Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve

Bu çalışmanın genel amacı, Zika virüsü replikasyonunu incelemek ve ilaç geliştirme için in vitro platformun kullanımını sağlamak amacıyla memeli hücresi tabanlı bir in vitro Zika virüsü enfeksiyöz kültür sisteminin kurulmasıdır. Zika virüsü enfeksiyöz hücre kültür sistemine ait bu adım adım detaylı protokol, Zika virüsünün aracılık ettiği hastalık patogenezinin mekanizmasının ve viral virülansın evriminin açıklanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilaç ve aşı geliştirme için büyük ölçekli Zika virüsü üretimine olanak tanımasıdır.

İşleme, bir T75 kültür flaskı içindeki Vero hücrelerini %80 hücre yoğunluğunda hasat ederek başlayın; bunun için flasktaki medyumu aspire edin ve hücreleri iki mililitre fosfat tamponlu salin ile durulayın. İki mililitre %0,25 tripsin ekleyin ve flaskı 37 °C'de beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tripsini inaktive etmek için serum içeren sekiz mililitre büyüme medyumu ekleyin. Ardından, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Sonrasında, 10 µL hücre alarak eşit miktarda %0,4 trypan blue ile karıştırın. Hazırlanan karışımı hücre sayım odası lamına yükleyin ve otomatik bir hücre sayıcı kullanarak canlı hücrelerin sayısını belirleyin. Toplam yedi milyon hücreyi, 30 mililitrelik bir hacimde T160 flaskına ekleyin. Ertesi gün, flask başına 10 mililitrelik serumsuz kültür medyumunda uygun enfeksiyon çokluğu değerinde Zika virüsü inokülümü hazırlayın.

Enfeksiyonun yayılmasını önlemek için virüsün güvenli bir şekildelele alınması kritik öneme sahiptir.

Kullanılmış besiyerini T160 flaskından uzaklaştırın ve ardından taze hazırlanmış viral inokulumun tamamını (10 milliliters) ekleyin. İnoküle edilmiş flaskları 37 degrees Celsius sıcaklıkta ve %5CO2 altında dört ila altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun her saatinde flaskı nazikçe yanlara doğru eğerek inokulumu yayın. İnkübasyon tamamlandığında, inokulumu 30 milliliters ılık serum takviyeli büyüme besiyeri ile değiştirin. Ardından, viral kültüre sonraki 96 saat boyunca devam edin. Dört gün sonra, faz kontrast mikroskobu kullanarak hücre monotabakası üzerindeki viral plakların oluşumunu gözlemleyin ve enfeksiyonun ilerleyişini doğrulayın. Gerektiğinde 40x ve 200x büyütmede görüntüler alın.

Hücre kültürü süpernatanlarını 96. saat zaman noktasında toplayın ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için süpernatanı 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 ×g'de santrifüj edin. Santrifüj işleminden sonra, çökelmiş kalıntıları rahatsız etmeden süpernatanları dikkatlice alın ve 15 ml'lik tüplere aktarın.

Viral kültür süpernatantlarını, -80 °C'de birden fazla alikot halinde saklayın.

Virüs titrasyonu yapmak için, öncelikle saf Vero hücrelerini 2 mL hacimdeki bir kuyucuk başına 1×10⁵ hücre olacak şekilde 12 kuyucuklu bir plakaya ekin. Ertesi gün, serumsuz ortam kullanarak T160 flaskından toplanan viral kültür süpernatantlarının on katlık seri dilüsyonlarını hazırlayın.

Titre tayinleri için viral kültür süpernatantının seri dilüsyonlarını hazırlarken, enfeksiyonu önlemek amacıyla virüsle güvenli bir şekilde çalıştığınızdan emin olun.

Ardından, Vero hücreleri içeren 12 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğundaki kullanılmış besiyerini uzaklaştırın ve Vero hücrelerinin üzerine üç tekrarlı olarak 400 µL dilüe edilmiş inokülum ekleyin. İnoküle edilen plakaları doku kültürü inkübatöründe dört ila altı saat boyunca inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, inokülümü kuyuk başına iki mililitre serum destekli besiyeri ile değiştirin. İnokülasyondan 48 saat sonra, uygun dilüsyonlardaki viral odakları faz kontrast mikroskobu kullanarak sayın. Viral titreyi mililitre başına plak oluşturan birim olarak hesaplayın.

Vero hücreleri 12 kuyucuklu plakada yüksek ve düşük titreli Zika virüsü ile inoküle edilip 48 ve 96 saat inkübe edildikten sonra, genom replikasyonu, Zika virüsü genomunun ekspresyonu için kantitatif PCR ile ve çift sarmallı RNA için immünositokimya ile değerlendirilir.

İmmünositokimya için, 12 kuyucuklu plakanın kuyucuklarındaki besiyerini uzaklaştırın ve her kuyucuğa bir mililitre metanol ekleyin. Hücrelerin 4 °C'de 30 dakika boyunca fikse olmasını sağlayın. Ardından, fikse edilmiş hücreleri üç kez 1x PBS ile yıkayın. Daha sonra bloklama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Fare monoklonal anti-çift zincirli RNA antikoru J2'yi bloklama tamponu ile 1:100 oranında seyreltin, hücrelere ekleyin ve hücreleri bu solüsyonda 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, keçi anti-fare IgG-594 sekonder antikorunu bloklama tamponu ile 1:1.000 oranında seyreltin; hücreleri 1x PBS ile yıkadıktan sonra antikoru hücrelere ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Hücreleri 1x PBS ile yıkadıktan sonra, çekirdekleri boyamak için Hoechst boyası kullanın ve hücreleri 100x büyütmede floresan mikroskop altında inceleyin.

Daha önce yapıldığı gibi, naive Vero hücreleri ile 12 kuyucuklu bir plak ektikten altı saat sonra, ilgilenilen sitokinleri belirtilen konsantrasyonlarda biyolojik dublikatlarda ekleyin. İşlemden 12 saat sonra Zika virüsü enfeksiyonunu gerçekleştirin ve enfeksiyon uygulanmamış negatif kontrol kuyucukları ekleyin. Enfeksiyondan dört saat sonra viral inokülumu sitokin işlem görmüş medium ile değiştirin ve ardından hücreleri 37 °C'de 44 saat daha inkübe edin. Enfeksiyondan 48 saat sonra, faz kontrast mikroskobu kullanarak viral plakları sayın ve enfekte hücrelerin 40x büyütmedeki temsilci görüntülerini alın.

Bu grafik, RT-qPCR ile ölçülen Zika virüsü genomik içeriğini göstermektedir. Hem Pan genotip hem de PRVABC-59 suşu primerleri eşit hassasiyet ve özgüllük göstermiştir. Beklendiği üzere, hepatit-C viral primerleri herhangi bir ürün amplifiye etmemiştir.

Düşük ve yüksek titre enfekte hücrelerde, enfekte edilmemiş mock kontrol ile karşılaştırıldığında, belirtilen zaman noktalarındaki Zika viral büyüme kinetikleri burada gösterilmiştir. İmmünositokimya analizinden elde edilen sonuçlar, enfeksiyondan 48 saat sonra enfekte hücrelerin birkaç kümeler halinde olduğunu, enfeksiyondan 96 saat sonra ise hücrelerin çoğunun enfekte olduğunu göstermektedir. Bu grafik, çeşitli sitokinlerin Zika viral büyümesi üzerindeki modülasyonunu, araç (vehicle) kontrolü ile karşılaştırarak göstermektedir.

Bu faz-kontrast görüntüleri, sitokin tedavisi uygulanmış veya uygulanmamış Zika virüsü enfekte hücrelerini göstermektedir. Enfekte hücreler tarafından oluşturulan viral plaklar odak noktaları şeklinde görülebilir. İnterferon ile tedavi edilen kuyucuklarda viral plakların bulunmadığına dikkat ediniz.

Bu prosedürün ardından, hastalık patogenezi mekanizmasının aydınlatılması ve viral virülansın evrimi gibi ek soruları yanıtlamak için, sivrisinek ve insan hücrelerinde viral protein lokalizasyonu ve replikasyonu için Zika virüsü yüksek çözünürlüklü domain haritalama gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, Zika virüsü replikasyonunu incelemek için memeli hücresi tabanlı in vitro Zika virüsü enfektif kültür sisteminin nasıl kurulacağına ve ilaç ve aşı geliştirme için in vitro platformun kullanımına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.