İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

Bu deneyin genel amacı, bir insan tam kan örneğindeki NK hücre sayısını ve sitotoksik aktivasyon seviyelerini hızlı, güvenilir ve stabil bir şekilde belirlemektir. Bu yöntem, immünolojik alanlardaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin, Dış müdahalelerin NK hücrelerinin biyoaktivitesi üzerindeki etkileri nelerdir? Bu tekniğin temel avantajı, hızlı ve doğru olmasıdır, Deneyler arasında tekrarlanabilir sonuçlar sağlarken.

NK hücrelerini insan tam kanından izole etmek için, önce Tam kan örneği, Negatif Fraksiyon ve Pozitif Fraksiyon etiketli 15 mililitrelik tüpleri hücre ayırıcı tüp rafındaki uygun pozisyonlara yerleştirin. Tüm tüpler yüklendiğinde, otomatik etiketleme için ayırıcı rafı mini numune alıcıya yerleştirin ve şişenin rafa yerleştirileceği konumu vurgulamak için menüden Reaktif'i seçin. 2D kod okuyucuyu etkinleştirmek için Reaktif Oku'yu seçin ve uygun reaktif şişesini kod okuyucu kapağından 0,5 ila 2,5 santimetre açıyla 2D kod okuyucunun önünde tutun.

Okuma şişesini uygun ayırıcı raf konumuna yerleştirin. Ardından, Ayırma sekmesi altında, istediğiniz konumları vurgulayın. Ardından Etiketleme alt menüsünü açın ve bir otomatik etiketleme programı seçin.

Hücre ayırma reaktifi mikro boncuklarını 1, 2, 3 ve 4 numaralı raf konumlarına atayın. Ve Posselwb ayırma programını seçin. Durulama Yıkama programını seçin.

Volume (Hacim) alt menüsü altında Sample Volume (Örnek) Volume (Örnek) hacmi için 1500 mikrolitre girin ve Enter'a basın. Ardından hücre ayrımını başlatmak için Çalıştır'a tıklayın. Tüm örnekleri işlemek için yeterli arabelleğin mevcut olduğunu onaylamak için Tamam'a tıklayın.

Bir Sitotoksisite Testi numunesi hazırlamak için, önce her numune ve / veya katılımcı için uygun şekilde 1.5 mililitrelik tüpleri etiketleyin ve her tüpe istenen oranda NK hücreleri ve DIO etiketli K562 hücreleri sıkın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, hücre karışımını 500 mikrolitre eksik NK hücre ortamında yeniden süspanse edin ve her tüpteki hücreleri 5 mikrolitre propidyum iyodür ile etiketleyin.

Hücreleri başka bir santrifüjleme yoluyla toplayın ve itlaf kültürünü iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri aynı santrifüj koşulları altında santrifüjleyin ve peleti 25 mikrolitre taze eksik NK hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri Akış Sitometrisi ile analiz etmek için önce, sistemi temizlemek için görüntüleme akış sitometresi yazılımındaki başlat düğmesine tıklayın.

Ardından, dört dağılım grafiği oluşturmak için dağılım grafiği düğmesine tıklayın ve çift pozitif kontrol tüpünü yükleyin. Çift pozitif kontrol örneğini kullanarak, dedektörün aşırı yüklenmemesi için 405 miliwatt lazer için istenen yoğunluğu belirleyin ve görüntüleyiciyi uygun sayıda hücre sayımı elde edecek şekilde ayarlayın. 405 miliwatt lazeri hem DIO hem de PI'nin tespiti için uygun bir yoğunluğa ayarlamak, hem boyalar hem de akış sitometresinin algılama aralığı ile ilgili deneyim gerektirecektir.

Çift pozitif kontrol örneğinin alınması tamamlandıktan sonra, yalnızca DIO kontrol örneğini yükleyin, 40X hedefini seçin ve 642 miliwatt lazeri ve Brightfield kanalını kapatın. Uygun sayıda hücreyi üretin ve sadece propidyum iyodür numunesi için edinimi tekrarlayın. Tüm kontrol örnekleri çalıştırıldığında, 405 miliwatt lazeri ve Brightfield kanalını tekrar açın ve Yoğunluğu Ayarla'ya tıklayın.

Ardından, Dosya Alma sekmesi altında özel bir dosya adı girin ve veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin. Ardından, alınacak hücre sayısını girin. İlk deneysel numune tüpünü yükleyin ve Al düğmesine tıklayın.

Tüm örnekler çalıştırıldığında, görüntüleme akış sitometresi analiz yazılımı uygulamasını açın ve tek bir deneysel RIF dosyasını açın. Ücret sekmesi altında Yeni Matris Oluştur'u seçin. Yazılım, tek renkli dosyaların seçilmesini isteyecek ve kanal telafisini uygulamak için seçilecek bir matris dosyası oluşturmak üzere bunları birleştirecektir.

Uygun nokta grafiklerini ayarlamak için Yapı Taşları işlevini kullanın. Ardından, her kapıdaki hücre numaralarına erişmek için istatistik işlevine tıklayın. Bu temsili deneyde, kan örnekleri belirtildiği gibi çizildi ve her koşucu için ve her bir zaman noktası için ortalama olarak mililitre tam kan başına NK hücrelerinin konsantrasyonu ölçüldü.

Dört koşucudan üçü, egzersizden sonra NK hücre sayısında benzer hafif bir artış gösterdi. Hemen ardından, olayın bitiminden 24 ila 48 saat sonra yavaş yavaş normale dönmeden önce keskin bir düşüş gelir. Ortalama olarak, NK hücre sayısı egzersizden 1.5 saat sonra azaldı, ancak 24 saat sonra normale yakın seviyelere geri döndü.

Hücre sayımı hesaplandıktan sonra, NK hücrelerinin sitotoksik aktivitesi, NK hücre sitotoksisitesinde hemen ve egzersiz olayının sona ermesinden 1.5 saat sonra, egzersizden 24 saat sonra önemli ölçüde artarak, gösterildiği gibi hemen analiz edildi. NK sitotoksisitesi, anlamlı olmasa da, egzersiz öncesi seviyelere kıyasla yüksek kaldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulandığında yaklaşık dört saat içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, insan kan örneklerinden NK hücre sayısını ve sitotoksik aktiviteyi tekrarlanabilir hidropik bir şekilde nasıl elde edeceğinizi ve karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.