Hazırlama ve İn Vitro Manyetik Rezonans Görüntüleme için Dendrimer tabanlı Kontrast Ajanlar Karakterizasyonu

Bu prosedürün genel amacı, manyetik rezonans görüntüleme için bir kontrast madde olarak kullanılabilen bir dendrimerik paramanyetik şelatlamanın hazırlanmasını ve karakterizasyonunu göstermek ve bir görüntüleme deneyinde performansını göstermektir. Bu yöntem, dendrimerik kontrast ajanların özellikleri ve etkinliği gibi MRG kontrast ajanları alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, verimli MRG kontrast maddesinin yüksek protein ile uygun şekilde hazırlanması ve böylece kolay karakterizasyonunun sağlanmasıdır.

Bu yöntem, potansiyel in vivo uygulamalar için büyük önem taşıyan dendrimerik MRG kontrast maddelerinin daha ileri yapısal modifikasyonlarına ve fonksiyonel optimizasyonlarına kadar uzanabilir. Dendrimerik kontrast ajanların yüksek moleküler hızı daha uzun doku tutma sürelerine neden olduğundan ve MRI sinyalini önemli ölçüde artırdığından, çıkarımlar biyomedikal araştırma ve tanısal görüntülemeye kadar uzanır. İlk olarak, makrosiklik öncü DO3A tribütil esterin bir gramını beş mililitre DMF içinde çözün.

0.67 gram potasyum karbonat ekleyin ve oda sıcaklığında 45 dakika karıştırın. Bir saatten fazla porsiyonlar halinde 0.87 gram tert-butil-2-bromo-4 4-nitrofenil butatnoat ekleyin ve reaksiyon karışımını 18 saat boyunca karıştırmaya devam edin. Ardından, DMF'yi 40 ila 60 santigrat derecede ampulden ampule vakumlu damıtma ile çıkarın.

Yuvarlak bir katı elde etmek için kalıntıyı silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırın. Bir gram katının 10 mililitre etanol ve 150 mikrolitre yedi normal amonyak çözeltisinin bir karışımı içinde metanol içinde çözülür. Aktif karbon üzerine 150 miligram paladyum ekleyin ve şişe reaktörünü hidrojenatöre yerleştirin.

Karışımı 2,5 bar hidrojen atmosferi altında 16 saat çalkalayın. Etanol içinde bir diyatomlu toprak süspansiyonunu sinterlenmiş bir cam huniye dökün Paladyum karbon katalizörünü çıkarmak için reaksiyon karışımını diyatomlu topraktan süzün. Döner bir buharlaştırıcı üzerindeki süzüntüden çözücüyü çıkarın.

Elde edilen katıyı 15 mililitre diklorometan ve dört eşdeğer trietilamin içinde çözün. Buna 1.3 eşdeğer tiyofosgen ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 16 saat karıştırın. Çözücüyü döner bir buharlaştırıcı üzerindeki reaksiyon karışımından çıkarın ve DOTA tipi monomeri açık kahverengi bir katı olarak elde etmek için kalıntıyı silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırın.

Çözücüyü 40 santigrat derecede döner bir buharlaştırıcıda buharlaştırarak metanol içindeki% 10'luk bir çözeltiden 66.7 miligram G4 PAMAM dendrimer hazırlayın. Dendrimeri dört mililitre DMF'de çözün. Dendrimer çözeltisine 0.105 mililitre trietilamin ekleyin ve 60 santigrat derecede 45 dakika karıştırın.

Daha sonra bir saat boyunca porsiyonlar halinde 354 miligram monomer ekleyin. 48 saat boyunca 45 santigrat derecede karıştırmaya devam edin. Ampulden ampule vakumlu damıtma ile çözücüyü çıkarın.

Oda sıcaklığında üç saat boyunca metanol içinde lipofilik jel filtrasyon ortamını döndürerek bir boyut dışlama kromatografisi sütunu paketleyin. Eluent olarak metanol kullanarak bir mililitrelik fraksiyonları toplayın. Kesirleri TLC'ye göre analiz edin.

Döner bir buharlaştırıcı üzerinde korunan dendrimerik şelatörü içeren fraksiyonlardan çözücüyü çıkarın. Bileşiğin bir proton NMR spektrumunu elde edin ve aromatik ve alifatik bölgeleri entegre edin. Bu değerleri kullanarak, G4 PAMAM dendrimerine bağlı korumalı DOTA tipi makro döngülerin sayısını belirleyin.

Ürünün korumasını gidermek için katıyı beş mililitre formik asit içinde çözün ve karışımı 36 saat boyunca 60 santigrat derecede karıştırın. Formik asidi döner bir buharlaştırıcı ile çıkarın. Dendrimerik şelatörü elde etmek için döner buharlaştırıcıdan çıkarılan kalıntıyı dondurarak kurutun.

Proton NMR'yi kullanarak, dendrimere bağlı makrosiklik birimlerin sayısını belirleyin. Dondurularak kurutulmuş şelatörü suda çözün. Çözelti pH'ını 7.0'a ayarlamak için 0.1 molar sodyum hidroksit kullanın.

Dört saatlik bir süre boyunca şelatör çözeltisine bir mililitre su içinde 113 miligram Gadolinyum III klorür çözeltisi ekleyin. 0.05 molar sodyum hidroksit ile pH'ı periyodik olarak 7.0'a ayarlayın. Karışımı oda sıcaklığında 24 saat karıştırın.

Daha sonra, dört saatlik bir süre boyunca porsiyonlar halinde 158 miligram EDTA ekleyin ve pH'ı gerektiği gibi 7.0'a geri düzeltin. Oda sıcaklığında 24 saat daha karıştırın. Suda şişmiş hidrofilik jel filtrasyon ortamı ile bir boyut dışlama kromatografi kolonunu paketleyin.

Reaksiyon karışımını konsantre edin, karışımı kolona yükleyin ve deiyonize su ile elüteleyin. Saflaştırılmış numuneyi üç kilodaltonluk bir santrifüj filtre ünitesinde 1.800 kez g'de 30 dakika santrifüjleyin. Fazla Gadolinyum ve EDTA'yı çıkarmak için filtrelemeyi yaklaşık beş kez tekrarlayın.

Süzüntüde serbest Gadolinyum iyonlarının olmadığını bir ksilenol turuncu testi ile onaylayın. Filtrelenmiş numuneden uçucu maddeleri çıkarın ve dendrimerik kontrast maddesini elde etmek için kalıntıyı dondurarak kurutun. Beş ila 10 milimolar arasında bir konsantrasyonda su içinde bir DCA stok çözeltisi hazırlayın.

Kesin DCA konsantrasyonunu belirlemek için, önce 360 mikrolitre stok çözeltisini 60 mikrolitre D2O ve tert-bütanol standardı ile birleştirin. 400 mikrolitre numuneyi bir dış NMR tüpüne yerleştirin. Numune tüpüne bir tert-bütanol ve su referans çözeltisi içeren bir koaksiyel NMR yerleştirme tüpü yerleştirin.

Bir proton NMR spektrumu elde edin ve referans ve numune çözeltilerinin tert-bütanol sinyalleri arasındaki frekans kaymasını ölçün. Numuneye eklenen tert-bütanol için düzelterek gösterilen formülü kullanarak DCA konsantrasyonunu hesaplayın. Ticari olarak temin edilebilen bir GdDOTA çözeltisinin konsantrasyonunu da aynı şekilde belirleyin.

DCA ve GdDOTA çözeltilerini HEPES tamponuna yerleştirin ve su kontrollerini iki set plastik şişeye yerleştirin. Hava kabarcığı olmadığından emin olmak için şişeleri kapaklarla kapatın. 60 mililitrelik bir şırıngaya, 0.01 ve 0.02 milimolar DCA numunelerini, 0.5 ve 1.0 milimolar GdDOTA numunelerinden birini ve iki su kontrolünü yatay olarak yükleyin.

İkinci numune setini ikinci bir 60 mililitrelik şırıngaya yükleyerek bu prosedürü tekrarlayın. Her şırıngayı bir milimolar GdDOTA solüsyonu ile doldurun ve şırınga uçlarını kapatın. Şırıngalardan birini, numuneler tarayıcıya göre dikey olacak şekilde bir MRI tarayıcısına yatay olarak yerleştirin.

Şırıngaları tarayıcının ortasına kaydırın. Şırıngayı mıknatısın izo merkezine yerleştirmek için anatomik taramayı seçin. Ardından, ilk tarama parametrelerinin ayarlamalarını yapmak ve taramayı başlatmak için trafik ışığı düğmesine basın.

T1 ağırlıklı görüntüleme yapmak için hızlı/yavaş açılı çekim yöntemini veya T2 ağırlıklı görüntüleme gerçekleştirmek için gevşeme geliştirme yöntemi ile hızlı çekimi seçin. Dikey olarak hizalanmış numuneler için koronal dilimi seçmek için yerelleştirici taramasını kullanın. Gürültü toplama parametrelerine kontrastı optimize edin ve görüntüyü elde edin.

Arka plan ve her örnek için ortalama sinyal genliğini ve standart sapmayı belirlemek için dairesel bir ROI kullanın. Sinyal-gürültü oranını hesaplayın. NMR, MALDI-TOF MS ve element analizi, ortalama 49 makrosiklik birimin G4 PAMAM dendrimerine konjuge edildiğini gösterdi.

DCA çözeltilerinin konsantrasyonları ve uzunlamasına ve enine gevşeme süreleri de NMR ile belirlendi. Elde edilen relaksivite değerleri, ticari olarak temin edilebilen ve klinik olarak kullanılan bir GdDOTA monomeri ile karşılaştırıldı. DCA performansı da GdDOTA monomeri ile karşılaştırıldı.

İki çözelti seti, konjuge makrosiklik birimlerin sayısı ile belirlendiği gibi benzer Gadolinyum konsantrasyonlarına sahipti ve diğer iki set benzer moleküler konsantrasyonlara sahipti. Benzer Gadolinyum konsantrasyonlarına sahip bir T1 ağırlıklı görüntüleme deneyinde, sinyal-gürültü oranı DCA için GdDOTA'dan biraz daha yüksekti. Çözeltiler moleküle göre benzer konsantrasyonlara sahip olduğunda, DCA sinyal-gürültü oranı GdDOTA'nınkinden yaklaşık üç kat daha büyüktü.

T2 ağırlıklı bir görüntüleme deneyinde, DCA'nın sinyal-gürültü oranı, özellikle daha yüksek DCA konsantrasyonlarında, her iki konsantrasyon çiftinde de GdDOTA'nınkinden önemli ölçüde daha düşüktü. Bu videoyu izledikten sonra, saflaştırılmış ve karakterize edilmiş dendrimer bazlı MRG kontrast maddesinin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü takiben, molekülün birimleri değiştirilerek farklı tipte dendrimerik ve nano boyutlu MRG kontrast maddeleri hazırlanabilir ve uygun şekilde analiz edilebilir.

Bu tekniğe hakim olduktan sonra, MRG kontrast madde geliştirme alanındaki araştırmacılar, çağdaş moleküler görüntüleme için kritik öneme sahip çeşitli fonksiyonel çalışmaları yürütmek için bir dizi spesifik prob hazırlayabilmelidir.