Name: Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve İn Vitro profilaktik etkisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Öğrenin, Vero hücreleri kullanarak Zika virüsü için bulaşıcı hücre kültürü sistemi kurmayı. Bu yöntem, virüs replikasyonunu incelemeyi ve ilaç geliştirme çalışmalarını desteklemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri'nden (CDC) Dr. Aaron Brault ve Dr. Brandy Russell'a Zika viral suşunun PRVABC59 sağladıkları için teşekkür ederiz. Yale Üniversitesi'nden Nicholas Ten'e bu el yazmasını kopyaladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Cedars-Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Programatik Araştırma Ödülü tarafından V.A. tarafından desteklenmiştir.

Not: iş akışının şematik taslağı Şekil 1&#39;de sunulmuştur. 1. Hücreler <ol><li> Zika virüs üretimini ve viral replikasyon döngüsü analizi için Vero hücreleri kullanır. </li><li> Tam,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, penisilin (100 birim / ml), streptomisin ihtiva eden büyüme ortamı (100 birim / ml) ve 10 mM HEPES hazırlayın. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de belirtilen tam büyüme ortamı ile kültür Vero hücreleri. </li></ol> 2. Zika Virüs Üretimi <ol><li> T-75 balonuna% 0.25 tripsin kullanılarak% 80 hücre yoğunluğunda Vero hücreleri hasat ve hücreleri saymak. <ol><li> T-75 kültür şişelerinde ortamı aspire ve 2 ml fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkayın. </li><li> % 0.25 tripsin 2 ml ilave edilir ve 5 dakika için 37 ° C &#39;de balon inkübe edin. </li><li> Tripsin etkisiz hale getirmek için bir büyüme ortamı içeren serum 8 ml ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı suspend hücreler 15 ml tüp hücreleri transferi vb. </li><li> hücrelerin 10 ul çıkarın ve% 0.4 tripan mavisi eşit miktarda karıştırın. hücre sayım odası slayt hazırlanan karışımı yükleyin ve otomatik kan sayım cihazının kullanıldığı sayımları canlı hücre elde. </li></ol></li><li> T-160 şişesi içine 30 ml hacim içinde 7.000.000 hücre toplam tohum. </li><li> Ertesi gün, şişesi başına 10 ml serum serbest kültür ortamı Zika virüs inokulum (0.1 İçişleri Bakanlığı 0.01) enfeksiyon uygun bir çokluğu hazırlar. </li><li> T-160 şişesi harcanan Ortamı çıkarın ve taze hazırlanmış viral inoculum (10 mi) ilave edin. </li><li> 4-6 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inoküle şişeleri inkübe edin. yavaşça her saatte yan şişeleri eğerek inokulum yayıldı. </li><li> İnkübasyonun tamamlanmasından sonra, her şişenin sıcak serum desteklenmiş büyüme ortamı (30 mi) ile inokulum değiştirin. Ardından bir sonraki 96 saat boyunca viral kültür devam ediyor. </li><li> içinde ilerlemesini doğrulamaBir faz kontrast mikroskobu kullanarak ve 40X ve 200X büyütmede gerektiği gibi görüntüleri (Şekil 2) almak hücre tek tabaka viral plakların görünümünü gözlemleyerek Fection. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54767/54767fig2.jpg" /> Şekil 2:. Çeşitli büyütme Vero hücrelerinin bir tek tabaka üzerinde Zika virüs tarafından oluşturulmuş Plaklar Aydınlık alan ve görüntüler 48 HPI de Zika virüs plakları göstermektedir. tek tabaka yuvarlak hücre odakları varlığını unutmayın. (Ölçek çubuğu = 50 um) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54767/54767fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="8"><li> 96 saat zaman noktasında ve santrifüj 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de süpernatan hasat hücre kültürü süpernatanları hücre debrisini uzaklaştırmak için. </li><li> Dikkatle rahatsız pelet haline enkaz ve transfer t olmadan süpernatant kaldırmak15 ml tüpler o. 24.000 xg, ultra santrifüje (isteğe bağlı), viral parçacıklar konsantre gerçekleştirilebilir. </li><li> -80 ° C &#39;de birden fazla alikotları viral kültür süpernatanlarının saklayın. </li></ol> Plak Testi ile 3. Ölçme Zika Virüs Titre <ol><li> 12 oyuklu bir plaka kullanılarak 2 ml hacim içinde oyuk başına 1 x 10 5 hücre Tohum naif Vero hücreleri. </li><li> Ertesi gün, serumsuz ortam kullanılarak T-160 şişesi toplanan virüs kültürü yüzen maddelerinin seri seyreltil 10 kat hazırlar. Her harcanan medyayı iyi çıkarın ve üç kopya halinde Vero hücrelerinde üzerine hazırlanan inokulum 400 ul ekleyin. </li><li> 37 aşılandı şişeler inkübe 4-6 saat boyunca% 5 CO2 ile ° C. yavaşça her bir saatte yana plaka eğerek inokulum yayıldı. </li><li> İnkübasyonun sonunda, serum takviye ortamla inokulum (oyuk başına 2 mi) değiştirin. </li><li> 48 saat sonrası aşılama at, bir faz Contr kullanılarak viral odağını saymakast mikroskop. ml başına plak oluşturucu birim (pfu) gibi viral titresi hesaplanır. Plak analizi için Şekil 3&#39;e bakınız. </li><li> Düzeltmek ve plakların açık bir görünüm için% 20 etanol içinde hazırlanmıştır% 4 formaldehit hücreleri ve% 0.1 kristal mor çözelti leke. </li></ol> 4. Zika Viral genom replikasyonu Deneyi <ol><li> 12 oyuklu bir plaka kullanılarak 2 mi hacminde göz başına 1 x 10 5 hücre Tohum saf Vero hücreleri. üç kopya halinde serumsuz ortam kullanılarak, düşük ve yüksek titresi, Ertesi gün, viral inokulum (400 ul / göz, 0.01 ve 0.1 arasında MOI) hazırlanması. sahte enfeksiyon için, serumsuz ortam (400 ul / göz) kullanın. </li><li> 3.4 adımları 3.2 tekrarlayın. </li><li> 48 ve 96 saat zaman noktalarında, RNA ve immunositokimya (ICC) için numune toplayın. <ol><li> hasat RNA örnekleri için, ortamı çıkartın ve sonra lizatları iyi doğrudan her lizis çözeltisi 400 ul ekleyin ve toplamak. </li><li> ICC, medya ve t kaldırmakTavuk her bir metanolün 1 mi ekleyerek hücreleri düzeltmek ve 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe plakası. </li><li> hücre lizatından, üreticinin talimatlarına göre, bir RNA izolasyon kiti kullanılarak toplam RNA izole eder. Bir spektrofotometre kullanılarak RNA sayısal olarak. </li></ol></li><li> Hasat RNA&#39;dan ZIKV genom içeriğini belirlemek için, iki aşamalı bir ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) uygulayın. <ol><li> RNA nın ters transkripsiyonunu için, ilk olarak, 0.2 ml tüp içinde izole edilmiş RNA 5 ug, dNTP (10 mM) 1 ul, 1 ul rastgele heksamer (250 ng) içeren bir 13 ul reaksiyon karışımı ayarlayın. 5 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta bir tüp inkübe ve daha sonra bir dakika süreyle buz üzerine yerleştirin. Daha sonra, ters transkriptazın 1 ul 5x iplik sentez tamponu 4 ul 0.1 M ditiyotreitol ve 1 ul ve reaksiyon karışımı RNaz inhibitörü 1 ul ekle. 50 ° C ve inactiv 60 dakika, ardından 25 ° C&#39;de ek 5 dakika boyunca tüp inkübe15 dakika boyunca 70 ° C&#39;de ısıtılarak reaksiyon yedi. </li><li> qPCR 2x yeşil boya süper karışımı 12.5 ul içeren DNA polimeraz ve Zika virüsü [için Zika virüs pan-genotip primerler (spesifik 10 mM bireysel primerlerin 1 ul sonuçlanan cDNA 1 ul kullanarak gerçekleştirin: 5&#39;-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 &#39; ; Rev: 5&#39;-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 &#39;), Zika virüsü Asya genotip PRVABC59 soyu primerler (5&#39;-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3&#39;; Rev: 5&#39;-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 &#39;)], ya da hepatit C virüsü (JFH RTQ F: 5 &#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3&#39;) için veya hücresel ev bakıcısı geni GAPDH (: 5&#39;-CCACCTTTGACGCTGGG-3 &#39;; Rev: 5&#39;-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3&#39;), bir 25 ul reaksiyon hacmi içinde. </li><li> çalışma durumunu 15 sn için 95 ° C, gerçek zamanlı PCR sistemi içinde 30 sn (40 döngü) 60 ° C ile PCR gerçekleştirin. </li><li> Z normalleştirmek için döngü eşiğe göre (Ct) değeri GAPDH ifade düzeyini kullanmakika viral genomun ölçümü. GAPDH kıyasla Zika genomunun delta Ct (ACt) değerini hesaplayın ve 2 ACt değerini elde. Daha sonra, belirtilen zaman noktalarında enfekte olan ve olmayan hücreler arasında normalize Zika genom içerik oranı alınarak kat değişimi hesaplamak. ZIKV genom çoğaltma sonuçları için bakınız Şekil 4. </li></ol></li><li> metanol sabit hücreler kullanılarak ICC gerçekleştirin. <ol><li> (PBS içinde% 0.1 Triton-X 100,% 3 keçi serumu,% 3 BSA) 1 x PBS ile sabitlenmiş hücreler üç kez yıkayın ve ICC bloke tamponu ile bloklayın. </li><li> bloke edici tampon içinde 100 ve 4 ° C&#39;de gece boyunca inkübe: 1 seyreltme fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2 (1 ug / ml) kullanın. </li><li> 1x hücrelerin PBS ile yıkayın ve 1 de ikincil antikor keçi anti-fare IgG-594 (1 ug / ml) ekleyin: bloke tamponu içinde 1.000 seyreltme ve oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edin. </li><li> Hoechst boyası kullanılarak çekirdekleri için 1x PBS ve leke hücreleri yıkayın ve100X büyütmede bir floresan mikroskop (Şekil 4) kullanarak hücrelerin gözlemleyin. </li></ol></li></ol> Zika virüs enfeksiyonuna karşı sitokin kütüphane tarama 5. <ol><li> De 12 oyuklu plaka kullanılarak göz başına 1 x 10 5 hücre naif Vero hücreleri tohumu. Hücreler (6 saat Ekim sonrası) birleştirildikten sonra, biyolojik çiftleri belirtilen konsantrasyonlarda (2 ml hacim / oyuk) her bir sitokin ekleyin. Araç (PBS) tek başına kontrol içerir. </li><li> 12 saat tedavi sonrası, Zika viral enfeksiyon (kuyu başına 0.1 400 ul İçişleri Bakanlığı) gerçekleştirin. enfeksiyon (sahte) olmadan negatif kontrol kuyuları yer alır. </li><li> 4 saat sonrası enfeksiyon, sitokin muamele ortam (2 mi) ile, viral aşının değiştirin. Ek 44 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 48 saat sonrası enfeksiyon, bir faz kontrast mikroskop kullanılarak viral plaklar sayısı ve 40X büyütmede (Şekil 5) ile enfekte hücrelerin temsili görüntüler elde. </li></ol>

<ol><li>Brasil, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Pregnant+Women+in+Rio+de+Janeiro+-+Preliminary+Report%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report.</a> N Engl J Med. , 1-11 (2016).</li>
<li>Lucey, D. R., Gostin, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emerging+Zika+Pandemic%3A+Enhancing+Preparedness%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness.</a> JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).</li>
<li>Mlakar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Associated+with+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Associated with Microcephaly.</a> N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).</li>
<li>Schuler-Faccini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+Association+Between+Zika+Virus+Infection+and+Microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Morb+Mortal+Wkly+Rep%22%5BJournal%5D)">Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).</li>
<li>Foy, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probable+non-vector-borne+transmission+of+Zika+virus%2C+Colorado%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA.</a> Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).</li>
<li>Kuno, G., Chang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+sequencing+and+genomic+characterization+of+Bagaza%2C+Kedougou%2C+and+Zika+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses.</a> Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).</li>
<li>Dick, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).</li>
<li>Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).</li>
<li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome--case+report%2C+French+Polynesia%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia.</a> Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).</li>
<li>Baronti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+coding+sequence+of+zika+virus+from+a+French+polynesia+outbreak+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013.</a> Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic%2C+Yap+State%2C+Micronesia%2C+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).</li>
<li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+Zika+virus+in+Western+Hemisphere%2C+2015+%5BLetter%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter].</a> Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).</li>
<li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).</li>
<li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infects+Human+Cortical+Neural+Progenitors+and+Attenuates+Their+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth.</a> Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).</li>
<li>Hamel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+Zika+Virus+Infection+in+Human+Skin+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells.</a> J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+detection+of+Zika+virus+and+evaluation+with+field-caught+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes.</a> Virol J. 10, 311(2013).</li>
<li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li>
<li>Hiratsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+interferon-alpha+during+pregnancy%3A+effects+on+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Perinat+Med%22%5BJournal%5D)">Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus.</a> J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).</li>
<li>Ozaslan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+therapy+for+acute+hepatitis+C+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy.</a> Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, in vitro Zika virüsü kültürü için bir aerodinamik protokol sunulmuştur. Virüs kültürü genişleyen titresi ölçmek ve sağlanan genom replikasyonu ölçülmesi için en uygun uç noktalarının belirlenmesi de dahil olmak üzere kritik adımlar. Zika virüsü enfeksiyon ajanlarını işlerken, biyogüvenlik prosedürleri sıkı takip edilmelidir, bir insan patojeni, yani. Bir maymun böbrek hücre çizgisi, Vero çeşitli virolojik ölçümlerde göstermek için kullanılmıştır. Zika viral replikasyon kinetiği, çeşitli doku ve tür hücr...

Zika Virüsü (ZIKV) mikrosefali ve kötü gebelik 1,4 çıktıları ile ilişkili önemli bir patojendir. ZIKV gibi Dengue, Batı Nil, ve St Louis ensefalit virüsleri gibi nörolojik bozukluklara neden olabilir tıbben ilgili flavivirüslerin kümesine aittir. Viral başlıca bulaşma ek olarak, cinsel iletim de 5,6 rapor edilmiştir, sivrisinek vektörü Aedes aegypti tarafından ve. ZIKV nedeniyle sivrisinek vektör genişleyen coğrafi dağılımı ve doğum kusurları ile güçlü korelasyon büyük bir küresel sağlık sorunu haline gelmiştir. ZIKV ilk Zika ormanda bir sentinel rhesus maymun 1947 yılında izole edilmiştir, Uganda ve ilk insan olgusu 1952 7,8 bildirildi. ateş, döküntü, baş ağrısı, konjunktivit ve kas / eklem ağrısı gibi hafif belirtileri olan mevcut ZIKV ile enfekte bireyler. Enfekte hamile kadınlar gelişmekte olan fetus 1&#39;e ZIKV iletebilir. ZĐKV enfeksiyonu da Guillain-Barre sendromu, periferik sinir oto-immün demiyelinasyon hastalığı 9 ile bağlantılı olmuştur. Zika viral genomun uzunluğu yaklaşık 10.8 kilobaz olan bir pozitif sens, tek iplikçikli bir RNA molekülü içerir. genomun yapısı, bir protein-kodlama bölümünü eteklendiren kodlayıcı olmayan bölgeleri (NCR) ile 5&#39;NCR-Cı-prM-e-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-2K-NS5-3&#39;NCR olarak düzenlenmiş 6. Tek bir poliprotein (3419 aa) o eş ve post-translasyonel 10 daha küçük peptidler halinde bölünmüş olan çevrilmiştir. 5&#39;NCR ve 3&#39;NCR RNA kök döngü yapıları Hem viral genomun çeviri ve replikasyon başlamasından kritik bir rol oynar. genomun yapısal bileşenleri kapsid, membran ve zarf proteinlerinin oluşmaktadır. yapısal olmayan proteinleri genom replikasyonu için kritik öneme sahiptir. Şu anda, Zika viral suşları üç ana genotipler ayrılır: Batı AfrikaDoğu Afrika ve Asya 6,10-13. Bu teklif edildiğini daha sonra daha 12 gelişti Batı Afrika ve Asya&#39;ya yayıldı Doğu Afrika soy. Asya genotip Amerika&#39;da mevcut salgınlar sorumludur. Zika virüsü sivrisinek ve memeli hücrelerinde hem de kültürlenebilir. Primer dermal fibroblastlar, olgunlaşmamış dendritik hücreler, kortikal nöral projenitör hücreleri, Vero hücreleri, Zika viral enfeksiyona 10,14,15 duyarlıdırlar. Hem tip I ve tip II interferonlar cilt fibroblastlar 15 ZIKV büyümesini sınırlamak için gösterilmiştir. Bu çalışmanın amacı, bir memeli hücre kültür sistemi, üretim ve Asya genotip ZIKA virüs tipi PRVABC59 deneyleri için aşamalı bir ayrıntılı protokol sağlamak ve ilaç geliştirme ortamı olarak, bu enfeksiyon kültür sisteminin kullanılmasını göstermek için vardır. Bu kaynak büyük ölçüde daha i aydınlatmak için Zika viral ve nörolojik araştırma toplum yararına potansiyeline sahipViral patogenez ve viral virulans evrimi ts mekanizmaları.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)</td><td>Sigma Yaşam Bilimleri</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>%2,5 Tripsin, 10x [-] Fenol Kırmızı&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-054-C1</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke %0.4Yaşam</td> <td>Teknolojileri</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Kontes &ndash; Otomatik Hücre Sayacı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Kontes hücre sayımı ve oda slaytları</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>fare monoklonal anti-dsRNA antikoru J2&nbsp;</td><td>İngilizce & Bilimsel Danışmanlık Kft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 594</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX, ROX ILE</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11744500</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio12K Flex Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Thermo Fischer</td><td>4471088</td><td></td></tr><tr><td>RNase İçermeyen DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Vero Hücre Hattı&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td></td></tr><tr><td>Zika viral suşu PRVABC59</td><td>Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 alfa&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>200-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa</td><td>Peprotech</td><td>300-01A&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İnterferon alfa A&nbsp; &nbsp;</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>İnterferon beta</td><td>Peprotech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>İnterferon gama</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti İmmünofloresan Mikroskobu, Nikon Intenselight C-HGFI</td><td>ile Nikon</td><td>Ziyareti İstek</td><td></td> için Nikon</tr></tbody></table>

zika virüs bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virüsü (ZIKV), mikrosefali, göz kusurları, ve bozulmuş büyüme gibi fetal gelişim anomalileri bağlı ortaya çıkan bir patojendir. ZIKV Flaviviridae ailesinin bir RNA virüsüdür. ZIKV esas sivrisinekler tarafından iletilir, ama aynı zamanda fetal dikey geçiş yanı sıra cinsel temas için maternal tarafından yayılır. Bugüne kadar, virüs tarafından enfekte olanlar korumak için hiçbir güvenilir tedavi veya aşı seçenekleri vardır. tekrarlanabilir etkili Zika virüsü enfeksiyon hücre kültür sisteminin geliştirilmesi ZIKV çoğaltma gibi aşı ve ilaç geliştirme moleküler mekanizmalarının incelenmesi için kritik önem taşır. Bu bağlamda, virüs üretimi ve büyüme analizi için bir memeli hücresi bazlı in vitro Zika virüs kültür sistemi açıklayan bir protokol burada rapor edilmektedir. viral titresi ölçmek için bir hücre tek ve plak deneyi ile ilgili Zika virüsünün plakların oluşumu ile ilgili ayrıntılar sunulmaktadır. Viral genomun replikasyonu kinetiğive çift kollu bir RNA genomu replicatory ara belirlenir. Bu kültür platformu, interferon-a (IFN-α) tanımlanmasında ortaya çıkan küçük sitokin kümesinin bir kütüphanede karşı ekran için kullanılmıştır, IFN-β ve Zika viral büyüme potent inhibitörleri olarak, IFN-γ. Özetle, bir in vitro enfeksiyon Zika viral kültür sistemi ve çeşitli virolojik deneyler büyük ölçüde daha viral patogenez mekanizmaları ve viral virulans evrimini durulaştırmada araştırma toplum yararına potansiyeline sahip bu çalışmada, ortaya konmuştur. Antiviral IFN-alfa ayrıca enfekte hamile kadınlar da dahil olmak üzere yüksek riskli toplumlarda Zika virüs enfeksiyonları için profilaktik, maruziyet sonrası profilaktik ve tedavi seçeneği olarak değerlendirilebilir.

Bir Zika viral suşu, Asya genotip (PRVABC59 GenBank erişim numarası KU501215) Bu çalışmada 12 kullanılmıştır. % 80 birleşme Vero hücreleri de novo Zika viral enfeksiyon araştırmak için kullanıldı. Viral üretiminde ve daha sonra virolojik karakterizasyonu için, erken geçit (P3) Zika virüsü kullanılmıştır. Viral plaklar enfeksiyon ikinci gününde gözlendi. Başlangıçta enfekte olan hücre serbest Zika, viral yavrularıyla tek tabakalı kültürü (Şekil 2) görü...

Ortaya çıkan bir patojen olan Zika Virüsü (ZIKV), fetal gelişimsel anormallikler ve mikrosefali ile bağlantılıdır. Etkili bir enfeksiyöz hücre kültürü sisteminin kurulması, ZIKV replikasyonu çalışmalarının yanı sıra aşı ve ilaç geliştirme çalışmaları için de çok önemlidir. Bu çalışmada ZIKV ile ilgili çeşitli virolojik analizler gösterilmiş ve tartışılmıştır.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Bu çalışmanın genel amacı, Zika virüsü replikasyonunu incelemek ve ilaç geliştirme için in vitro platformun kullanımını sağlamak amacıyla memeli hücresi tabanlı bir in vitro Zika virüsü enfeksiyöz kültür sisteminin kurulmasıdır. Zika virüsü enfeksiyöz hücre kültür sistemine ait bu adım adım detaylı protokol, Zika virüsünün aracılık ettiği hastalık patogenezinin mekanizmasının ve viral virülansın evriminin açıklanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, ilaç ve aşı geliştirme için büyük ölçekli Zika virüsü üretimine olanak tanımasıdır.İşleme, bir T75 kültür flaskı içindeki Vero hücrelerini %80 hücre yoğunluğunda hasat ederek başlayın; bunun için flasktaki medyumu aspire edin ve hücreleri iki mililitre fosfat tamponlu salin ile durulayın. İki mililitre %0,25 tripsin ekleyin ve flaskı 37 °C'de beş dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tripsini inaktive etmek için serum içeren sekiz mililitre büyüme medyumu ekleyin. Ardından, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Sonrasında, 10 µL hücre alarak eşit miktarda %0,4 trypan blue ile karıştırın. Hazırlanan karışımı hücre sayım odası lamına yükleyin ve otomatik bir hücre sayıcı kullanarak canlı hücrelerin sayısını beli

zika-virus-infectious-cell-culture-system-vitro-prophylactic-effect

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, Zika Virüsü Nekahet Serumu kullanılarak Dang virüsü enfeksiyonunun antikora bağlı artışını (ADE) ölçmek için yapılan bir test gösterilmektedir. Tahlil, yeşil bir floresan proteini kodlayan Dang muhabiri viral partiküllerini (RVP'ler) kullanır. Zika Virüsüne karşı serum antikorları, bir kompleks oluşturmak için RVP'lerle çapraz reaksiyona girer. Bağlı antikorlar, akış sitometrisi kullanılarak tespit edilen Fc reseptörünü eksprese eden hücreler tarafından RVP alımını arttırır.

Viral Enfeksiyonun Antikora Bağlı Artışını İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Video, bir insan patojeni olan Zika virüsüne karşı antiviral aktiviteye sahip interferonların taranması için bir in vitro testi göstermektedir. Konakçı hücre içinde, Zika virüsü içselleştirildikten sonra çoğalır, komşu hücreleri enfekte eder ve farklı bölgeler veya viral plaklar oluşturur. Antiviral bir ajan olarak işlev gören tip I interferon, virüs çoğalmasını engeller, böylece konak hücre tek tabakasında viral plakların oluşumunu önler.

Zika Virüsü Büyümesinin Güçlü İnhibitörleri Olarak İnterferonları Taramak için İn Vitro Test

Bu video, insan fetal nöral kök hücrelerini Zika virüsü ile enfekte etmek için bir prosedürü göstermektedir. Enfekte olmuş hücreler daha ileri çalışmalar için kullanılabilir.

Fetal Nöral Kök Hücrelerin Zika Virüsü Enfeksiyonu

Bu protokol, iki-plazmid bulaşıcı bir cDNA klonundan bulaşıcı Zika virüsünün iyileşmesini tanımlıyor.

Yeni Bir Dünyadan Rekombinant Virüsün Kurtarılması ve Karakterizasyonu Zika Virüsü Bulaşıcı Klon

Burada fare Zika virüs kaynaklı microcephaly bir model oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin-sahne intraserebral aşılama Zika şunun için yöntemler içerir.

İntraserebral enjeksiyon stratejileri kullanarak Zika virüs kaynaklı nörolojik bozukluklar için fare modelleri oluşturma: embriyonik, Yenidoğan ve yetişkin

Bu makalede insan fetal beyin sinir kök hücreleri kültür, hem de onları içine çeşitli nöronal alt türlerini ve astrocytes sinir kök hücreleri Zika virüs enfeksiyonu çalışmaya kullanımı üzerine vurgu ile ayırt etmek nasıl genişletmek için kullanılan yöntemleri ayrıntıları.

Kültürlü insan Fetal beyin sinir kök hücreleri Zika virüs enfeksiyonu Immunocytochemical analiz için

Ifnar1- / - fare modeli immunoprivileged organlarda Zika virüs (ZIKV) enfeksiyon için antijen spesifik T-hücre yanıtları değerlendirmek için bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem koruma hücresel mekanizmaları ve immunopathogenesis ZIKV aşı soruşturma için çok önemli ve aynı zamanda onların etkinliğini değerlendirme için değerlidir.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

Biz insan serumu, birincil insan hücreleri ve enfeksiyon miktar nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu tarafından kullanarak Zika virüs enfeksiyonu önceden varolan bağışıklık dang virüs karşı etkisini değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

Protokolün amacı, enfeksiyon sonrasında faredeki birden fazla organdan Zika virüsünü izole ederek ve ölçerek viral hastalıkları araştırmak için kullanılan teknikleri göstermektir.

Farede Birden Fazla Organdan Zika Virüsünün İzolasyon ve Nicelikselleştirilmesi

Bu çalışmada, Zika virüsü replikasyonunun inhibitörlerini yüksek verimli bir tarama formatında taramak için replikon bazlı ve viral enzim bazlı tahlillerde kullanılan protokolleri açıklıyoruz.

Zika Virüs Replikasyonunun inhibitörlerini taramak için yüksek verimli Antiviral Tahliller

Burada, insan hücrelerinde Zika virüsü enfeksiyonunu ve replikasyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için çok kolay ve basit bir yöntem olarak hücre bazlı elektriksel empedansın (CEI) kullanımını gösteriyoruz. Ayrıca, CEI testi antiviral bileşiklerin değerlendirilmesi için yararlıdır.

Zika Virüsü İnhibitörlerini Gerçek Zamanlı Olarak Değerlendirmek için Hücre Tabanlı Elektriksel Empedans Platformu

Öğrenin, Vero hücreleri kullanarak Zika virüsü için bulaşıcı hücre kültürü sistemi kurmayı. Bu yöntem, virüs replikasyonunu incelemeyi ve ilaç geliştirme çalışmalarını desteklemeyi sağlar.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve

Daha fazla video keşfet