Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

Bu prosedürün genel amacı, iPALM adı verilen üç boyutlu süper çözünürlüklü bir mikroskopi yöntemi kullanarak, yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletini ultrastrüktürel düzeyde görselleştirmektir. iPALM görüntüleme, her üç boyutta da alt eğilimli nanometre uzamsal çözünürlük sağlar. Bu, ultra yapıların floresan probları kullanılarak görselleştirilmesini sağlayarak yüksek etiketleme özgüllüğüne izin verir.

Bu videoda sunulan prosedür, süper çözünürlüklü mikroskopiye dayalı tek molekül lokalizasyonu ile hücrelerdeki diğer ultrastrüktürel özellikleri görselleştirmek için hızlı bir şekilde uyarlanabilir ve öğretici olmalıdır. Bu prosedüre, hücreleri altı oyuklu bir plakada kapak camları üzerinde hazırlayarak başlayın. Görüntüleme örneğini monte etmek için, örnek kapak camını tampon kuyusundan nazikçe çıkarmak için ince forseps kullanın.

Ardından, kapak camının kenarına katlanmış, emici kağıtla dokunarak fazla arabelleği hızlı ve nazikçe hafifçe vurun. Kapak cam hücresi yukarı bakacak şekilde bir parça temiz lens kağıdının üzerine yerleştirin. Numunenin üzerine 30 ila 50 mikrolitre görüntüleme tamponu yerleştirerek numuneyi durulayın.

Katlanmış emici kağıtla eğerek ve hafifçe vurarak fazla arabelleği çıkarın. Durulama adımını birkaç kez tekrarladıktan sonra, numunenin üzerine 30 ila 50 mikrolitre görüntüleme tamponu yerleştirin. Kapak camının kenarını kurulayın, kurulayın ve kurumuş alana çok sayıda çok küçük nokta hızlı kürlenen epoksi yerleştirin.

Önceden temizlenmiş başka bir 1.5 numaralı kapak camını, 22 milimetre kapak camı içeren hücrenin ortasına yavaşça indirin. Görüntüleme tamponunun her iki kapak camını da kılcal hareketle ıslatmasına izin verin. Hızlı kürlenen epoksinin küçük noktaları her iki kapak camına da yapışmalıdır.

Basıncı eşit şekilde yaymak için katlanmış emici kağıt kullanarak monte edilmiş numunenin üzerine hafifçe bastırın. Numune hücresini ince ve eşit hale getirmek için yeterli basınç kullanın, ancak hücreleri ezecek kadar değil. Newton'un halka desenini gözlemleyerek uygun kalınlığı ölçün.

Hava kabarcıklarını en aza indirmek için bu adımı nazikçe gerçekleştirdiğinizden emin olun. Gerekirse, önceden birkaç kez boş kapak camlarıyla pratik yapın. Ardından, numuneyi erimiş Vazelin lanolin parafin ile kapatın.

Ardından kapalı numuneyi deiyonize su ile durulayın. Mikroskoba monte edilmeye hazır hale getirmek için numuneyi basınçlı hava ile kurutun. Numune tutucunun çıkarılmasına izin vermek için yaylı üst objektif merceğini yukarı doğru hareket ettirin.

Mühürlü numuneyi numune tutucuya yerleştirin ve birkaç küçük nadir toprak mıknatısı ile sabitleyin. Görüntüleme örneğinin her iki tarafına daldırma yağı sürün. Numune tutucuyu optik yola geri yerleştirin ve üst objektif merceğini yavaşça indirin.

Uyarma lazerlerini açın. Ayrıca EMCCD kameraları kare aktarım modunda açın. Ardından, uygun emisyon filtrelerinde döndürün.

Üst huzme yolunu bloke etmek ve alt huzme yolunu açmak için mekanik bir deklanşörü etkinleştirin. Piezo aktüatörü kullanarak küçük artışlarla öteleyerek alt objektif merceğini odak noktasına getirin. Referans netlendikten sonra, alt huzme yolunu bloke ederken üst huzme yolunu açın ve üst objektif merceğini de benzer şekilde odağa getirin.

Optimum odaklama için bilgisayar ekranındaki referansın genişliğini izleyin. Doğru merkezleme için hem üst hem de alt kiriş yollarını açın. Alt objektif sabit tutulurken üst objektif lensini bir çift mikro ince ayar vidası kullanarak manuel olarak ayarlayın, ta ki referans görüntüleri mümkün olduğunca yakın, ideal olarak bir piksel içinde üst üste gelene kadar.

Ardından, referans görüntülerin bir EMCCD pikselinin onda biri içinde üst üste gelmesi için ince ayarlamalar yapın. Hem objektif lensleri hem de alt yansıma aynalarını sabit tutarken üst iki eksenli piezo monteli aynaları kontrol yazılımı aracılığıyla ayarlayın. Süreci yönlendirmek için bilgisayar ekranı aracılığıyla üst ve alt objektif görünümlerin referans merkezlerini karşılaştırın.

Lazerler açıkken, kameralar sürekli olarak akar ve hem üst hem de alt ışın yolları açıkken, 400 nanometre büyüklüğünde sürekli bir Z ekseni salınımı için kontrol yazılımı tarafından üretilen sinüzoidal bir voltaj dalga formu kullanarak numune tutucu Z piezosunu salınır. Motorlu ışın ayırıcı düzeneğini, referans salınımının yoğunluğu olana kadar manuel olarak yukarı veya aşağı çevirin. İstenen tek foton girişim etkisi nedeniyle, bu, optik yol uzunluklarının yakın eşleşmesini gösterir.

Optimal durumlarda 10'dan büyük bir tepe-vadi oranı elde edilebilir. Her yüzeydeki hem genliğin hem de fazın alan boyunca mümkün olduğunca eşit olmasını sağlamak için, boşluğu ve eğim açılarını ince ayar yapmak için ışın ayırıcı tertibatının alt aynasını küçük adımlarla ayarlayın. Numuneyi 800 nanometre üzerinde sekiz nanometre Z adımlarında çevirerek ışın ayırıcı ince hizalama gerçekleştirin.

Bir ila üç arasındaki kameralar arasındaki referans yoğunluğunu izleyin. Işın ayırıcı tertibatı içindeki alt aynanın yüksekliğini, konumunu ve eğimini, birinci kameranın ikinci kameraya göre salınım fazı, ideal olarak 120 derecede maksimize edilecek şekilde küçük adımlarla ayarlayın. İlk hizalama tamamlandıktan sonra, hem görüntüye hücreleri hem de yakındaki birden çok referansı içeren uygun bir görüş alanını taramak için örneği çevirin.

Dağınık ışığı ve ortam bozulmalarını engellemek için sistemin etrafına bir muhafaza yerleştirin. Görüntüleme alanı bulunduğunda, numuneyi tekrar çevirin ve sonraki Z koordinat ekstraksiyonlarında kullanmak üzere kalibrasyon eğrisini kaydedin. Komutu kullanarak, ana arayüzde örnek piezo konumuna karşı kalibrasyon taramaları elde edin.

İstenen bir alan bulunduğunda ve kalibrasyon eğrisi elde edildiğinde, uygun dosya adlarını yazılıma girin. Hem üst hem de alt ışın yollarını açın, ardından 642 nanometre lazerin uyarma gücünü maksimuma çıkarın. Alexa Fluor 647 için, bir başlangıç Fluor-4 kapatma periyodu gerekebilir.

Tek molekülün yanıp sönmesi gözlenene kadar beş dakika veya gerekirse daha uzun süre sabit bir 642 nanometre uyarma ile maruz bırakın. Yazılım, satın alma sırasında 405 nanometre fotoaktivasyonun otomatik olarak artırılmasına izin verir. Filamentli özelliklerin net bir şekilde görülebilmesi için genellikle çok sayıda toplama çerçevesi gereklidir.

Hazır olduğunuzda, ana arabirimde start iPALM acquisition komutunu kullanarak ham görüntü kümelerini almaya başlayın. Çekim sırasında, gerektiği gibi uygun göz kırpma yoğunluğunu korumak için 405 nanometre lazerin yoğunluğunu ayarlayarak fotoğraf etkinleştirme seviyesini ayarlayın. Numune kapak fişi düzgün bir şekilde monte edildiğinde, Newton'un halkaları ortam ışığı veya standart floresan aydınlatma altında çıplak gözle gözlemlenebilir.

Floresan yayıcıların eksenel konumlarının çıkarılması, üç EMCCD'de belirli bir referansın yoğunluk değişiklikleriyle kalibre edilen iPALM görüntülemede eşzamanlı çok fazlı girişim gerektirir. Yoğunluklar daha sonra normalleştirilir ve faz farklılıklarını belirlemek için uygun hale getirilir. Burada, yerelleştirme belirsizliğine karşılık gelen genişliğe sahip bir 2B Gauss tarafından oluşturulan her yerelleştirme koordinatına sahip rekonstrüksiyon iPALM görüntüsü verilmiştir.

Z koordinatı, renk çubuğuna göre renklendirilir. Yoğun ve seyrek filamentli özelliklerin olduğu alanlar görülebilir. Burada, Alexa Fluor 647 falloidin tarafından etiketlenen HUVEC hücrelerinin aktin hücre iskeletinin rekonstrüksiyon iPALM görüntüleri gösterilmektedir.

Görüntü rengi, renk çubuğuna göre Z koordinatlarını gösterir. Enine kesit histogramı, kutulu alanın uzun ekseni boyunca XY yerelleştirme koordinatlarından oluşturulur. Gauss uydurma, enine kesit ile ilişkili maksimum 43.88 nanometre yarıda tam genişlik gösterir.

Bu histogram, kutulu alandaki yerelleştirme koordinatlarının Z konumundadır. Gauss bağlantısı, maksimum 17.50 nanometrenin yarısında tam genişlik gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 90 dakika içinde yapılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, basit hazırlama ve montaj, optik hizalama, ham veri toplama ve süper çözünürlüklü görüntüleri yeniden yapılandırmak için müteakip analiz yoluyla iPALM kullanarak ultrastrüktürel aktin hücre iskeletini nasıl görselleştireceğinizi anlamış olmalısınız. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, aktin hücre iskeletinin nano ölçekli mimarisinin yanı sıra fokal adezyonlar gibi hücre adezyon yapılarını keşfetmek için hücre biyolojisi alanındaki araştırmaların önünü açtı.