve hücre membranları 1 içindeki proteinlerin geçiş yayılma hızını etkileyebilir immün hücrelerin fonksiyonu için önemli olabilir birçok faktör. Son zamanlarda, doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait, doğal öldürücü (NK) hücreler, lenfosit, NK hücreleri 2 durumuna bağlı olarak, hücre zarı iki çalışılan protein ayırıcı difüzyon sergilediklerini göstermiştir. Flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), biyolojik zarlar içinde moleküler difüzyon oranları miktarının kapasitesine sahip bir tekniktir. Bu floresan sabit hacimde molekülleri etiketli ortalama difüzyon oranı, bir konfokal mikroskop tipik odak bildirir. Bu moleküler hareketi üzerine ortaya floresan dalgalanmaların ölçülmesine dayanırkararlı halde bir sistem. FCS yaygın çözelti içinde ve lipid zarlar içinde hem de floresan boyalar ve proteinlerin difüzyon incelemek için kullanılmıştır. Difüzyon hızını etkileyen diğer çıkış parametreleri de dolaylı olarak, bu şekilde incelenebilir (örneğin, protein ya da hücre membranları üzerinde moleküllerinin etkileşimleri konformasyonel değişiklikler) 3, 4. FCS tek-molekül tespiti için olasılığını sağlayan yüksek duyarlılığı nedeniyle diğer tekniklerle karşılaştırıldığında göze çarpıyor. Bu, çoğu proteinin 5 &#39;nın endojen ekspresyonunun seviyeleri tipik milimolar aralığına nanomolar, moleküler konsantrasyonları için çalışır. çoğu diğer teknikler sadece protein ekspresyon düzeyleri hakkında nispi bilgi verirken Ayrıca, FCS, çalışılan hacmi içindeki proteinlerin mutlak sayısının bir yaklaşım verebilir. membranlar fluo dahil olan diğer yöntemler moleküler difüzyon oranlarını ölçmek için(Sıkı bağlamak) photobleaching sonra rescence kurtarma, tek parçacık izleme (SPT), çoklu iğne deliği FCS ve görüntü korelasyon yöntemleri. Sıkı bağlamak ve görüntü korelasyon yöntemleri genellikle moleküllerin 10 mutlak sayısı hakkında bilgi vermeyin topluluk teknikleri vardır. SPT ile karşılaştırıldığında, FCS verimi nüfusun ortalama karakterize açısından yüksektir. lazer odak içinde mevcut moleküllerin ortalama difüzyon oranı oldukça tek moleküllerin oranından daha ölçülür çünkü analizi de daha az talep ediyor. Özel mikroskoplar 11 mevcut değilse, standart SPT etiketleme tek moleküllerin tanımlanmasına olanak sağlamak için çok düşük olması gerektiğinden Ayrıca, SPT, konsantrasyonları hakkında herhangi bir bilgi veremem. Öte yandan, FCS çalışılan moleküller mobil olmasını gerektirir. Bu sadece çok yavaş hareket eden herhangi bir farazi hareketsiz kesirleri veya molekülleri tespit olmayacaktır. moleküllerin difüzyon oranı ouzun edinimi süresi yaklaşık onda biri doğru FCS ölçümlerinin 3, 12 temsil olmayacak daha odak içinde bulunur. Bu nedenle, FCS tarafından kaydedilen difüzyon katsayıları to-hareketsiz-yakın ve çok yavaş fraksiyonlar yanı sıra dikkate alınır FRAP ve SPT gibi tekniklerden rapor difüzyon oranlarından daha hızlı olma eğilimindedir. SPT da olacak FCS daha moleküler nüfus içerisindeki difüzyon oranlarının değişkenliği daha ayrıntılı bir açıklama verecektir. FCS heyecanlı hacmi içinde zamanla floresan dalgalanma rakamlarla. Membran ölçümleri durumunda, bu zarın aydınlatılmış bölgeye çevirir. Bu yazıda, bu tür dalgalanmalar Brown difüzyon sergileyen molekülleri tarafından uyarılan ve böylece ve uyarma hacminin dışında hareket gerçeğini kullanmaktadır. fluctua için birkaç olası kaynak vardırBu tür bağlayıcı unbinding tüm hücre zarı ligandı ya da hareket, yanıp sönen veya flüoroforlar, çevresel etkiler bir triplet halinin varlığı olarak floresans sinyalinde yonlar. Bu farazi hata kaynakları sonuçları doğru 12, 13 yorumlamak amacıyla bir FCS deney tasarımı dikkate alınması gerekir. Tipik olarak, biyolojik zarların yanal difüzyon oranları zar proteinleri arasında proteinler ve hücre iskeletinin arasında hem kalabalık ve etkileşimleri nedeniyle düşüktür. Tarihsel, zarlarında FCS kullanımı dolayısıyla uyarma odak 14 boyunca uzatılmış geçiş zamanlarında ağartma önlemek için gerekli olan foto stabil fluorophores, eksikliği engel olmuştur. Ancak, bugün, uygun foto stabil boyalar için pek çok seçenek vardır. detektör ve diğer donanım önemli gelişmeler de floresan prote algılanmasına izinins ve alt parlaklık boyalar. Burada, antikor etiketli ilgili protein flüoresan ile etiketlenmiş olan fare primer lenfositleri kullanılarak FCS uygulama için temel protokol, tarif edilmektedir. difüzyon katsayısı ve moleküler yoğunluğu elde etmek için otokorelasyon eğrileri uygun bir yaklaşım da gösterilmiştir. protokol kolayca moleküllerin difüzyon çalışması için teknikler daha önce hiç deneyimi olan immünolojistler tarafından takip ediliyor amaçlamaktadır. Ancak, konfokal mikroskopi temel bir anlayış beklenmektedir (referans 15&#39;e bakın, bu temel anlayış kazanmak için). Bu protokol, nispeten kolay bir şekilde, diğer süspansiyon hücreleri hücre hatları ve primer hücreler hem de adapte edilebilir. Daha tecrübeli FCS kullanıcılar için, daha rafine analiz yöntemleri olan bazı tartışmalar anlatılmıştır, mevcuttur.

<table><tbody><tr><td>MACS NK Hücre İzolasyon Kiti fare II</td><td>Miltenyi Biotec NordenAB</td><td>130-096-892</td><td>NK hücrelerinin negatif seçimi</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Sigma-Adlrich</td><td>F7524</td><td>Isı ile İnaktive</td></tr><tr><td>Edilmiş Fosfat Tamponlu Salin</td> <td>-</td><td></td> <td>Evde üretilmiştir&nbsp;</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Enstitüsü orta 1640</td><td>PAA Hücre Kültürü Şirketi&nbsp;</td><td>E15-848</td><td>Şeffaf orta</td></tr><tr><td>Antikor klonu 2.4G2</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>553140</td><td>Fc reseptörlerini bloke etmek için.</td></tr><tr><td>Anti-Ly49A antikoru&nbsp;</td><td></td><td></td> Evde yapılan ve Alexa fluor 647 Klon JR9.318 Anti-H-2Dd <td>antikoruna evde konjuge edilen monoklonal antikor</td></tr>&<tr><td></td>nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Pharmingen</td><td>558915</td> Antikor konjugasyonu için <td>MFP488</td></tr><tr><td>Klon 34.5.8S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP488</td><td>Mobiotech</td><td>MFP-A2181</td><td>Floresan boya</td></tr> ile evde konjuge edilmiştir.<tr><td>Poli-L-Lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>Damıtılmış suda seyreltilmiş (1.10)</td></tr> <tr><td>Poli-L-Lizin (20 kDa), polietilen glikol (2 kDa) ile aşılanmış,</td> <td>SuSoS AG</td><td>PLL(20) -g [3.5] -PEG (2)</td> <td>PBS (pH 7.4) ila 0.5 mg / ml ile seyreltilmiştir.</td></tr><tr><td>Rhodamine 110 klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>432202</td><td>Bilinen difüzyon katsayısı: 3.3 & kez; 10 & eksi; 10 m2/sn 19</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A20006</td><td>Bilinen difüzyon katsayısı: 4.4 & kez; 10 & eksi; 10 m 2 / sn 20</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop ve nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Yazılımı: Confocor 3</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yazılımı: Eğri uydurma araç kutusu ile Matlab</td><td>Matlab</td><td>Sürüm R2013b</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak Camı</td><td>Termo-bilimsel&nbsp;</td><td>155411</td><td>8 kuyu, 1.0 borosilikat alt</td></tr></tbody></table>

flüoresan korelasyon spektroskopisi Ölçülen İlköğretim lenfositler plazma membranlarda moleküler difüzyon

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS) yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip biyolojik membranların içindeki moleküllerin difüzyon çalışmak için güçlü bir tekniktir. FCS hücre zarındaki floresan etiketli moleküllerin moleküler konsantrasyon ve difüzyon katsayısının ölçmek olabilir. Bu teknik, (gerçek ölçüm süresi boyunca sonucu etkileyen işlemleri olmadan IE) sürekli halde bağışıklık hücrelerinin plazma membranında moleküllerin moleküler difüzyon karakteristiklerini yeteneğine sahiptir. FCS çok endojen proteinler için tipik bir seviyede ifade edilen proteinleri difüzyonunu çalışmak için uygundur. Burada, birincil lenfositleri üzerinde hücre zarı proteinlerinin difüzyon oranını belirlemek için basit ve sağlam bir yöntem olduğunu göstermiştir. antikor lekeli canlı hücreler ve kazanılmasından sonra sık görülen gözlemlere ölçümleri gerçekleştirmek için etkili bir yoldur açıklanmıştır. son gelişmelerverilmedi-kararlı floresan boyalar geliştirilmesinde ölçümler sırasında yoğun ağartıcı olmayan boyalar, uygun ilgi antikorlar eşleştirilmesiyle kullanılabilir. Buna ek olarak, bu hücre zarlarında ifade edilen proteinlerin genel bir özelliğidir yavaş difüzyon kişiler tespiti için verir. Oluşturulan otokorelasyon eğrileri moleküler konsantrasyon ve difüzyon parametreleri ayıklamak için analiz prosedürü vurgulanır. Özet olarak, FCS ölçümleri için temel protokol sağlanmıştır; o konfokal mikroskopi anlayışı ile ancak böyle moleküler difüzyon oranları gibi dinamik parametrelerini, ölçme teknikleri başka hiçbir önceki deneyimi ile immünolojistler tarafından takip edilebilir.

Tipik bir sonuç membran proteinleri için 400 msn 10 milisaniye aralığındaki bir geçiş süresi olan bir otokorelasyon eğrisi oluşturur. Molekül sayısı, endojen olarak ifade edilen proteinleri yaklaşık 200 mikron 2 başına 0.5 arasında değişebilir. CPM beklenenden daha düşük değildir olduğunu dikkatlice kontrol ediniz. Bu arka plan sinyalinin bir etkisi olduğu anlamına gelebilir. Genel bir kural olarak, analiz için kabul edilir hücreler üzerinde CPM sinyali serbestçe aynı lazer gü...

Floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) kullanılarak primer immün hücrelerin zarlarında protein difüzyonunu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yazıda, floresan etiketleme için antikorların kullanımı gösterilmektedir.

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Bu protokolün genel amacı, floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak birincil bağışıklık hücrelerinin zarlarında etiketli bir proteinin difüzyon hızını ölçmektir. Bu yöntem, immünoloji ve hücre biyolojisi alanlarında, daha aktif bir zar reseptörü dinamiği ile doğal öldürücü hücrelerin tanımlanması gibi temel soruların belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerle birlikte kullanılmasıdır, bu nedenle moleküllerin nasıl hareket ettiğine dair doğal durumu doğru bir şekilde yansıtır.Bu tekniğin etkileri, moleküler difüzyon gibi farklı doğal öldürücü hücre özelliklerinin, verimliliğin daha iyi tahmin edilebileceği işlevleriyle bağlantılı olması durumunda, kanserin immünoterapisine kadar uzanır. Bu yöntem, bağışıklık hücrelerindeki moleküler hareket hakkında bilgi sağlayabilse de, herhangi bir disiplindeki diğer birincil hücrelere ve hücre hatlarına da uygulanabilir. Yazılımı, Yeni Görüntüleri Tara seçeneği seçili olarak uzman modunda açın.Konfokal lazer tarama mikroskobunda 40X su objektifi lensini seçin. Acquire sekmesi altında, Configuration Control (Yapılandırma Kontrolü) ve Scan Control (Tarama Denetimi) seçeneklerini açmak için Config (Yapılandır) ve Scan (Tara) düğmelerine basın. ConfoCor sekmesi altında, Ölçüm penceresini açmak için Ölç'e basın.Ardından, FCS ölçümlerini kaydetmek için bir klasör oluşturun. Dosya sekmesi altında Yeni'yi tıklatarak yeni bir görüntü veritabanı başlatın. Halojen lambayı açın.Lazer düğmesini kullanarak, floroforları heyecanlandırmak için ilgili lazerleri açın. Ardından, Konfigürasyon Kontrolü penceresinde görüntü yakalama ayarlarını belirtin. Buna uyarma lazeri, uyarma ve emisyon filtreleri, ışık yolu ve kullanımdaki dedektörler dahildir.Benzer şekilde, Ölçüm penceresine gidin ve Sistem Yapılandırması sekmesi altındaki FCS ayarlarını yapın. Yeşil kanal için Kanal 1'i ve kırmızı kanal için Kanal 2'yi değiştirerek FCS kayıtları için algılama kanallarını etkinleştirin. Lazer stabilize olurken, bu 30 dakika kadar sürebilir, iğne deliğini ayarlayın.İlk olarak, 50 mikrolitrelik bir boya damlasını, poli-L-lizin ile kaplanmış sekiz kuyucuklu odacıklı bir kapak camı slaytının bir oyuğuna merkezi olarak yerleştirin. Bitişik kuyucuklar, kalibrasyon slayta bağlı olduğu için hücre ölçümleri yapmak için kullanılır. 40X su objektif merceğine bir damla damıtılmış su damlatın ve kaydırağı konumlandırın.Ardından görünür ışık kaynağını seçmek için Vis düğmesine basın ve florofor damlacığının merkezi konumuna odaklanın. Yazılım Ölçüm penceresinde, Edinme sekmesini seçin ve Pozisyonlar altında mevcut pozisyonu değiştirin. Ardından aynı penceredeki Sistem Yapılandırması sekmesine dönün ve yeşil lazer için yüksek veya doygun bir güç ayarlayın.Sinyalin kararlılığını test etmek için, Zaman izleme ve Otomatik korelasyon eğrisini görüntüleyen yeni bir pencere açmak için Başlat'a basın. Floresan sinyalin yüksek, kararlı olduğunu ve y ekseninin kilohertz aralığında dalgalanma gösterdiğini kontrol edin. Daha düşük değerler, kesin olmayan odaklama veya boya bozulmasından kaynaklanıyor olabilir.Ardından, Ölçüm penceresinde O Ayarla düğmesini seçin. Ardından doğru algılama kanalını seçin ve Otomatik Ayar X'e basın.Ortaya çıkan eğrinin üst sınırı eksikse veya ortalanmamışsa, Kaba seçeneğini işaretleyin ve X Ayarını Yap'a tekrar basın. X yönünü ayarladıktan sonra, Otomatik Ayar Y'ye basarak Y yönü için de aynısını yapın.Kaba seçimi kaldırın ve her ikisi de net maksimum ve kararlı değerlere sahip olana kadar Otomatik Ayarla'ya basarak X ve Y ayarlamaları arasında geçiş yapın.Hücreler iki farklı florofor ile etiketlenmişse, bitişik bir odaya bir damla kırmızı florofor çözeltisi ekleyin. Ardından ikinci kanalı kalibre edin. Kırmızı lazeri yüksek bir güce ayarlayın ve kararlılık kalibrasyon prosedürünü tekrarlayın.Daha sonra, odak boyunca serbestçe yayılan floroforların geçiş süresini ölçüyoruz. Ve daha sonra sahneyi, hücre zarının odak içindeki alanını hesaplamak için kullanırız. Başlamak için, ayarlama prosedürünü dikkatli bir şekilde uygulayarak bir çözelti damlasına odaklanın.Ardından, Ölçüm penceresindeki Edinme sekmesine gidin ve edinme süresini üç tekrarla 30 saniye olarak ayarlayın. Lazer gücünü doygunluğa yakın bir seviyeye ayarlayın ve ölçüm yapmak için Başlat'a basın. Ölçüm tamamlandıktan sonra molekül veya CPM başına sayımları kaydedin.Ardından, lazer gücünde yinelemeli azalmalar yaparak yeni ölçümler yapın. Bu güç aralığında, gelecek hücre ölçümlerinin beklenen gücünü dahil edin. Ardından, CPM değerlerinin lazer gücüyle doğrusal olarak ölçeklendiğini kontrol edin.Ölçeğin geri kalanının doğrusal olması koşuluyla, en yüksek güçte doygunluk kabul edilebilir. Yeni konjuge bir floresan antikor ilk kez kullanıldığında, beklenen CPM'yi ölçmek için serbestçe yayılan antikorların bir FCS ölçümünü gerçekleştirin. Ve serbest antikorlar için PEG Poli-L-Lizin ile kaplanmış kuyucukların kullanılması önemlidir.Bu prosedür için, polietilen glikole aşılanmış 200 mikrolitre Poli-L-Lizin ile odacıklı bir slayt kaplayın. Çözeltinin oda sıcaklığında bir saat yapışmasına izin verin. Stok çözeltisi iki haftaya kadar buzdolabında saklanabilir.Ve toz stoğu dondurucuda saklanmalıdır. Daha sonra sıvıyı çıkarın ve haznenin kurumasını bekleyin. Mikroskopta, PBS'deki antikoru mililitre başına bir ila 10 mikrogram arasında seyreltin.Serbest floroforlar için önceki bölümde açıklandığı gibi serbest antikorların geçiş süresini ölçmeye devam edin. Bir hücrede ölçüm yapmak için, PBS'ye 125 mikrolitre hücre artı antikor etiketli hücre süspansiyonundan% 1 FCS ekleyin. Ve 150 mikrolitre şeffaf Roswell Park Memorial Institute Medium 1640'ı PLL kaplı cam slaytta boş bir kuyuya.Devam etmeden önce hücrelerin karanlıkta ölçüm sıcaklığında en az 20 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin, böylece hücreler bağlanabilir ve dengelenebilir. Hücreleri görüntülemek için gereken mümkün olan en düşük lazer gücünü bulmak için görüntülemeyi hızlı XY taramalarıyla başlatın. Ardından görüntüyü, zarın net bir şekilde tanımlandığı ortalama parlaklıkta yuvarlak bir hücre üzerinde ortalayın.Sitoplazmada floresan sinyalin olmaması çok önemlidir. Hücre görüntünün büyük bir kısmını kaplayana kadar yakınlaştırın. Ardından hücre zarının üst kısmına odaklanın.Hücrenin merkezinden başlayın ve görüntünün merkezi eşit floresanslı küçük bir yuvarlak alan gösterene kadar yukarı doğru hareket edin. Odağın dikkatli bir şekilde yerleştirilmesi çok önemlidir. Odak zarda değilse, algılanan floresan floresan etiketli zar reseptörlerinden gelmeyecektir.Ve böylece sonuçlar davranışlarını yansıtmayacaktır. Şimdi Ölçüm penceresinin Edinme sekmesi altında, Artı işaretini etkinleştirerek FCS ölçümü için bir konum seçin. Ardından tekrar sayısını altı ile 10 arasında ayarlayın ve Ölçüm Süresi'ni tekrar başına 10 saniye olarak ayarlayın.Şimdi Ölçüm penceresinin Sistem Yapılandırması sekmesine dönün ve FCS ölçümleri için lazer gücünü bir ila 10 mikrowatt arasına düşürün. Ardından Başlat'a basın. Yoğunluk izi ilk 10 saniye içinde %30'dan fazla düşerse, hücre çok fazla ağartılmıştır ve başka bir hücrenin daha düşük bir güçte ölçülmesi gerekir.Sinyal kaybolursa, odağı Z yönünde ayarlayın ve ölçümü yeniden başlatın. Ölçüm tamamlandıktan sonra, zarının ölçüldüğünden emin olmak için hücrenin hala ortalanmış olup olmadığını kontrol etmek için Tarama Kontrolü penceresine bakın. Hücre taşındıysa, verileri atın.Şimdi Otomatik Korelasyon penceresine gidin ve yakınlaştırma manevraları, ağartma, büyük kümeler veya diğer artefaktları içeren tek tek tekrarları manuel olarak silin. Yapıları kaldırmak için sağ tıklayın ve Sil'i seçin. Gerçek eserlerin seçilmesi pratik gerektirir.Tekrarların kaldırılması basit bir işlemdir, ancak neyin kaldırılması ve hangilerinin kaldırılmaması gerektiğini bilmek için tekrarların doğru bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Ardından son dosyayı FCS formatında kaydedin. Daha fazla analiz için yalnızca artefaktların kaldırılmasından sonra en az dört tekrarı kalan hücreleri saklayın.Tipik bir membran reseptörü Otomatik korelasyon eğrisi pürüzsüzdür ve 10 ila 400 milisaniye aralığında bir geçiş süresine sahiptir. Uygun alanları, difüzyonu temsil eden en dik eğimli kısmın hem başlangıcı hem de sonu temsil edilecek şekilde ayarlayın. Verileri sığdırmak için iki boyutta bir serbest difüzyon modeli kullanarak, eğrinin en derin eğimli kısmına dikkat edin.Kalıntıda görülen, tau ölçeğinde bir saniye veya civarında küçük dalgalanmalar kabul edilebilir. Eğri kötü uyuyorsa, ancak hücrenin hareket etme, ağartma veya kümeler gibi belirgin bir sorunu yoksa, modelin başlangıç değerlerinin veya üst ve alt sınırlarının büyük olasılıkla değişmesi gerekir. Model Otomatik korelasyon eğrisine iyi bir şekilde uyduğunda, değişken parametrelerinin değerlerini çıkarın.Molekül sayısı, endojen olarak eksprese edilen proteinler için mikron kare başına 0,5 ila yaklaşık 200 arasında değişebilir. Hücre ölçümünden elde edilen CPM değerinin, serbestçe yayılan antikorlardan kaydedilenin en az% 33'ü olduğunu kontrol edin. Bu videoyu izledikten sonra, floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak proteinlerin difüzyon hızının nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa beş ila altı saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, hücrelerin ölçümün başlamasından yaklaşık 20 dakika öncesine kadar buz üzerinde tutulması önemlidir. Herhangi bir numuneyi iki saatten fazla ölçmeyin.Bu prosedürü takiben, difüzyon hızının belirli bir proteinin ekspresyon seviyesi ile nasıl ilişkili olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için görüntüleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, moleküler biyoloji ve immünoloji alanlarındaki araştırmacıların canlı hücrelerdeki proteinlerin dinamiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.

molecular-diffusion-plasma-membranes-primary-lymphocytes-measured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Yaşayan hücrelerin plazma membranında flüoresan proteinlerin lipid sal bölümleme araştırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu lipid sallar içinde veya dışında bulunan proteinlerin difüzyon zamanlarda eşitsizlik yararlanır. Kazanım kontrol koşullarda ya da ilaç eklenmesinden sonra dinamik olarak gerçekleştirilebilir.

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

Bu video, hücre-hücre temaslarında hücre yüzeyi proteinleri arasındaki etkileşimi tespit etmek için floresan dalgalanma spektroskopisinin kullanımını göstermektedir. Bir floresan proteini ile etiketlenmiş ilgilenilen transmembran yapışma reseptörünü eksprese ederek ve spektral olarak ayrılmış iki floresan etiketi barındıran iki farklı hücre popülasyonunu karıştırarak, farklı renkli floresan ile iki komşu hücrenin reseptörleri arasındaki trans-etkileşim, floresan yoğunluğundaki dalgalanmalardaki...

Hücre Temaslarında Protein Etkileşimini İncelemek için Floresan Dalgalanma Spektroskopisi

Bu kağıt floresan canlı memeli hücrelerinde plazma zarı proteinleri etiketli difüzyon katsayılarını ölçmek için dalgalanma analizi tekniği k-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi (kICS) için adım kılavuz bir adım sağlar.

K-Uzay Görüntü Korelasyon Spektroskopisi kullanarak EGFP-etiketli Plazma Membran Proteinleri Difüzyon Katsayılarının kolay Ölçümü

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Bir damlacık tek tabakasını düz bir monotabaka üzerine birleştirerek sıvı-akışkan arayüzünde yüzey aktif bir türün yanal difüzyonunu ölçmek için yeni bir teknik sunuyoruz.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

Bu makale, canlı hücrelerin plazma zarındaki moleküler difüzyonu ölçmek için nokta varyasyonu Floresan Korelasyon Spektroskopisi (svFCS) mikroskobunun nasıl oluşturulacağına dair bir protokol sunmayı amaçlamaktadır.

Canlı Hücrelerin Plazma Membranında Moleküler Difüzyonun Analizi için Spot Varyasyon Floresan Korelasyon Spektroskopisi

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Hücre-aracılı lenfositotoksisite (KML) deneyleri, in vitro otoreaktif yanıtları ve hücre ölümü çalışma mekanizmaları test etmek için kullanılabilir. Ancak, canlı hücre floresan boyalar, tipi ve hücre ölümü gibi kullanılan yollar kinetiği konfokal mikroskopik görüntüleme teknikleri kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenebilir.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Öğrenin, flüoresan korelasyon spektroskopisi ile canlı bağışıklık hücrelerinin plazma membranlarında protein difüzyon hızını ölçme yöntemini. Bu teknik, immünoterapi stratejileri için membran reseptör dinamiklerini anlamaya yardımcı olur.

Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Daha fazla video keşfet