Name: İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin, insan tam kan örneklerinden NK hücre sayımı ve sitotoksisite düzeylerini akış sitometri ile hızlı ve güvenilir şekilde belirleme yöntemini. Bu teknik immünolojik araştırmalarda tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü'nden 2100-68003-30395 numaralı Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi Rekabetçi Hibe tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm kan toplama prosedürleri Appalachian State University (ASU) Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) tarafından belirlenen kurallara uygun olarak yapılmıştır. 1. Tam Kan Toplama <ol><li> sertifikalı flebotomist Dünya Sağlık Örgütü kurallarına göre kanımı var. </li><li> Di-Potasyum Etilendiamintetraasetik asit içeren bir 4 ml kan toplama tüpü (K 2 EDTA) içine kan çizin. üreticinin talimatlarına göre kan toplama tüpü ters çevirin. ayrılık kadar tezgah üstü rocker oda sıcaklığında kan toplama tüpü bulundurun. </li></ol> DIO-etiketli hedef hücreler, 2. hazırlanması <ol><li> K562 hücrelerinin büyümeye Tam Iscove Modifiye Dulbecco Ortam hücrelerinin sağlık sağlamak için tahlil önce birkaç hafta,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş (IMDM). concentrat ayarlayın3 x 10 5 hücre hücrelerin iyon / ml her gün hücre tamamlanmasıyla sayısı ve hücrelerin daha sonra geçit. her 2 ila 3 gün tam bir medya bir değişiklik yapın. </li><li> 1 hemasitometre: Analiz gününde, bir 1 kullanarak bir hücre sayımı yapar. <ol><li> K562 şişeden 10 uL çıkarın ve 1,5 ml tüp içine yerleştirin. </li><li> 1 seyreltme faktörü için aynı 1.5 ml tüp içine tripan mavi boya 10 mcL ekleyin: 1. </li><li> Yavaşça fiske tüp K562 hücreleri karıştırmak ve mavi boya tripan için. </li><li> K562 hücre-tripan mavi boya, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca inkübasyona izin verin. </li><li> tüpten boyanmış K562 hücrelerinin 15 mcL çıkarın. </li><li> hücre sayımı için hemasitometre üzerine Pipet. </li><li> dört köşe meydanlarda hücrelerin yanı sıra beş kareler toplam orta kare güvenin. </li><li> denklemi kullanılarak hücre sayısı hesaplanır: Toplam hücre / ml = Toplam hücreler sayıldı X (seyreltme faktörü / kareler sayısı) x 10,000 / ml </li></ol></li> Serumsuz IMDM kültür ortamında 1 x 10 6 hücre / ml'lik bir son yoğunluğa yeniden süspanse K562 hedef hücreler. <li> Boyanmamış K562 hedef hücrelere, 10 x 10 6 K562 hücrelerinin toplam 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda bir 15 ml tüp K562 hedef hücrelere 10 ml. Kullanıma hazır olana kadar,% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör içine yerleştirin. </li><li> K562, bir 15 ml tüp hücrelerini hedef DIO lekeli K562 hedef hücrelere, 10 x 10 6 K562 hücrelerinin toplam 1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda 10 ml. <ol><li> DIO boyama ve yavaşça girdap için belirlenen 15 ml tüp içinde hücre süspansiyonu, mL başına 1 uL DIO hücre etiketleme solüsyonu ekleyin. Örneğin, 1 x 10 6 hücre / ml bir hacimde 10 x 10 6 K562 hücre / ml DIO hücre işaretleme çözeltisinin 10 uL ekleyin. </li><li> 15 ml'lik bir tüp içinde% 5 CO2 ile 37 ° C 'de 20 dakika boyunca inkübe K562-dio çözeltisi. </li></ol></li><li> Takip etkuluçka ing 15 ml tüp ihtiva eden K562-dio çözeltisine oda sıcaklığında fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) 3 ilave edin. </li><li> Oda sıcaklığında 135 x g'de 10 dakika süre ile santrifüjlenir. </li><li> Dikkatle 1.000 ul hacim ayarlanabilir pipet yardımıyla hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Hücre pelet içeren 15 ml tüp taze IMDM 10 ml ekleyin. </li><li> Yavaşça vorteks tüp hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Tekrarlayın 2.7 2.10 iki kez daha yineleyin. </li><li> Kullanıma hazır olana kadar,% 5 CO2 ile 37 ° C kuluçka makinesi içinde mağazası hücreleri. Not: Hücreler kadar, 24 saat boyunca kuluçka makinesi içinde saklanabilir ancak aynı gün kullanmak tercih edilir. </li></ol> Kontroller 3. hazırlanması <ol><li> Ayrı ve uygun şekilde etiketlenmiş 1.5 ml tüpler içine aşağıdaki aktarın: <ol><li> Taze IMDM 500 uL 1.5 mL tüp etiketli "Çift Pozitif" olarak K562 hücreleri Dio-etiketli yeniden süspanse içeren ekle. </li><li> Taze IMDM 500 uL ekleyin "sadece dio" içine Dio-etiketli K562 hücreleri yeniden süspanse içeren 1.5 mL tüp etiketli. </li><li> içine yeniden süspanse etiketsiz K562 hücreleri içeren taze IMDM 500 uL ekleyin "Propidium iyodür (PI) Sadece" 1.5 mL tüp etiketli. </li></ol></li><li> 5 dakika için 55 ° C su banyosu içinde çift pozitif ve PI yalnızca tüpler yerleştirin. </li><li> 5 dakika geçtikten sonra, tüpleri kaldırmak ve% 70 etanol ile silin. </li><li> Çift Pozitif için PI ve PI sadece 1.5 mL tüpler 10 L ekleyin. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde üç K562 hedef hücre kontrolleri yerleştirin. </li><li> 30 dakika inkübasyon 163 x g'de 2 dakika süre ile santrifüj üç K562 hedef hücre kontrolleri geçtikten sonra. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Taze IMDM hücre kültür ortamının 20 uL, her kontrol tekrar süspansiyon ve en az% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör terkOptimum dio sinyali 30 dakika. NOT: Kontroller artık sitometresi görüntüleme akışı ile çalıştırmak üzere hazırdır. </li></ol> 4. NK Hücre Otomatik Ayırma <ol><li> Hücre ayırıcının açma ve start-up döngüsü bitirmek için izin verir. </li><li> Tüm sıvı şişeleri aydınlatmaları, yeşil ve atık şişesi boş olduğunu olduğundan emin olun. </li><li> Bir oda sıcaklığı 15 ml tüp raf edinin. NOT: Seçim örnek hacimleri dayalıdır. Örneğin, bir birim için az 3 mi, 15 ml tüp raf kullanımı ve hacim en fazla 3 mi, 50 ml tüp raf kullanımı. </li><li> Etiket örnek tüpleri buna göre (numune / katılımcı başına tekrarlayın): Katılımcı 1 Tam Kan Örneği; Katılımcı 1 Olumsuz kesir; Katılımcı 1 Pozitif kesir. </li><li> Yavaşça "bütün bir kan örneğinden" 15 ml tüp içine Aşama 1.2'den tam kan 1.5 mL pipetle. </li><li> Adım 4.5 den uygun şekilde etiketlenmiş 15 ml "Tam Kan Örneği" tüp yerleştirin ve 15 mL "Negatif Kesir" etiketli veTüp rafa Adım 4,4 "Pozitif Fraksiyonu" borular. Satır (R1) A: thefollowing örnek raf set-up kullanın Tam Kan Örneği, Satır (R2) B: Negatif, etiketsiz fraksiyon, Satır (R4) C: Pozitif, manyetik olarak etiketlenmiş fraksiyonu. </li><li> autolabeling için MiniSampler üzerine ayırıcı raf yerleştirin. </li><li> menüsünden "Reaktif" i seçin ve flakon ayırıcı rafa yerleştirilir konumunu vurgulamak. </li><li> 2B kod okuyucu etkinleştirmek için "Reaktifini oku" seçiniz. </li><li> kod okuyucu kapağının 0,5-2,5 cm arasında 2B kod okuyucu önünde uygun reaktif flakon yerleştirin. Not: Örneğin, NK hücre ayrılması için gerekli olan reaktif CD56 olup. </li><li> uygun okuma 2B kod okuyucu önünde bir açı ile reaktif, tüp tutun. </li><li> Uygun ayırıcı raf pozisyona reaktif flakon yerleştirin. </li><li> Ekranda Ayırma sekmesi altında istenilen pozisyonları vurgulayın. </li><li> Etiketleme alt menüsünden, bir au atamaktolabeling programı. </li><li> pozisyonları 1, 2, 3, ve 4 rafa Hücre Ayırma Reaktif CD56 mikro kullanarak atayın. </li><li> "Posselwb" ayrılık programını seçin. </li><li> "Durulama" yıkama programını seçin. </li><li> Sayısal tuş takımını kullanarak "Cilt" alt menüsünde 1500 uL numune hacmi yerleştirin. </li><li> tuş takımı üzerindeki "Enter" seçeneğini seçiniz. </li><li> Hücre ayrımı başlatmak için "Çalıştır" ı seçin. </li><li> Bu yeterli tampon tüm örneklerin işlenmesi için kullanılabilir onaylamak için "Tamam" ı seçin. </li></ol> 5. NK Hücre Sayımı ardından Hücre Ayırma <ol><li> Hemen hücre ayırıcı ile hücre ayırma aşağıdaki pozitif fraksiyonu almak. oda sıcaklığında bekletin. Bu fraksiyon istenen saf NK hücre popülasyonu içerir. </li><li> Her numune için, Adım 2.2 göre hemasitometre kullanarak bir hücre sayımı gerçekleştirmek. <ol><li> hesaplamalar sonrasında hücre sayımı kaydedin. </li></ol></li></ol> 6. Sitotoksisite Tahlili Numune Hazırlama <ol><li> Hazırlayın ve buna göre her bir numune / katılımcı için 1.5 ml tüpler etiket. </li><li> Pipet Her tüpe NK hücreleri ve Dio-etiketli K562 hücrelerinin oranını istenen. Not: Örneğin, K562 hedef hücrelere ve NK efektör hücrelerin arzu edilen oran 1: 5 arasındadır. </li><li> 135 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> Süspanse NK-dio interlökin-2 (IL-2) ve 2-merkaptoetanol (2-Me) (kısmi NK hücre kültür ortamı olmadan) NK hücre ortamının 500 uL K562 hücre karışımı etiketli. Not: tam olmayan NK hücre kültür ortamı, L-glutamin, olan ribonükleosidler ve deoksiribonükleosidler olmaksızın sodyum bikarbonat ile Essential Medium Eagle sınırı. </li><li> Her tüpe PI 5 mcL ekleyin. </li><li> 163 x g'de 2 dakika süre ile santrifüje. </li><li> 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. </li><li> 2 saat inkübasyondan sonra, Santrifüj163 x g'de 2 dakika süre ile GE. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> 25 uL eksik NK hücre kültür ortamında yeniden süspanse hücreleri. </li></ol> Spontan 7. Hazırlama ( "S") Örnek <ol><li> DIO-etiketli K562 hücrelerinin pipetle 500 ul 1.5 ml tüp içine (1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda). </li><li> Her tüpe PI 10 mcL ekleyin. </li><li> 163 x g'de 2 dakika süre ile santrifüj tüpü. </li><li> 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri. </li><li> 2 saat kuluçkadan, 163 x g'de 2 dakika süre ile santrifüj sonrasında. </li><li> Dikkatle hücre pelletini bozmadan süpernatant kaldırmak. </li><li> 25 ul tam olmayan alfa-Minimum Esansiyel Medium (α-MEM) hücre kültür ortamı içinde yeniden süspanse hücreleri. </li></ol> Görüntüleme Akış Sitometre 8. Veri Toplama <ol><li> enstrüman açmak için akış sitometresi görüntüleme ön kapı içinde yeşil düğmeye basın. </li><li> al açıngörüntüleme ile ilişkili l bilgisayarlar akış sitometresi. </li><li> Yazılımın sitometresi görüntüleme akışını başlatın. </li><li> sistemini temizlemek ve örnek hattını hazırlamak için "Başlangıç" düğmesine tıklayın. </li><li> "Başlangıç" tamamlandıktan sonra, "Kalibrasyon" penceresini kapatmak. </li><li> Kanal atama: sol üst tarafta, bunları atamak için her kanalda tıklayın. </li><li> Area_M06 vs Raw Max Piksel _MC_6, Area_M02 vs Raw Max Piksel _MC_2, AspectRatio_M01 vs Area_M05 ve FieldArea_M01 vs Raw Max Piksel _MC_5: Sağ tarafta, 4 saçılım oluşturmak için scatter plot butonuna tıklayın. </li><li> İlk "Çift Pozitif" kontrolü kullanarak örnekleri analiz başlayın. <ol><li> tıklayın "Load". </li><li> Numune Yükleyicisi'a 3.9 Adımlar 3,4 "Çift Pozitif" örnek ile 1.5 ml tüp yerleştirin. </li><li> "Büyütme" sekmesi altında 40X hedefi seçin. </li><li> 405 mW açın ve642 mW lazerler. </li><li> "Aydınlık" bir kanal açın. </li><li> tıklayın "Select Intensity." </li><li> Dedektör aşırı değil yani "Çift Pozitif" kontrol numunesi dayanarak, 405 mW lazer için istenen yoğunluğunu belirlemek. Not: Örneğin, bu deney için en uygun yoğunluk 11 mW ayarlandı. </li></ol></li><li> İstenilen set-up sağlandıktan sonra veri elde. <ol><li> "Toplama Dosya" sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girin. veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. </li><li> "Toplama" yanında kazanmak için hücrelerin sayısını girin. Genellikle bu sayı 10.000'e 1,000 arasında değişmektedir. </li><li> Tıklayın "Edinme." NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı elde edilir sonra, veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir. </li></ol></li><li> Satın alma tamamlandıktan sonra, bir sonraki kontrol örneği yükleyin - Dio sadece kontrol. </li><li> tıklayın "Load". </li><li> Numune Yükleyicisi'a "Dio sadece" örnek ile 1.5 ml tüp yerleştirin. </li><li> Seçilen "Büyütme" sekmesi altında 40X objektif bırakın. </li><li> 405 mW lazer açık bırakın. </li><li> 642 mW lazer ve "aydınlık" kanalı kapatın. NOT: Şimdi istenen set-up elde edildiğini, veri elde edilebilir. </li><li> "Toplama Dosya" sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girmek ve veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. yanında elde etmek için hücrelerin sayısını girin "toplayın.". Genellikle bu sayı 1000'dir. </li><li> Tıklayın "Edinme." NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı kazanılır sonra veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir. </li></ol><li> "PI sadece" kontrol numunesi için yineleyin 8.10. deney örnekleri şimdi tahsil edilecek hazırız. </li><li> remaini Kolu"Kendiliğinden 'S' Örnekleri" şöyle de dahil olmak üzere, deneysel örnekleri ng: <ol><li> Seçilen "Büyütme" sekmesi altında 40X objektif bırakın. </li><li> 405 mW ve 642 mW lazerler AÇIN. </li><li> "Aydınlık" kanal AÇIN. </li><li> tıklayın "Set Yoğunluk." </li><li> "Toplama Dosya" sekmesi altında, özel bir dosya adı metin girmek ve veri dosya (lar) kaydetmek için bir klasör seçin. Özel bir dosya adı metin girin. </li><li> yanında elde etmek için hücrelerin sayısını girin "toplayın." </li><li> "Edinme" butonuna tıklayın. NOT: Hücrelerin istediğiniz sayı kazanılır sonra veri dosyası otomatik olarak önceden seçilen klasöre kaydedilir. </li></ol></li><li> tüm deneysel numuneler için yineleyin 8.12. </li><li> tüm deneysel veriler ve dosyalar toplanan edildikten sonra, sistem sterilize etmek "kapatma" düğmesine tıklayın. </li> 9. Imaging Akış Sitometre Numune Analizi <ol><li> analiz yazılım uygulaması sitometresi görüntüleme akışını açın. </li><li> "File" altında, deneysel .RIF dosyasını açın. </li><li> seçerek tek renk .RIF dosyaları (DIO-sadece kontrol etmek ve adım 8.10 ve 8.11 sırasında oluşturulan PI-sadece kontrol) kullanarak yeni bir matris inşa yazılımın sitometresi görüntüleme akışında Tazminat sekmesi altında "Yeni Matrix oluştur". NOT: Yazılım tek renk dosyalarının seçimi için isteyecektir ve bir matris dosyası (.ctm dosya uzantısı) oluşturmak için bunları birleştirme, o kanal tazminat uygulamak için seçilmelidir. </li><li> Yazılımın "yapı taşları" fonksiyonunu kullanarak nokta araziler oluşturun. <ol><li> Bir nokta-arsa kapısına (frekansı vs BrightFieldGradient_RMS) odaklı hücreler oluşturun. Kapıyı "Focus" (Şekil 1A) arayın. </li><li> "Focus" kapıyı kullanarak, g Parlak Alan Aspect Ratio vs Aydınlık Alan Alanı'nın bir nokta arsa oluşturmak tekli hücrelere yedik. Kapı "Single" (Şekil 1B) arayın. </li><li> "Tek" kapısı kullanarak, Intensity_MC_Ch5 vs Intensity_MC_Ch02 bir nokta arsa oluşturun. Belirlemek ve kapı DIO-pozitif sadece hücreleri (hedefler, canlı) ve PI-Dio (ölü hedefler) çift pozitif hücreler (Şekil 1C) Bu arsa kullanın. NOT: Tüm araziler adımlar 9.4.1, 9.4.2 açıklanan ve 9.4.3 yazılımı "yapı taşları" fonksiyonunu kullanarak oluşturulabilir. </li></ol></li><li> Her kapının hücre sayıları erişmek için nokta arsa istatistikleri fonksiyonu tıklayın. </li><li> Aşağıdaki formülü kullanarak spontan numunede ölü hedefler ve deney örneklerinin yüzdesini hesaplayın: numunedeki% ölü hedefler = (#dead hedefleri x 100) / (# hedefler + #dead hedefler canlı) </li><li> Aşağıdaki formül kullanılarak sitotoksisite hesaplayın: % Sitotoksisite = [(Deneysel ölü Spontan ölü) / (100-Spontan ölü)] x100 </li></ol>1 "&gt;:" keep-together.within sayfa = fo "_content <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg"> Şekil 1: sitotoksik aktivite analizi için Temsilcisi histogram, saçılım grafikleri ve görüntüleri. (A) odak hücre analizi. (B) tek hücre analizi. (C), hedef hücre boyama analizi. Tüm tespitler her olaya bağlı görüntü kullanılarak yapılır. Bu sadece grafikler olay tıklayarak analiz yazılımı ulaşılabilir. Bir apoptotik NK hücre ve canlı bir K562 hedef gösteren (D) ikili olayın Örnek görüntüsü. Ch01'den, aydınlık. CH02, dio. Ch05 PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<ol><li>Cerwenka, A., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells%2C+viruses+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells, viruses and cancer.</a> Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).</li>
<li>Nieman, D. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7883395">Exercise, infection, and immunity.</a> Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).</li>
<li>Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+activity%2C+immunity+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutr+Soc%22%5BJournal%5D)">Physical activity, immunity and infection.</a> Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).</li>
<li>Nieman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marathon+training+and+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Marathon training and immune function.</a> Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).</li>
<li>Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+the+Regulation+of+Immune+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Exercise and the Regulation of Immune Functions.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).</li>
<li>Walsh, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+statement.+Part+one%3A+Immune+function+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc+Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Position statement. Part one: Immune function and exercise.</a> Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).</li>
<li>Timmons, B. W., Cieslak, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+natural+killer+cell+subsets+and+acute+exercise%3A+a+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc+Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review.</a> Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).</li>
<li>Westermann, J., Pabst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+lymphocyte+subsets+and+natural+killer+cells+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Investig%22%5BJournal%5D)">Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body.</a> Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+leucocytes+from+human+blood.+Further+observations.+Methylcellulose%2C+dextran%2C+and+ficoll+as+erythrocyteaggregating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).</li>
<li>McMillan, R., Scott, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+labeling+with+51-Chromium.+I.+Technic+and+results+in+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects.</a> Blood. 32 (5), 738-754 (1968).</li>
<li>Berk, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+long+endurance+running+on+natural+killer+cells+in+marathoners%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners.</a> Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).</li>
<li>McAnulty, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+blueberry+ingestion+on+natural+killer+cell+counts%2C+oxidative+stress%2C+and+inflammation+prior+to+and+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).</li>
<li>Millard, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Exercise+Increases+Peripheral+Blood+NK+Cell+Counts+without+Immediate+Functional+Changes%2C+but+Impairs+their+Responses+to+ex+vivo+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation.</a> Front Immunol. 4, 125(2013).</li>
<li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaneway%2C+CA+%22Immunobiology%3A+The+Immune+System+in+Health+and+Disease.+5th+edn%22">Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn</a>. , Garland Science. (2001).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu çalışmada tarif edilen yöntem ile doğrudan (bu özel durumda, uzun süreli egzersiz) uyaranlara yanıt olarak, bir bireyin NK hücrelerinin spesifik aktivitesini ölçer. Tipik haliyle, NK hücreleri belirteçlerin bir kombinasyonu kullanılarak sıralama yoğunluk gradyanları ya da hücre kullanılarak bir kanından izole edilmektedir. bunlar, zaman alıcı olan birden çok manipülasyonlar içerir ve ağır kullanım bağlıdır: Bu yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, pek çok sakıncaları vardır. Bunun bir sonucu olarak, aşırı stres, hat...

Doğal öldürücü hücreler doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir unsurdur. Çok düzenlenir olsa da, kabul ve hücre-hücre temas yoluyla önceki aktivasyonu 1 olmaksızın, anormal hücreleri ortadan kaldırmak için yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, bu enfeksiyonlara karşı savunma hızlı bir çizgi oluşturur. Özellikle yoğun egzersiz, geçici bağışıklık sistemini 2, 3, 4, 5 bastırmak için gösterilmiştir. NK hücreleri etkili bir şekilde hastalığa karşı duyarlılığın arttırılmasına bir pencere oluşturma bu etki, 4, 6, 7 için özellikle müsaittir. Bu nedenle, müdahalelerin çalışma öncesinde, sırasında veya NK hücre fonksiyonu üzerindeki etkisini azaltma amacı ile yoğun egzersizden sonra sporcular sonrası yarışmalar refahı için özellikle ilginçtir. 8 seyrek 1); 2) NK hücreleri strese karşı çok hassastır ve deney sırasında canlı ve sabit kalması fizyolojik koşullar sürekli maruz güveniyor; ve 3) standart tahliller gibi Ficoll geçişlerini 9 olarak, NK hücre sitotoksisitesini belirlemek ve analizleri 10 serbest bırakmak için, güvenilmez ve tutarsız. İnsan örneklerin doğal değişkenliği sadece bu konuları bileşik. müdahaleler sırasında toplanan taze insan örnekleri, en azından bir hayvan örnekleri veya ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına kıyasla, temin oldukça düzenlenmiş ve zordur. Bu deneyler tekrarlamak ya da istatistiksel olarak anlamlı eşiklere ulaşması çalışma kohort katılımcı eklemek için fırsat azaltır. Topluca, bu sorunlar fo izin veren bir aerodinamik protokolü ihtiyacını destekR hem de yüksek verimlilik ve insan örnekleri NK hücre litik faaliyetinin yüksek güvenilirlik analizi. Biz, tespit yabancı etkenlere maruz kalmasını asgariye düşürür insan tam kandan izole ve test NK hücreleri için gerekli süreyi kısaltır bir iş akışı kurdu. azalırsa veya NK hücre sitotoksik artışların saptanmasına olanak tanınması için E oranı: Yöntem iki sensör, manyetik-bazlı hücre sıralayıcı ve sitometresi bir görüntüleme akışı ve bir deney özgü optimize edilmiş T kullanımı optimize eder.

<table><tbody><tr><td>K-562 lenfoblastlar</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamı</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>Yüksek glikoz, L-Glutaminli, HEPES'li, Steril filtreli</td></tr><tr><td>Alfa Minimum Esansiyel ortam</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>Ribonükleositler ve deoksiribonükleositler içermez, ancak 2 mM L-glutamin ve 1.5 g/L sodyum bikarbonat ile</td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi %0.4</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>Doku kültürü sınıfı</td></tr><tr><td>Propridium İyodür Boyama Çözeltisi</td><td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Vybranto DiO hücre etiketleme çözeltisi</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Ayırıcı</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Çalışan Tampon</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Yıkama Tamponu</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Tam Kan CD56 Mikro Boncuklar, insan</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II Görüntüleme Akış Sitometresi</td><td>EMD Kırlangıç Speedbeads</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>%0.4-0.7 Hipoklorit (Sterilizatör)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>%70 İzopropanol (Kabarcık Giderici)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Kılıf sıvısı)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>Kalsiyum veya magnezyum yok</td></tr><tr><td>INSPIRE Yazılımı</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Sürüm İşareti II, Eylül 2013</td></tr><tr><td>Ideas Uygulama Yazılımı</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Sürüm 6.1, Temmuz 2014</td></tr></tbody></table>

İnsan tüm kan natural killer hücre parçalayıcı faaliyet akışı sitometrik analizi

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK hücre sitotoksisite NK hücre fonksiyonu üzerindeki dış müdahale etkisini belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir ölçüdür. Ancak, bu testin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliği için kullanıcının hatalar nedeniyle ya da deneysel manipülasyon NK hücrelerinin duyarlılığının ya kararsız olarak kabul edilebilir. Bu sorunları ortadan kaldırmak için, en az bunları azaltan bir iş akışı kurulmuş ve sunulmuştur. Biz kaçak arasında, çeşitli zaman noktalarında kan örnekleri alındı, göstermek için (n = 4) egzersiz yoğun butik tabi ki. İlk olarak, NK hücreleri aynı anda tespit edilir ve doğrudan tam kandan ve gibi kısa bir sürede mililitre gelen CD56 etiketleme ve manyetik bazlı sıralama ile izole edilmiştir. kriteri NK hücreleri herhangi bir ayıraç veya kapatma antikorların kaldırılır. Bunlar kan mililitre başına doğru bir NK hücre sayısı tespit etmek için sayılabilir. İkinci olarak, kriteri NK hücrelerinin (efektör hücreleri ya da E) 3,3-Diotade karıştırılabilirHer olayın görselleştirme ve herhangi bir yanlış pozitif ortadan kaldırılması için izin veren bir görüntüleme akış Sitometreyi kullanarak E oranı ve analiz: 5 T: cyloxacarbocyanine perklorat (DIO) bir tahlil optimal 1 de K562 hücreleri (hedef hücreleri ya da T) etiketli ya da (örneğin çiftler veya efektör hücreleri gibi) yanlış negatif. Bu iş akışı yaklaşık 4 saat içinde tamamlandı ve hatta insan numuneleri ile çalışan çok kararlı sonuçlar sağlar edilebilir. Kullanılabilir olduğunda, araştırma ekipleri, insan deneklerde birkaç deneysel müdahaleleri test ve veri bütünlüğünü tehlikeye atmadan birkaç zaman noktaları arasında ölçümleri karşılaştırabilirsiniz.

NK hücre sayısı tayini Tam kan NK hücre sayımı ağır çalışan etkisi Şekil 2'de tarif edilen egzersiz protokolü kullanılarak ölçülmüştür. Kan örnekleri ilk kan çekildikten sonra nihayet 24 ve 48 saat 1.5 saat egzersiz sonrası, egzersizden hemen sonra, egzersiz öncesi çekilmiş ve bulundu. Tam kan mililitrede NK hücrelerinin konsantrasyonu her koşucu (Şekil 3A) ve her bir zaman noktası için ortalama (Şekil 3B) üzerinde ölçüldü. <p c...

Bu çalışma, insan kan örneklerinde NK (Doğal Öldürücü) hücre sayısının ve NK hücre sitotoksisitesinin doğru ve hızlı bir şekilde belirlenmesi için gelişmiş bir iş akışını açıklar.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Bu deneyin genel amacı, bir insan tam kan örneğindeki NK hücre sayısını ve sitotoksik aktivasyon seviyelerini hızlı, güvenilir ve stabil bir şekilde belirlemektir. Bu yöntem, immünolojik alanlardaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin, Dış müdahalelerin NK hücrelerinin biyoaktivitesi üzerindeki etkileri nelerdir? Bu tekniğin temel avantajı, hızlı ve doğru olmasıdır, Deneyler arasında tekrarlanabilir sonuçlar sağlarken.NK hücrelerini insan tam kanından izole etmek için, önce Tam kan örneği, Negatif Fraksiyon ve Pozitif Fraksiyon etiketli 15 mililitrelik tüpleri hücre ayırıcı tüp rafındaki uygun pozisyonlara yerleştirin. Tüm tüpler yüklendiğinde, otomatik etiketleme için ayırıcı rafı mini numune alıcıya yerleştirin ve şişenin rafa yerleştirileceği konumu vurgulamak için menüden Reaktif'i seçin. 2D kod okuyucuyu etkinleştirmek için Reaktif Oku'yu seçin ve uygun reaktif şişesini kod okuyucu kapağından 0,5 ila 2,5 santimetre açıyla 2D kod okuyucunun önünde tutun.Okuma şişesini uygun ayırıcı raf konumuna yerleştirin. Ardından, Ayırma sekmesi altında, istediğiniz konumları vurgulayın. Ardından Etiketleme alt menüsünü açın ve bir otomatik etiketleme programı seçin.Hücre ayırma reaktifi mikro boncuklarını 1, 2, 3 ve 4 numaralı raf konumlarına atayın. Ve Posselwb ayırma programını seçin. Durulama Yıkama programını seçin.Volume (Hacim) alt menüsü altında Sample Volume (Örnek) Volume (Örnek) hacmi için 1500 mikrolitre girin ve Enter'a basın. Ardından hücre ayrımını başlatmak için Çalıştır'a tıklayın. Tüm örnekleri işlemek için yeterli arabelleğin mevcut olduğunu onaylamak için Tamam'a tıklayın.Bir Sitotoksisite Testi numunesi hazırlamak için, önce her numune ve / veya katılımcı için uygun şekilde 1.5 mililitrelik tüpleri etiketleyin ve her tüpe istenen oranda NK hücreleri ve DIO etiketli K562 hücreleri sıkın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. Daha sonra, hücre karışımını 500 mikrolitre eksik NK hücre ortamında yeniden süspanse edin ve her tüpteki hücreleri 5 mikrolitre propidyum iyodür ile etiketleyin.Hücreleri başka bir santrifüjleme yoluyla toplayın ve itlaf kültürünü iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri aynı santrifüj koşulları altında santrifüjleyin ve peleti 25 mikrolitre taze eksik NK hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri Akış Sitometrisi ile analiz etmek için önce, sistemi temizlemek için görüntüleme akış sitometresi yazılımındaki başlat düğmesine tıklayın.Ardından, dört dağılım grafiği oluşturmak için dağılım grafiği düğmesine tıklayın ve çift pozitif kontrol tüpünü yükleyin. Çift pozitif kontrol örneğini kullanarak, dedektörün aşırı yüklenmemesi için 405 miliwatt lazer için istenen yoğunluğu belirleyin ve görüntüleyiciyi uygun sayıda hücre sayımı elde edecek şekilde ayarlayın. 405 miliwatt lazeri hem DIO hem de PI'nin tespiti için uygun bir yoğunluğa ayarlamak, hem boyalar hem de akış sitometresinin algılama aralığı ile ilgili deneyim gerektirecektir.Çift pozitif kontrol örneğinin alınması tamamlandıktan sonra, yalnızca DIO kontrol örneğini yükleyin, 40X hedefini seçin ve 642 miliwatt lazeri ve Brightfield kanalını kapatın. Uygun sayıda hücreyi üretin ve sadece propidyum iyodür numunesi için edinimi tekrarlayın. Tüm kontrol örnekleri çalıştırıldığında, 405 miliwatt lazeri ve Brightfield kanalını tekrar açın ve Yoğunluğu Ayarla'ya tıklayın.Ardından, Dosya Alma sekmesi altında özel bir dosya adı girin ve veri dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin. Ardından, alınacak hücre sayısını girin. İlk deneysel numune tüpünü yükleyin ve Al düğmesine tıklayın.Tüm örnekler çalıştırıldığında, görüntüleme akış sitometresi analiz yazılımı uygulamasını açın ve tek bir deneysel RIF dosyasını açın. Ücret sekmesi altında Yeni Matris Oluştur'u seçin. Yazılım, tek renkli dosyaların seçilmesini isteyecek ve kanal telafisini uygulamak için seçilecek bir matris dosyası oluşturmak üzere bunları birleştirecektir.Uygun nokta grafiklerini ayarlamak için Yapı Taşları işlevini kullanın. Ardından, her kapıdaki hücre numaralarına erişmek için istatistik işlevine tıklayın. Bu temsili deneyde, kan örnekleri belirtildiği gibi çizildi ve her koşucu için ve her bir zaman noktası için ortalama olarak mililitre tam kan başına NK hücrelerinin konsantrasyonu ölçüldü.Dört koşucudan üçü, egzersizden sonra NK hücre sayısında benzer hafif bir artış gösterdi. Hemen ardından, olayın bitiminden 24 ila 48 saat sonra yavaş yavaş normale dönmeden önce keskin bir düşüş gelir. Ortalama olarak, NK hücre sayısı egzersizden 1.5 saat sonra azaldı, ancak 24 saat sonra normale yakın seviyelere geri döndü.Hücre sayımı hesaplandıktan sonra, NK hücrelerinin sitotoksik aktivitesi, NK hücre sitotoksisitesinde hemen ve egzersiz olayının sona ermesinden 1.5 saat sonra, egzersizden 24 saat sonra önemli ölçüde artarak, gösterildiği gibi hemen analiz edildi. NK sitotoksisitesi, anlamlı olmasa da, egzersiz öncesi seviyelere kıyasla yüksek kaldı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulandığında yaklaşık dört saat içinde tamamlanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, insan kan örneklerinden NK hücre sayısını ve sitotoksik aktiviteyi tekrarlanabilir hidropik bir şekilde nasıl elde edeceğinizi ve karakterize edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

flow-cytometric-analysis-natural-killer-cell-lytic-activity-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, doğal öldürücü hücrelerin floresan lekeli hedef hücrelere karşı litik aktivitesini göstermektedir. Yöntem, ölü hücreleri boyayarak ve canlı ve ölü hedef hücreleri ölçmek için bir akış sitometresi kullanarak NK hücresinin neden olduğu sitotoksisite ölçümünü mümkün kılar.

Akış Sitometrik Analizi için Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite Testi Numune Hazırlama

Bu video, hedef kanser hücrelerine karşı doğal öldürücü (NK) hücrelerin sitotoksisitesini belirlemek için bir laktat dehidrojenaz salım testinin gerçekleştirilmesini göstermektedir. Test, oluşan kırmızı renkli ürünün absorbansını ölçerek sitoplazmik laktat dehidrojenaz enziminin kanser hücrelerinden salınmasını ölçer.

Kanser Hücrelerine Karşı Doğal Öldürücü Hücre Sitotoksisitesini Değerlendirmek için İn Vitro Test

Bu protokol, hassas, hücre bazlı bir sitotoksisite testini tanımlar. Artan sayıda efektör CD8 + T hücresinin varlığında canlı hedef CD4 + T hücrelerinin frekansındaki azalmayı numaralandırarak, bu test antijene özgü CD8 + T hücrelerinin sitolitik aktivitesinin doğrudan değerlendirilmesine izin verir.

Sitotoksik Aktiviteyi Ölçmek için Hücre Bazlı Akış Sitometrisi Testi

Basit ve güvenilir bir yöntem, örneğin, farklı NK hücresi alt-gruplar içinde degranülasyonu, sitokin ve kemokin üretimi gibi NK hücresi fonksiyonlarının bir dizi analiz için tarif edilmektedir.

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Kantitatif insan doğal katil hücrelerin sitotoksik etkinliğini belirlemek için Akış Sitometresi tabanlı yöntemi burada gösterilir.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Kanser hücreleri tarafından doğal katil (NK) hücre aracılı eradikasyon kaçırma kanser inisiyasyonu ve ilerlemesi için önemlidir. Burada, hepatik tümör hücrelerine doğru NK hücre aracılı sitotoksisitesini değerlendirmek için radyoaktivite ye dayalı olmayan iki protokol siyoruz. Ayrıca, NK hücre geçişini çözümlemek için üçüncü bir protokol sunulur.

Hepatik Tümör Hücreleri Bağlamında Doğal Öldürücü Hücre Aracılı Sitotoksisite ve GöçÖlçümü

İnsan doğal öldürücü hücrelerindeki terapötik antikorlar tarafından FcφRIIIa güdümlü olayları incelemek için bir protokol burada açıklanmıştır. Bu yapay stimülasyon platformu, degranülasyon, kemokin/sitokin üretimi gibi aşağı akış efektör fonksiyonlarının ve bağlamada yer alan antikorların FcφRIIIa ve Fc bölümlerinin aracılık ettiği sinyal yollarının sorgulenmesine izin verir.

Terapötik Antikorların Varlığında FcφRIIIa Katılımı tarafından Yönlendirilen İnsan Doğal Öldürücü Hücre Olaylarının Değerlendirilmesi

Bu yazıda, periferik kandan izole edilen primer insan Doğal Öldürücü (NK) hücrelerinde glikoliz ve mitokondriyal solunumu ölçmek için bir yöntem, istirahatte veya IL15 kaynaklı aktivasyonu takiben açıklıyoruz. Açıklanan protokol kolayca birincil insan NK hücreleri diğer sitokinler veya çözünür uyaranlar tarafından aktive genişletilebilir.

İnsan Doğal Katil Hücre Metabolizmasının Analizi

Bu protokol, lenssiz gölge görüntüleme teknolojisini kullanarak doğal öldürücü (NK) hücre sayısı ve aktivitesinin hızlı tek hücreli analizi için etiketsiz bir yöntemi tanımlar. Bu yöntem, kırınım modellerinin bilgisayarlı analizi ile tek tek NK hücrelerindeki morfolojik değişiklikleri ölçer.

Doğal öldürücü hücre aktivasyonunun hızlı, etiketsiz analizi için sahada konuşlandırılabilir lenssiz görüntüleme platformu

Bu protokol, canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanılarak insan doğal katil hücrelerinin doğal, kimerik antijen reseptörü aracılı ve antikor bağımlı sitotoksisitesinin tutarlı ölçümü için standartlaştırılmış bir in vitro iş akışı sağlar.

Canlı hücre görüntüleme ve akış sitometrisi kullanarak kimerik antijen reseptörleri ve terapötik antikorlarla potantize edilen NK-hücre sitotoksisitesinin nicelendirilmesi

Öğrenin, insan tam kan örneklerinden NK hücre sayımı ve sitotoksisite düzeylerini akış sitometri ile hızlı ve güvenilir şekilde belirleme yöntemini. Bu teknik immünolojik araştırmalarda tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

Daha fazla video keşfet