Fare Çin-atriyal düğüm yüksek çözünürlüklü optik Haritalama

Bu deneysel protokolün genel amacı, sağlam bir Langendorff-perfüze kalp veya izole bir atriyum preparasyonundan fare sinoatriyal düğümünün optik haritalamasını gerçekleştirmektir. Bu yöntem, sinoatriyal düğüm elektro- ve patofizyolojisi alanında pacemaker anormallikleri, hasta sinüs sendromu ve çeşitli hastalıklarla ilişkili atriyal aritmilerin mekanizmaları hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sağlam dokularda çok yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle birden fazla parametrenin incelenmesine olanak tanımasıdır.

Parmak sıkıştırma yöntemiyle uygun anestezi seviyesi doğrulandıktan sonra, toraksun ön kısmında bir santimetrelik bir insizyon yapmak için kavisli 5.5 inch Mayo makası ve 5.5 inch Kelly Hemostatik Pens kullanın. Dört inch kavisli Iris Pensi kullanarak akciğer dokusunu hızla kavrayın ve akciğer, timus ve kalbi perikardiyumla birlikte çıkarmak için dört üçte bir inch Iris makası kullanın. Dokuları oksijenlenmiş 37 derece Celsius modifiye Tyrode solüsyonu ile yıkayın.

Ardından, kalpten akciğeri, timusu ve yağ dokusunu uzaklaştırmak için kavisli üç inçlik Vannas Tubingen makası ve dört üçte bir inçlik beş numara pens kullanın. Sonrasında, aortu kanüle etmek için özel yapım 21 gauge kanül ve iki adet kavisli 4.3 inçlik beş numara B pensi kullanın; koroner dolaşımın tıkanmasını önlemek amacıyla, perfüzyondan önce çözeltiyi hat içi 11 mikronluk naylon filtreden geçirerek kalbe aynı anda 37 °C Tyrode çözeltisi ile perfüzyon ve superfüzyon uygulayın. Daha sonra, aort basıncını izlemek için perfüzyon hattındaki bir Luer kilidine üç yollu bir musluk aracılığıyla bir basınç transduseri bağlayın ve gerektiğinde aort basıncını 60 ile 80 mmHg arasında tutacak şekilde perfüzyon hızını ayarlayın.

Langendorff perfüzyonlu bir kalpte sinoatriyal düğümün optik haritalaması için, organı posterior tarafı yukarıya bakacak şekilde yatay konumda cam bir doku organ banyosu haznesine yerleştirin ve deney sırasında akış kaynaklı hareketleri önlemek için ventrikül apeksini haznenin silikon kaplı tabanına 0,1 milimetre çapındaki pinlerle sabitleyin. Pulmoner ven, sol atriyum ve mitral kapak üzerinden sol ventriküle küçük bir silikon tüp yerleştirin ve tüpü çevre dokuya sabitlemek için 40 ipek sütür kullanın. Ardından, superiyor ve inferior vena cava'ları bağlamak için başka bir 40 ipek sütür kullanın ve sağ atriyal apendiksin kenarını hazne tabanına pinleyin.

Sütürün diğer ucunu gererek odacığın tabanına iğneleyin ve sağ atriyum apendiksinin kenarına özel yapım bir pacing elektrodu yerleştirin. Ardından, sağ ve sol ventriküllerin tabanına yakın bölgelere iki adet 12 milimetrelik iğne monopolar elektrokardiyogram elektrodu yerleştirin ve topraklama elektrokardiyogram elektrodunu ventrikül apeksinin yakınına yerleştirin. Dokuyu boyamak için, seyreltilmiş boyayı beş ila yedi dakikalık bir süre boyunca iletilmek üzere koroner perfüzyon hattının bir hat içi perfüzyon portuna enjekte edin.

20 dakikalık stabilizasyonun ardından, perfüzat içerisine 0,5 mililitre 37 °C blebbistatin ekleyin; ardından, hat içi bir Luer lock enjeksiyon portu kullanarak beş ila yedi dakika boyunca koroner perfüzyon hattına 1 mililitre 37 °C Tyrode solüsyonu ile seyreltilmiş 0,1 mililitre blebbistatin enjekte edin. Blebbistatin dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. İnhibitörün çökmesini önlemek için, önce blebbistatin'i net bir şekilde 37 °C'ye ısıtılmış besiyerinde çözün ve karışımı kuvvetlice karıştırın.

Numunenin optik haritalamasını yapmak için, önce titreşen solüsyondan kaynaklanabilecek hareket artefaktlarını azaltmak amacıyla doku üzerindeki solüsyon yüzeyine küçük bir lam sabitleyin. Ardından, sabit akımlı, düşük gürültülü bir halojen lamba tarafından sağlanan eksitasyon ışığına sahip esnek, çatallı bir ışık kılavuzu kullanarak, filtrelenmiş ışık demetini dokuya yönlendirin ve ortaya çıkan floresan sinyali görüntüleyin. Az önce gösterildiği gibi kalbi kanüle ettikten sonra, ventrikülleri ön taraftan ayırarak disseke edin ve sağ atriyumu, triküspid kapak üzerinden triküspid kapak superior vena cava ekseni boyunca, ardından crista terminalis'in medial kolu üzerinden yapılan bir insizyonla açın.

Anterior atriyal serbest duvarı açmak için, medial kol insizyonun orta hattından sağ atriyal apendiksin sağ alt köşesinin kenarına kadar bir insizyon yapın ve düzleştirilmiş atriyal serbest duvarı silikon kaplı bir haznenin tabanına iğneleyin. Sol atriyal apendiksi açmak için, sol atriyal apendiksin mitral kapak üst köşesi boyunca mitral kapağı kesin. Ardından, açılan sol atriyumu, daha önce sağ atriyum için yapıldığı gibi iğneleyin.

Ardından ventrikül dokusunu kısmen çıkarın. Atriyumların zarar görmesini önlemek amacıyla hazırlığın sabitlenmesi için bir miktar ventrikül dokusu şeridi bırakın ve dokuyu Sylgard kaplı bir haznenin tabanına iğneleyin. Şimdi, hem epikardiyal hem de endokardiyal yüzeylerden süperfüzyon sağlanması için final hazırlığını silikon kaplı haznenin tabanından yaklaşık 0.5 milimetre yukarı kaldırın ve örneği 37 °C Tyrode çözeltisi ile süperfüze edin.

Ardından, özel yapım bir pacing gümüş klorür elektrodunu, diseke edilmiş sağ atriyal apandisın kenarına yerleştirin. Sağ ve sol atriyal apandisların her birinin yakınına birer adet 12 milimetrelik iğne uçlu tek kutuplu elektrokardiyogram elektrodu yerleştirin ve toprak elektrokardiyogram elektrodunu atriyoventriküler bileşkenin yakınına yerleştirin. Kalp dokusunu boyamak için, 37 °C Tyrode solüsyonunda seyreltilmiş voltaj duyarlı boyayı doku üzerine doğrudan yavaşça bırakmak için 1 milimetrelik bir pipet kullanın.

Ardından, doku üzerine seyreltilmiş blebbistatin'in doğrudan uygulanmasıyla örneği immobilize edin ve bunu perfüzat aracılığıyla başka bir 0.5 mililitre blebbistatin uygulamasıyla takip ederek örneği az önce gösterildiği gibi optik olarak haritalayın. Kalp hızı, baskın pacemaker'ın konumu ve atrial iletim dahil olmak üzere atrial fizyolojik parametrelerin etkilenmemesi için doku boyama ve blebbistatin inhibisyon basamakları, doğru uygulama ve kesin bir boyama prosedürü gerektiren kritik aşamalardır. Burada, Langendorff perfüzyonlu bir fare kalbi için spontan sinüs ritmiyle yeniden oluşturulmuş tipik bir sağ atriyum aktivasyon kontur haritası ile buna karşılık gelen, 1 ve 0.5 milisaniyelik örnekleme hızlarında elde edilmiş iki sağ atriyum kontur haritası gösterilmektedir.

Erken aktivasyon noktası, sinoatriyal düğümün anatomik olarak tanımlandığı superior vena cava yakınındaki interkaval bölge içerisinde yer alır. Bu deneyde, sağ atriyal apandis 10 ila 12 Hertz'de en az bir dakika boyunca stimüle edildikten sonra elektriksel stimülasyon durdurulmuş ve sinoatriyal düğüm geri kazanım süresi, son yakalanan aksiyon potansiyeli ile ilk spontan aksiyon potansiyeli arasındaki zaman aralığı olarak hesaplanmıştır. İzole atriyal preparasyonun spontan sinüs ritmi sırasındaki aktivasyonu, öncü kalp pili konumunun kesin alanının belirlenmesine olanak tanır.

Cerrahi işlem ve boya yükleme prosedürleri uygun şekilde takip edilirse, atriumun fizyolojik özelliklerinde anlamlı bir değişiklik gözlemlenmemelidir. Arteriyel boyama daha fazla miktarda boya gerektirebilse de, sinoatriyal düğüm bölgesi dokusundaki floresan sinyalinin bu yükleme yöntemiyle daha stabil olduğu görülmektedir; koroner boyama sonrası sinyal yoğunluğu azalma süresi, yüzey boyaması sonrakinin neredeyse iki katı kadardır. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, doğru şekilde uygulandığında 30-40 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, atriyal dokuya ve sinüs düğümüne zarar vermemek için kesi yapmadan önce atriyal anatomiyi belirlemeye özen gösterin. Bu prosedürün ardından, komütatif transmembran potansiyel özelliklerine ilişkin ek soruları yanıtlamak için konvansiyonel cam mitral elektrot kayıtları gibi diğer önlemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, entelektüel fizyoloji alanındaki araştırmacıların kalpteki sinoatriyal düğüm disfonksiyonu da dahil olmak üzere atriyal aritmileri keşfetmelerinin yolunu açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, bir fare sinüs düğümü preparasyonunun yüksek çözünürlüklü optik haritalamasının nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.