Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir İn Vitro Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

Bu Dolaylı Kokültür Testi'nin genel amacı, astrositlerin nöronların gelişimi üzerindeki etkisini araştırmaktır. Laboratuvarımız nöron-glia etkileşimlerinin rolü ile ilgilenmektedir. Astrositlerin, merkezi sinir sisteminin bağlantı yapıları olan sinapsların oluşumuna katkıda bulunduğuna inanılmaktadır.

Rollerini incelemek için, birincil astrositleri ve birincil embriyonik nöronları ayrı bölmelerde birleştirebileceğimiz bir in vitro model tasarladık. Bölmeler, her iki hücre tipi arasındaki değişimlerin analizine izin veren geçirgen bir zar ile bağlanır. Bu yaklaşımı kullanarak, sinaps oluşumunu dört haftaya kadar olan süreler boyunca izleyebildik.

Ek olarak, bu tahlili kullanarak bir yandan astrositlerin, diğer yandan nöronların bireysel rollerini araştırmak mümkündür. Ve son olarak, o sistemdeki her iki hücre bölmesinin karşılıklı etkisine aracılık eden molekülleri içeren hücre bölmelerimizin salgısını da daha ayrıntılı olarak araştırabiliriz. Bu yöntem, nöronlar ve astrositler arasındaki etkileşimler hakkında bilgi sağlayabilir.

Ayrıca, sıçan hücreleri gibi diğer model organizmalara da uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele eder, çünkü diseksiyondan sonra hipokampal dokunun optimal olgunlaşma operasyonunu elde etmek için deneyim gereklidir. Korteksleri incelemek için, boyundan başlayarak göz hizasına kadar orta hat boyunca kafatasındaki cildi çıkarın.

Daha sonra, kafayı bir çift forseps ile rostral ucundan tutun ve kafatasının orta hattı boyunca bir kesi yapın. Ardından, beyni ortaya çıkarmak için kafatasının sol ve sağ yarısını kesin. Bundan sonra, beyni kafatasından kaldırın ve HBSS ile doldurulmuş 10 cm'lik bir petri kabına aktarın.

Tüm beyinler tabakta toplanana kadar kalan örneklerle aynı şekilde devam edin. Korteksleri ayırmak için, bir çift forseps kullanarak hindrind'i sıkıştırın. İki yarım küre arasında orta hat kesisi yapın.

Beyni dikkatlice sabitleyin ve ikinci bir çift forseps kullanarak orta beyni ve koku alma ampulünü kesin, bu da iki kortikal yarıya neden olur. Bunu takiben, bir kortikal yarıyı bir çift forseps ile sabitleyin ve meninksleri yan kenardan ayırarak soyun. Ve daha sonra ikinci bir forseps çifti kullanarak kortikal yüzeyden çekmek.

Kortikal yarıyı yüzeyi aşağı bakacak şekilde yönlendirin. Hilal şeklindeki hipokampusu dikkatlice inceleyin ve çıkarın. Daha sonra korteksleri 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın.

2 ml'lik bir reaksiyon tüpüne bir ml denem ve% 0.1 wv papain ekleyin. Süspansiyonu, çözelti berraklaşana kadar 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. Karışıma L-sistein ve DNAse ekleyin ve hafifçe çalkalayın.

Daha sonra, bir ml steril çözelti elde etmek için karışımı süzün, daha sonra kortikal dokuya ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika ila bir saat inkübe edin. Sindirim reaksiyonunu sonlandırmak için, bir ml astrosit ortamı ekleyin ve sindirilmiş dokuyu dikkatlice titre edin. Daha sonra, hücre süspansiyonuna beş ml astrosit ortamı ekleyin.

Doku tek hücreli bir süspansiyona ayrıldıktan sonra, beş dakika boyunca santrifüjleyin. Bundan sonra, süpernatanı elde edilen peletten dikkatlice aspire edin ve hücreleri bir ml astrosit ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, dokuz ml astrosit ortamı ile doldurulmuş T75 şişelerine ekleyin.

Yedi günlük kültürden sonra, hücrelerin birleşik bir tek tabaka oluşturup oluşturmadığını kontrol edin. Karbondioksitin buharlaşmasını önlemek için sıcaklığın 37 derece Santigrat'a ayarlandığından ve şişenin filtresinin laboratuvar filmi ile kapatıldığından emin olun. Progenitör hücrelerden kurtulmak ve saf bir astrosit kültürü elde etmek için, T75 şişelerini bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve kültürleri gece boyunca dakikada 250 dönüşle çalkalayın.

Ertesi gün besiyerini aspire edin ve kalıntı bölünen hücreleri ortadan kaldırmak için 20 mikromolar RSE ile doldurulmuş 10 ml taze kültür ortamı ekleyin. Bu prosedürde, 24 oyuklu plakaya gerektiği kadar kesici uç yerleştirin. Her bir parçayı ml poli d'lizin başına 10 mikrogram ile kaplayın ve bir saat inkübe edin.

Bir saat sonra, ekleri PBS ile iki kez yıkayın. Bu arada, astrosit ortamını aspire edin ve artık serumun çıkarıldığından emin olmak için kültürü bir kez 10 ml PBS ile yıkayın. Daha sonra, şişelere üç ml% 0.05 tripsin edta ekleyin ve hücreleri yaklaşık 10 dakika boyunca tripsinasyon için inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri yedi ml astrosit ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 15 ml'lik bir tüpe aktarın ve 216 x g'da beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini bir ml astrosit ortamında yeniden süspanse edin.

Bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, 24 oyuklu plakayı kuyucuk başına 500 mikrolitre astrosit ortamı ile doldurun. PBS'yi aspire edin ve 25.000 hücre ve 500 mikrolitre astrosit ortamını her bir parçaya aktarın ve kültürü 37 santigrat derecede inkübe edin.

Hipokampusu incelemek için, hazırlama ortamı ile doldurulmuş üç adet 10 cm'lik tabak ve bir ml hazırlama ortamı ile bir adet 2 ml'lik tüp hazırlayın. Hipokampusu korteks noyadees'ten ayırın ve bunları hazırlama ortamı ile doldurulmuş iki ml'lik bir tüpte toplayın. Hipokampusun CNS'nin diğer bölgelerinden bitişik bir doku olmadan izole edilmesi kritik öneme sahiptir.

Bu nedenle, hipokampus çıkarıldıktan sonra yabancı kontamine edici dokuların ek olarak çıkarılması gerekir. Diseksiyondan sonra, tüpü steril bir laminer akış tezgahına aktarın. Hazırlama ortamını dikkatlice çıkarın ve papain içeren bir ml sindirim çözeltisinin hipokampal dokusunu sindirin.

15 dakikalık sindirimden sonra, pipetle hafifçe emerek sindirim solüsyonunu dikkatlice geri çekin. Nöronun yüksek hassasiyeti nedeniyle, kabarcıkları önlemek ve optimum titrasyon yoğunluğunu elde etmek için hipokampali dikkatli bir şekilde titre etmek çok önemlidir. Yıkama döngüsü başına bir ml taze kültür ortamı ekleyerek ve dikkatlice aspire ederek hipokampusu nöron ortamı ile üç kez yıkayın.

Son yıkama adımından sonra, dokuyu bir ml nöron ortamında dikkatlice titre edin. Ardından bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın. 24 oyuklu plakanın oyuğu başına 500 mikrolitre nöron ortamında 35.000 hücre plakalayın ve nöronları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Şimdi, birleşik astrosit tek katmanları ile tohumlanmış hazırlanmış ekleri inkübatörden çıkarın. Astrosit ortamını aspire ederek ve onu 500 mikrolitre taze nöron ortamı ile değiştirerek ortamı değiştirin. Daha sonra, astrositli ekleri, steril forseps kullanarak nöron kültürlerini içeren kuyucuklara dikkatlice yerleştirin.

Daha sonra, elde edilen dolaylı nöron astrosit kokültürünü, deneylere kadar inkübatöre geri yerleştirin. Bu görüntü, hücre kültürü ekleme zarı üzerinde astrositler tarafından oluşturulan tek tabakaları göstermektedir. Astrositler GFAP ve MMP2 için immün boyalıdır.

Buradaki şema dolaylı kokültür kurulumunu göstermektedir. İki kültür fiziksel olarak ayrılmış olsa da, aynı ortamı paylaşırlar. Nöron glia etkileşimlerinin salgılanan iki moleküler aracısı, TNC'nin çoklu izoformları, doğrudan bir büyüme düzenleyicisi ve bir ekstra hücresel matris değiştirici olan MMP2 ile western blot kullanılarak ortak kültiv ortamında ortaya çıkar.

Bu görüntü, birincil nöronların, ekimin 14. gününe kadar birbirine bağlı ağlar geliştirdiğini göstermektedir. Presinaptik işaretleyici fagotun postsinaptik PSD95 iskelesi ile birlikte lokalizasyonu, yapısal olarak tamamlanan sinaptik oluşumu belgeler. Sonuç olarak, tahlil sistemimizi kullanarak, kokültür modelinde birincil astrositleri ve birincil nöronları birleştirmenin mümkün olduğunu gösterdik.

Her iki surtip de ayrıdır ancak aynı ortamı paylaşır. Bu nedenle, modelimizdeki her iki surtipin sekresyonunu da araştırabiliriz. Bu modelde sinapslar gelişir ve olgunlaşır.

Ayrıca, perinöronal ağlar gibi ek spesifik yapıların ortaya çıkışını da gösterebiliriz. Bu nedenle, model sistemimiz astrositlerin sinaps oluşumu, plastisite ve işlev üzerindeki etkisini araştırmak için çok uygundur.