Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi Ölçülen İlköğretim Lenfositler Plazma Membranlarda moleküler difüzyon

Bu protokolün genel amacı, floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak birincil bağışıklık hücrelerinin zarlarında etiketli bir proteinin difüzyon hızını ölçmektir. Bu yöntem, immünoloji ve hücre biyolojisi alanlarında, daha aktif bir zar reseptörü dinamiği ile doğal öldürücü hücrelerin tanımlanması gibi temel soruların belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, canlı hücrelerle birlikte kullanılmasıdır, bu nedenle moleküllerin nasıl hareket ettiğine dair doğal durumu doğru bir şekilde yansıtır.

Bu tekniğin etkileri, moleküler difüzyon gibi farklı doğal öldürücü hücre özelliklerinin, verimliliğin daha iyi tahmin edilebileceği işlevleriyle bağlantılı olması durumunda, kanserin immünoterapisine kadar uzanır. Bu yöntem, bağışıklık hücrelerindeki moleküler hareket hakkında bilgi sağlayabilse de, herhangi bir disiplindeki diğer birincil hücrelere ve hücre hatlarına da uygulanabilir. Yazılımı, Yeni Görüntüleri Tara seçeneği seçili olarak uzman modunda açın.

Konfokal lazer tarama mikroskobunda 40X su objektifi lensini seçin. Acquire sekmesi altında, Configuration Control (Yapılandırma Kontrolü) ve Scan Control (Tarama Denetimi) seçeneklerini açmak için Config (Yapılandır) ve Scan (Tara) düğmelerine basın. ConfoCor sekmesi altında, Ölçüm penceresini açmak için Ölç'e basın.

Ardından, FCS ölçümlerini kaydetmek için bir klasör oluşturun. Dosya sekmesi altında Yeni'yi tıklatarak yeni bir görüntü veritabanı başlatın. Halojen lambayı açın.

Lazer düğmesini kullanarak, floroforları heyecanlandırmak için ilgili lazerleri açın. Ardından, Konfigürasyon Kontrolü penceresinde görüntü yakalama ayarlarını belirtin. Buna uyarma lazeri, uyarma ve emisyon filtreleri, ışık yolu ve kullanımdaki dedektörler dahildir.

Benzer şekilde, Ölçüm penceresine gidin ve Sistem Yapılandırması sekmesi altındaki FCS ayarlarını yapın. Yeşil kanal için Kanal 1'i ve kırmızı kanal için Kanal 2'yi değiştirerek FCS kayıtları için algılama kanallarını etkinleştirin. Lazer stabilize olurken, bu 30 dakika kadar sürebilir, iğne deliğini ayarlayın.

İlk olarak, 50 mikrolitrelik bir boya damlasını, poli-L-lizin ile kaplanmış sekiz kuyucuklu odacıklı bir kapak camı slaytının bir oyuğuna merkezi olarak yerleştirin. Bitişik kuyucuklar, kalibrasyon slayta bağlı olduğu için hücre ölçümleri yapmak için kullanılır. 40X su objektif merceğine bir damla damıtılmış su damlatın ve kaydırağı konumlandırın.

Ardından görünür ışık kaynağını seçmek için Vis düğmesine basın ve florofor damlacığının merkezi konumuna odaklanın. Yazılım Ölçüm penceresinde, Edinme sekmesini seçin ve Pozisyonlar altında mevcut pozisyonu değiştirin. Ardından aynı penceredeki Sistem Yapılandırması sekmesine dönün ve yeşil lazer için yüksek veya doygun bir güç ayarlayın.

Sinyalin kararlılığını test etmek için, Zaman izleme ve Otomatik korelasyon eğrisini görüntüleyen yeni bir pencere açmak için Başlat'a basın. Floresan sinyalin yüksek, kararlı olduğunu ve y ekseninin kilohertz aralığında dalgalanma gösterdiğini kontrol edin. Daha düşük değerler, kesin olmayan odaklama veya boya bozulmasından kaynaklanıyor olabilir.

Ardından, Ölçüm penceresinde O Ayarla düğmesini seçin. Ardından doğru algılama kanalını seçin ve Otomatik Ayar X'e basın.Ortaya çıkan eğrinin üst sınırı eksikse veya ortalanmamışsa, Kaba seçeneğini işaretleyin ve X Ayarını Yap'a tekrar basın. X yönünü ayarladıktan sonra, Otomatik Ayar Y'ye basarak Y yönü için de aynısını yapın.Kaba seçimi kaldırın ve her ikisi de net maksimum ve kararlı değerlere sahip olana kadar Otomatik Ayarla'ya basarak X ve Y ayarlamaları arasında geçiş yapın.

Hücreler iki farklı florofor ile etiketlenmişse, bitişik bir odaya bir damla kırmızı florofor çözeltisi ekleyin. Ardından ikinci kanalı kalibre edin. Kırmızı lazeri yüksek bir güce ayarlayın ve kararlılık kalibrasyon prosedürünü tekrarlayın.

Daha sonra, odak boyunca serbestçe yayılan floroforların geçiş süresini ölçüyoruz. Ve daha sonra sahneyi, hücre zarının odak içindeki alanını hesaplamak için kullanırız. Başlamak için, ayarlama prosedürünü dikkatli bir şekilde uygulayarak bir çözelti damlasına odaklanın.

Ardından, Ölçüm penceresindeki Edinme sekmesine gidin ve edinme süresini üç tekrarla 30 saniye olarak ayarlayın. Lazer gücünü doygunluğa yakın bir seviyeye ayarlayın ve ölçüm yapmak için Başlat'a basın. Ölçüm tamamlandıktan sonra molekül veya CPM başına sayımları kaydedin.

Ardından, lazer gücünde yinelemeli azalmalar yaparak yeni ölçümler yapın. Bu güç aralığında, gelecek hücre ölçümlerinin beklenen gücünü dahil edin. Ardından, CPM değerlerinin lazer gücüyle doğrusal olarak ölçeklendiğini kontrol edin.

Ölçeğin geri kalanının doğrusal olması koşuluyla, en yüksek güçte doygunluk kabul edilebilir. Yeni konjuge bir floresan antikor ilk kez kullanıldığında, beklenen CPM'yi ölçmek için serbestçe yayılan antikorların bir FCS ölçümünü gerçekleştirin. Ve serbest antikorlar için PEG Poli-L-Lizin ile kaplanmış kuyucukların kullanılması önemlidir.

Bu prosedür için, polietilen glikole aşılanmış 200 mikrolitre Poli-L-Lizin ile odacıklı bir slayt kaplayın. Çözeltinin oda sıcaklığında bir saat yapışmasına izin verin. Stok çözeltisi iki haftaya kadar buzdolabında saklanabilir.

Ve toz stoğu dondurucuda saklanmalıdır. Daha sonra sıvıyı çıkarın ve haznenin kurumasını bekleyin. Mikroskopta, PBS'deki antikoru mililitre başına bir ila 10 mikrogram arasında seyreltin.

Serbest floroforlar için önceki bölümde açıklandığı gibi serbest antikorların geçiş süresini ölçmeye devam edin. Bir hücrede ölçüm yapmak için, PBS'ye 125 mikrolitre hücre artı antikor etiketli hücre süspansiyonundan% 1 FCS ekleyin. Ve 150 mikrolitre şeffaf Roswell Park Memorial Institute Medium 1640'ı PLL kaplı cam slaytta boş bir kuyuya.

Devam etmeden önce hücrelerin karanlıkta ölçüm sıcaklığında en az 20 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin, böylece hücreler bağlanabilir ve dengelenebilir. Hücreleri görüntülemek için gereken mümkün olan en düşük lazer gücünü bulmak için görüntülemeyi hızlı XY taramalarıyla başlatın. Ardından görüntüyü, zarın net bir şekilde tanımlandığı ortalama parlaklıkta yuvarlak bir hücre üzerinde ortalayın.

Sitoplazmada floresan sinyalin olmaması çok önemlidir. Hücre görüntünün büyük bir kısmını kaplayana kadar yakınlaştırın. Ardından hücre zarının üst kısmına odaklanın.

Hücrenin merkezinden başlayın ve görüntünün merkezi eşit floresanslı küçük bir yuvarlak alan gösterene kadar yukarı doğru hareket edin. Odağın dikkatli bir şekilde yerleştirilmesi çok önemlidir. Odak zarda değilse, algılanan floresan floresan etiketli zar reseptörlerinden gelmeyecektir.

Ve böylece sonuçlar davranışlarını yansıtmayacaktır. Şimdi Ölçüm penceresinin Edinme sekmesi altında, Artı işaretini etkinleştirerek FCS ölçümü için bir konum seçin. Ardından tekrar sayısını altı ile 10 arasında ayarlayın ve Ölçüm Süresi'ni tekrar başına 10 saniye olarak ayarlayın.

Şimdi Ölçüm penceresinin Sistem Yapılandırması sekmesine dönün ve FCS ölçümleri için lazer gücünü bir ila 10 mikrowatt arasına düşürün. Ardından Başlat'a basın. Yoğunluk izi ilk 10 saniye içinde %30'dan fazla düşerse, hücre çok fazla ağartılmıştır ve başka bir hücrenin daha düşük bir güçte ölçülmesi gerekir.

Sinyal kaybolursa, odağı Z yönünde ayarlayın ve ölçümü yeniden başlatın. Ölçüm tamamlandıktan sonra, zarının ölçüldüğünden emin olmak için hücrenin hala ortalanmış olup olmadığını kontrol etmek için Tarama Kontrolü penceresine bakın. Hücre taşındıysa, verileri atın.

Şimdi Otomatik Korelasyon penceresine gidin ve yakınlaştırma manevraları, ağartma, büyük kümeler veya diğer artefaktları içeren tek tek tekrarları manuel olarak silin. Yapıları kaldırmak için sağ tıklayın ve Sil'i seçin. Gerçek eserlerin seçilmesi pratik gerektirir.

Tekrarların kaldırılması basit bir işlemdir, ancak neyin kaldırılması ve hangilerinin kaldırılmaması gerektiğini bilmek için tekrarların doğru bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Ardından son dosyayı FCS formatında kaydedin. Daha fazla analiz için yalnızca artefaktların kaldırılmasından sonra en az dört tekrarı kalan hücreleri saklayın.

Tipik bir membran reseptörü Otomatik korelasyon eğrisi pürüzsüzdür ve 10 ila 400 milisaniye aralığında bir geçiş süresine sahiptir. Uygun alanları, difüzyonu temsil eden en dik eğimli kısmın hem başlangıcı hem de sonu temsil edilecek şekilde ayarlayın. Verileri sığdırmak için iki boyutta bir serbest difüzyon modeli kullanarak, eğrinin en derin eğimli kısmına dikkat edin.

Kalıntıda görülen, tau ölçeğinde bir saniye veya civarında küçük dalgalanmalar kabul edilebilir. Eğri kötü uyuyorsa, ancak hücrenin hareket etme, ağartma veya kümeler gibi belirgin bir sorunu yoksa, modelin başlangıç değerlerinin veya üst ve alt sınırlarının büyük olasılıkla değişmesi gerekir. Model Otomatik korelasyon eğrisine iyi bir şekilde uyduğunda, değişken parametrelerinin değerlerini çıkarın.

Molekül sayısı, endojen olarak eksprese edilen proteinler için mikron kare başına 0,5 ila yaklaşık 200 arasında değişebilir. Hücre ölçümünden elde edilen CPM değerinin, serbestçe yayılan antikorlardan kaydedilenin en az% 33'ü olduğunu kontrol edin. Bu videoyu izledikten sonra, floresan korelasyon spektroskopisi kullanarak proteinlerin difüzyon hızının nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa beş ila altı saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, hücrelerin ölçümün başlamasından yaklaşık 20 dakika öncesine kadar buz üzerinde tutulması önemlidir. Herhangi bir numuneyi iki saatten fazla ölçmeyin.

Bu prosedürü takiben, difüzyon hızının belirli bir proteinin ekspresyon seviyesi ile nasıl ilişkili olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için görüntüleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, moleküler biyoloji ve immünoloji alanlarındaki araştırmacıların canlı hücrelerdeki proteinlerin dinamiklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.