3D Baskı Teknolojisini kullanan Histoloji ile MRG Birleştirme: Beyin için Protokol Kesit

Bu protokolün genel amacı, özel olarak 3D baskı ile üretilmiş beyin tutucular ve dilimleme kutuları aracılığıyla manyetik rezonans görüntüleme görüntü hacimlerini histoloji kesitleriyle doğru bir şekilde hizalamaktır. Bu video marmoset'ten alınan beyin dokusuna odaklansa da, bu protokol kemirgen, insan dışı primat veya insan fark etmeksizin her türlü beyin için uygulanabilir. Çalışma istasyonunu protokolde açıklandığı şekilde hazırlayın.

Tüpü 20 mililitre çizgisine kadar Fomblin ve gazlı bez ile doldurun. İşlem sırasında hava kabarcıklarını gidermek için gazlı bezi sıkıştırın. Beyni formalinden nazikçe kurulayın.

Ardından beyni, ön kısmı tüpün altına gelecek şekilde yerleştirin. Beynin konumunu sabitlemek için yan taraflarına gazlı bez yerleştirerek beyni tüp içinde dikkatlice sabitleyin. Tüpün geri kalanını gazlı bez ve Fomblin ile doldurun.

İşlem boyunca hava kabarcıklarını dikkatlice giderin. Ardından kapağı sıkıca kapatın ve tüpü parafin ile mühürleyin. Kapağı ve hattı interhemisferik fissürle işaretleyin.

Ardından tüpü bir kağıt havluya sarın ve işaret üst orta konumda olacak şekilde bobine yerleştirin. Bobini MRI tarayıcısına yerleştirin. Görüntüleme ve son işlemden sonra, beynin dijital bir modelini oluşturmak için kullanabileceğimiz T2 ağırlıklı bir görüntü elde ederiz.

MRI görüntüsünü koronal oryantasyonda açın. Ardından, görüntüyü 1 milimetre izotropik voksellele yeniden örneklemek için transformasyon araçlarını kullanın. Sonrasında, doğrusal olmayan bir gürültü azaltma filtresi uygulayın.

Görüntüleme seçeneklerinden bakma tablosunu (look up table) seçin. Ardından çift Eşik (dual Threshold) düğmesine tıklayın. Tüm beyni kapsayacak şekilde grafikteki sürgüyü kaydırın.

Min/maks kullanarak Eşikleme (Threshold) Segmentasyon algoritmasıyla ikili bir beyin maskesi oluşturun. Yoğunluk grafiğinin sol alt köşesinde, ölçeğin hemen altında bulunan değeri Alt sınır (Lower limit) kutusuna girin. Ardından İkili (Binary) seçeneğini seçin ve Ters eşikleme (Inverse threshold) işaretini kaldırın.

Morphological algoritmasını ve Fill holes (Boşlukları Doldur) seçeneğini belirleyin. Process in 2.5D seçeneğini işaretleyin. Arka beyin ile korteks arasındaki boşluğu doldurmak için line VOI seçeneğini belirleyin.

Beynin her iki tarafında, en lateral noktada arka beyin ile korteks arasında bir bağlantı çizin. VOI bağlantılarını beyin boyunca çizmeye devam edin. VOI'leri ikili maskeye dönüştürün.

OR işlemini seçerek VOI ve beyin İkili maskelerini birleştirmek için Görüntü hesaplayıcısını kullanın. Hedef görüntü türünü yükselt seçeneğini seçin. Şimdi Morfolojik algoritma altından Boşlukları doldur işlemini seçin.

Ardından 2.5D'de İşlem (Process) seçeneğini kontrol edin. Yüzeyi Çıkar (Extract surface) algoritmasını seçin, Maske görüntüsünü (Mask image) seçin, bir isim girin ve ardından ply dosya türünü seçin. Kesme kutusundaki dilim düzlemi konumuna karşılık gelen boşluklar; beynin ön kısmından, arka kısmından veya burada görülen beyaz cevherdeki lezyonlar gibi ilgi çekici bir alana göre yerleştirilebilir.

Kutu VOI kullanarak beynin etrafına bir kutu çizin. Kutuyu, hedeflenen plaka boşluk kalınlığına karşılık gelen MRI kesit sayısı kadar kopyalayıp yapıştırın. Ardından, her bölümdeki MRI kesit sayısı kadar ileri atlayın ve başka bir bıçak boşluğu oluşturmak için kutuyu daha önce yapıldığı gibi yerleştirin.

Bu işlemi beyin boyunca tekrarlayın. Kutu VOI'lerini ikili maskeye (Binary mask) dönüştürün. Ardından, beyin için daha önce yapıldığı gibi Extract surface kullanarak yüzeyi çıkarın.

Bıçak boşluğunun İkili maskesini seçin. Görüntü matematiğini (Image math) kullanarak bunu 10.000 ile çarpın. Ardından, çarpılan İkili maskeyi yeniden örneklenmiş izotropik MRI'a eklemek için Görüntü hesaplayıcıyı (Image calculator) kullanın.

Şimdi triplanar görünüm seçilerek, beynin dilimleneceği konumu gösteren bir MRI bıçak haritası üç ortogonal görünümde görüntülenebilir. Netfabb Professional'da, Add part seçeneğini seçin. Ardından Blade Gap modelini ve Brain Model katmanlarını seçin.

Beyin modelini seçin ve onarım moduna tıklayın. Beyni seçmek için kabuk seçim düğmesini kullanın. Ardından seçimi diğer kabuklara kaydırın ve bunları silin.

Ardından onarımı uygulayın ve eski parçayı kaldırın. Beyin seçiliyken, Taşı'yı (Move) seçin. Başlangıç noktasına (to origin) tıklayın ve X, Y ve Z kutularındaki parametreleri kaydedin.

Bunlar, bıçak boşluğu konumlandırmasını korumak için gereklidir. Çevir'e tıklayın. Ve pencereyi kapatın.

Blade Gap modelini seçin ve önceki adımda kaydedilen parametreleri kullanarak translate işlemini gerçekleştirin. Brain modelini seçin ve onarım moduna tıklayın. Beyni seçmek için kabuk seçim düğmesini kullanın.

Ardından Smooth triangles seçeneğini seçin. Iterations sayısı için dört değerini girin. Ve Prevent volume shrinking kutucuğunu işaretleyin.

Reduce Triangles seçeneğini belirleyin ve Target Triangle Count kutusuna 200000 girin. Ardından Automatic repair seçeneğini belirleyerek varsayılan onarımı gerçekleştirin. Onarımı uygulayın.

Ardından, düzleştirilmiş beyin modelini STL olarak dışa aktarın. Düzleştirilmiş beyin modelini Meshmixer'a aktarın. Çizgi VOI'ler ile çizilen alanları düzeltmek için heykel (sculpting) araçlarını kullanın.

Ve modeldeki diğer küçük kusurları giderin. Yumuşatılmış, düzenlenmiş beyin modelini Netfabb Professional'a aktarın. Ardından parçayı, brain slicer parts marmoset, ekleyin.

Kabukları (Shells) parçalara ayırmak için "parts" seçeneğini belirleyin. Ardından her bir parçayı protokolde açıklandığı şekilde yeniden adlandırın. Protokolde belirtilen seçim ayarlarını kullanarak, beyni kutunun merkezine konumlandırmak için parçaları tıklayıp sürükleyin.

Beynin kutu içindeki derinliğini ayarlamak için parçaları tıklayıp sürükleyin. Kutu içindeki kesilmiş modelde düzleştirilmiş, düzenlenmiş beyin modelini seçin ve boolean işlemini seçin. Beyin modelini kırmızıya çevirmek için üzerine tıklayın.

Ve boolean çıkarma işlemini seçin. Hesaplamaları uygulayın. Beynin düzgün yerleştirilmesini engelleyecek olan çıkıntılar için kutucuğu işaretleyin.

Bunları uzaklaştırmak için yönteme protokolün ek bölümünden bakınız. Bıçak boşluğu modelini seçin ve taşı (move) düğmesine tıklayın. Z pozisyonunda kayıt yapın.

Burası en posterior bıçak boşluğunun konumu olacaktır. Ardından pencereyi kapatın. Beyin dilimleyici parçalar arasından bıçak parçasını seçin ve Taşı'ya tıklayın.

Önceki adımdan elde edilen Z değerini girin. Ardından mevcut konum X ve Y değerlerini girin. Mutlak Öteleme'yi (absolute Translation) seçin ve öteleyin.

Çoğalt'a tıklayın. Burada gösterildiği gibi kesit kalınlığı tutarlıysa, toplam kanat sayısını, toplam sayıyı ve Z sayısını girin ve Z boşluğu kutusuna kesit kalınlığını yazın. Ardından çoğalt seçeneğini belirleyin.

Beyin dilimleyici parçaları arasından mikrotom bıçağı parçasını seçin. Bıçak parçasıyla yapılan hareket ettirme ve çoğaltma adımlarını tekrarlayın. Tüm Mikrotom Bıçaklarını ve ana bıçak tutucuyu seçip boolean işlemine tıklayın.

Mikrotom Bıçaklarının tümünü seçerek onları kırmızıya çevirin ve boolean çıkarma işlemine tıklayın. Ardından hesaplamaları uygulayın. Onarım moduna girin ve Otomatik onarımı seçin.

Kapsamlı Onarım (Extended Repair) işlemini gerçekleştirin ve onarımı uygulayın. Bıçak tutucusunu STL olarak dışa aktarın. Tüm bıçakları, ana ve alt kutuları ve düzleştirilmiş, düzenlenmiş Beyin modelini seçin ve boolean işlemine tıklayın.

Ana kutu dışındaki tüm Parçaları kırmızıya çevirmek için Parça seçim penceresini kullanın. Ardından boolean çıkarma işlemini seçin. Hesaplamaları uygulayın.

Onarım moduna girin ve beyni yaralayabilecek keskin kenarlar için onay kutusunu işaretleyin. Bunlar Netfabb onarım modunda veya Meshmixer'daki şekillendirme araçları kullanılarak onarılabilir.

Ardından Otomatik onarımı seçin. Genişletilmiş Onarım gerçekleştirin. Sonra onarımı uygulayın.

Beyin kutusunu STL olarak dışa aktarın. Cura'da Yükle'yi seçin ve Beyin Kutusunu içeri aktarın. Döndür butonuna tıklayın.

Ardından, kutuyu düzlemek için tıklayıp sürükleyin. Yazdırma ayarlarını protokolde gösterildiği şekilde düzenleyin. Daha sonra araç yolunu kaydedin.

Bıçak tutucu için de aynı işlemi uygulayın ve nesneyi çoğaltın. Ardından takım yolunu kaydedin. Baskı tablasına ince bir katman yapıştırıcı sürdükten sonra, beyin kutusunu ve bıçak tutucuları protokolde açıklanan ayarları kullanarak 3D yazıcıda basın.

Baskı işlemleri tamamlandıktan sonra beyin kesim için hazırlanabilir. Protokolde açıklandığı şekilde bir çalışma istasyonu kurun. Beyni kutuya dikkatlice yerleştirin ve sabitlendiğinden emin olun.

Mikrotom bıçaklarını, bıçak tutucuyla birlikte kutudaki karşılık gelen boşluklara yerleştirin. Koruyucu eldivenler giyilmiş haldeyken, bıçak tutucuları sıkıca aşağı doğru itin. Beyni kesmek için yavaş ve dengeli bir basınç uygulayın.

Beynin ön kısmından başlayarak plakaları tek tek çıkarın. Bu yaklaşım basit görünse de yöntem, birçok adımın yanı sıra çeşitli yazılım türlerinin kullanımını gerektirdiğinden, araştırmacılar prosedüre başlamadan önce kullanıcı arayüzlerine aşina olmalıdır. Bu iş akışı, Marmoset beyin dilimleme kutusunun yapım protokolünü özetlemektedir.

Beyin Formalin ile fikse edilir ve 150 mikron çözünürlükte T2 ağırlıklı bir MRI alınır. Görüntüler işlenir ve bir İkili maske oluşturmak için eşikleme işlemine tabi tutulur. Ardından yüzey, 3D modelleme yazılımında render edilir.

Bir dilimleme şablonu ile beyin modeli arasında yapılan boolean çıkarma işlemi, beyin dilimleyicinin dijital modelini oluşturur. Ardından, beyin dilimleme kutusu bir 3D yazıcıda basılır. Daha sonra beyin, kesim işlemi için dilimleme kutusuna sıkıca yerleştirilir.

Beyin dilimlendikten sonra, In Vivo ve post-mortem MRI görüntüleri ile dilimlerin yüzeysel yüzeylerinin fotoğrafları arasında yapılan görsel bir karşılaştırma, birden fazla dilim boyunca iyi bir oryantasyon eşleşmesi olduğunu ortaya koyar. Yüksek çözünürlüklü post-mortem MRI ile birden fazla beyin diliminden alınan LFB CV boyalı histoloji kesitleri arasında yapılan daha kapsamlı bir karşılaştırma, marmoset beyninin tüm yapıları genelinde doğru ve tutarlı bir eşleşme olduğunu göstermektedir. Multipl Skleroz'un bu hayvan modelinde, hayvanların beynine yayılmış beyaz cevher lezyonları gelişir.

Bu teknik kullanılarak, In Vivo MRI'da tespit edilen küçük lezyonlar hem post-mortem MRI'da hem de histoloji kesitlerinde takip edilebilir. Histoloji ve post-mortem MRI, ayrıca In Vivo MRI'da gözden kaçan lezyonları da ortaya çıkarabilir. Burada, In Vivo MRI, her iki optik traktusta da lezyonlara işaret eden normal, hiperintens sinyal hakkında ikna edici bir kanıt göstermemiştir.

Buna rağmen, post-mortem MRI'da optik traktusta sinyal hiperintensiteleri gözlemlenmiştir. Bu alanlar, LFB CV histoloji kesitinde görülen miyelinli lezyonlarla doğrudan örtüşmekteydi. Sonuç olarak, burada sunulan metodoloji, araştırmacıların MRI bulgularının altında yatan patolojiyi doğru bir şekilde değerlendirmesine olanak tanımaktadır.

Bunun, beyinle ilişkili hastalıklar ile inflamasyon ve remiyelinasyon gibi spesifik patolojik süreçler için yeni biyobelirteçlerin belirlenmesinde gelecek vadeden bir yaklaşım olduğunu düşünüyoruz.