Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Hızlı Nano konumlandırma sisteminin genel amacı, tek moleküllü FRET deneylerini titiz istatistiksel analizlerle birleştirerek biyomoleküllerin gerçek zamanlı yapısal bilgilerini sağlamaktır. Bu yöntem, standart yapı biyolojisi araçlarının uygulanamadığı makromoleküllerdeki esnek alanların lokalizasyonu gibi yapısal biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlar. Hızlı NPS'nin diğer FRET tabanlı yapısal araçlara kıyasla en büyük iyileştirmesi, farklı boya modellerinin yalnızca en olası konumlar değil, aynı zamanda üç boyutlu bir olasılık dağılımı kullanılarak karşılaştırılabilmesidir.

Bu tekniğin temel avantajı, protein veri tabanından gelen yapısal verileri kantitatif tek moleküllü floresan ölçümleriyle birleştirmesidir. Prosedüre başlamak için bir akış odası ve numune tutucu monte edin. Giriş ve çıkış vidalarını hazırlamak için, silikon boruyu içi boş tırnaklı vidalara geçirin ve boruyu her iki ucundan bir tıraş bıçağıyla düz bir şekilde kesin.

Tırnak vidalarını numune tutucuya vidalayın. Akış odasının kuvars sürgülü deliklerini numune tutucu dişlerle hizalayın. Akış haznesini yerine sabitlemek için cam tutucu vidaları hafifçe sıkın.

20 santimetre uzunluğundaki silikon boru parçalarını giriş ve çıkış vidalarına geçirin. Akış odasını 500 mikrolitre PBS ile yıkayın. Daha sonra akış odasını PBS'de 100 mikrolitre nötravidin çözeltisi ile yıkayın ve havanın numune odasına girmesini önlemek için giriş borusunun sonunda bir damlacık oluşmasını sağlayın.

Akış odasından havayı çıkarmak için her manipülasyondan sonra giriş ve çıkış borusunu kapatın. Odayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, nötravidin çözeltisini 500 mikrolitre PBS ile yıkayın.

Prizmanın üzerine bir damla daldırma yağı ekleyin ve prizmayı numune haznesine vidalayın. Tek moleküllü FRET verileri, toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanılarak elde edilir. Kamera yazılımını ve sahne piezo motor yazılımını başlatın.

Odayı TIRF mikroskobunun mikrometre aşamasına yatay olarak, mümkün olduğunca düz ve üç lazeri de kesecek şekilde monte edin. Daldırma sıvısı ekleyin ve IR yansımalarını kontrol ederek mikroskop objektifine odaklanın. Kamera parametrelerini, dosya yolunu ve otomatik artış parametrelerini ayarlayın.

Canlı kamera beslemesini başlatın ve üç lazeri de tam yoğunlukta kullanarak arka plan floresansını ağartın. Ardından, lazer yoğunluklarını azaltın. Ardından, hazneye 100 mikrolitre floresan boncuk çözeltisi yükleyin.

Boncukların hazne yüzeyine yapışması için 10 dakika bekleyin. 50 ila 100 boncuk görüş alanına sahip bir film kaydedin ve yüksek tepe bulma eşiği ile toplu analiz gerçekleştirin. Film dosyasını yükleyin ve görüş alanının zıt köşelerinde farklı merkezlere sahip iki boncuk seçin.

Bu boncuklardaki maksimum yoğunluktaki pikselleri seçin. Prizmayı çıkarın ve temizleyin. İkinci bir numune odası hazırlayın ve prizma tutucuyu hazneye vidalayın.

Odayı mikrometre aşamasına monte edin. Ardından, 50 ila 100 pikomolar biyotinillenmiş floresan etiketli numune çözeltisinden 100 mikrolitre hazneye yükleyin. Moleküllerin oda yüzeyine bağlanmasını bekleyin.

Kaydı başlatmak ve donör uyarma lazerini açmak için Sinyal Al'a aynı anda tıklayın. Görüş alanındaki moleküllerin en az% 80'inin ağartılmasını sağlamak için lazer gücünü ayarlayın, Ardından, ağartılmamış bir alanı göstermek için odayı hareket ettirin ve bir sonraki filmi kaydedin. Numune odasının geri kalanını bu şekilde ağartın.

TIRF mikroskobundaki ölçümlerden sonra, elde edilen tek moleküllü FRET verilerinin, ortalama FRET verimliliğini elde etmek için analiz edilmesi gerekir. Numunenin donör ve alıcı filmlerinin toplu analizini yapın. Ardından, toplu film dosyalarını veri analiz yazılımına yükleyin.

Bireysel FRET aşamalarını belirtmek için Seçilmedi düğmesine tıklayın. FRET döneminin başlangıcına, ardından beyazlatma nedeniyle alıcı yoğunluğunun azaldığı zaman noktasına ve son olarak ağartma nedeniyle donör yoğunluğunun azaldığı zaman noktasına tıklayın. Bir sonraki pencerede, seçilen FRET verimlilik izini korumak için Evet'i seçin.

Her molekül analiz edildikten sonra, izleri kaydedin ve bir sonraki filmi analiz edin. Analiz tamamlandıktan sonra, FRET sonuçlarını birleştirmek için bir komut dosyası çalıştırın. Varsayılan giriş seçeneğini kullanarak birleştirilmiş çerçeve bazında FRET dosyasını veri analizi yazılımına aktarın.

Verileri bir histogram olarak çizin ve bir Gauss'a sığdırmak için doğrusal olmayan eğri uydurma aracını kullanın. Aşan değer, ana FRET verimliliğidir. İzotropik Forster yarıçapını ve her boya için kararlı durum anizotropi değerlerini belirlemek için UV VIS ve floresan spektroskopisi kullanın.

Nano konumlandırma sistemi, bilinmeyen bir konumu, anteni, bilinen birkaç konumla, uyduları lokalize ederken, iyi bilinen GPS'den ilham aldı. NPS analizine başlamak için FastNPS yazılımını başlatın ve yeni bir iş dosyası oluşturun. Etiketli antenlerin ve uyduların konum öncüllerini tanımlamak için, ModelDyePrior penceresinde, tanımlanan konumun uzamsal çözünürlüğünü girin.

İlgili ortalanmış PDB dosyasını yükleyerek makromolekülün iç kısmını hariç tutun. Boya çapını ve iskeletleşme mesafesini girin. Olası boya konumunun minimum ve maksimum konum koordinatlarını doldurun.

Tanımlanan konum bir uydu ise, esnek bağlayıcı aracılığıyla boya ekini seçin ve ortalanmış PDB dosyasından atom koordinatlarını girin. Bağlayıcının uzunluğunu ve çapını doldurun. Erişilebilir hacmi hesapla'ya tıklayın, önceki konumu kaydedin ve görselleştirme için dışa aktarın.

Bu işlemi tüm uydular ve antenler için tekrarlayın. Pozisyonlar tanımlandıktan sonra, Ölçümü Tanımla penceresini açın ve yeni bir boya molekülü oluşturun. Bu boya ile ilişkilendirilmiş önceki konumu yükleyin.

Floresan anizotropisini doldurun, uygun bir boya modeli seçin ve boyayı etkinleştirin. Tüm boyalar tanımlanana kadar bu işlemi tekrarlayın. Ardından, yeni bir ölçüm oluşturun.

Tanımlanan boyalardan bir FRET çifti seçin. Hatalı tek moleküllü FRET verimliliğini ve bu boya çiftinin izotropik Forster yarıçapını girin ve ölçümü etkinleştirin. Bunu tüm boya çiftleri için tekrarlayın.

Ardından, hesaplama penceresini açın. Boyalar farklı modellere atanmışsa, Kullanıcı Tanımlı'yı seçin. Aksi takdirde, tüm boyalar için kullanılacak modeli seçin.

Hesaplamayı gerçekleştirin ve sonuçlar penceresini açın. FastNPS'yi kullanırken, elbette tutarlı kalırken güvenilir hacimleri en aza indirmek için modelleri tüm boyalar için uyarlamayı unutmamak önemlidir. Tutarlılık %90'dan düşükse, ayrıntılı tutarlılığı tıklayın ve %90'dan az tutarlılığa sahip girişler için ortak olan boyaları belirleyin.

Ölçü Tanımla penceresini açın ve söz konusu boyanın modelini değiştirin. Hesaplamayı Kullanıcı Tanımlı modunda yeniden çalıştırın. Boyaların güvenilir hacimlerini tek tek veya toplu olarak dışa aktarın.

Görselleştirme yazılımında yoğunluk dosyalarını açın ve güvenilirliği istenen seviyeye ayarlayın. Tek moleküllü FRET verimlilikleri, bilinmeyen anten molekülleri ile bir arkeal RNA polimeraz açık promotor kompleksi içindeki bilinen birkaç uydu molekülü arasında ölçüldü. Bu verilerin NPS analizi, arkeal RNA polimeraz açık promotor kompleksine göre bu boya moleküllerinin güvenilir hacimlerini belirledi.

Boya moleküllerinin kullanıldığı beş farklı model incelenmiş ve sonuçlar karşılaştırılmıştır. Güvenilir hacimler, boyanın yalnızca bilinmeyen yönelimli bir koni içinde serbestçe dönebileceğini varsayan modellerle hesaplandığında ölçülen verilerle tutarlıydı. Özellikle klasik model, boyanın sabit bir yerde olduğunu varsaydığı için en muhafazakar olanıdır.

Bu, nispeten büyük bir güvenilir hacim oluşturur, ancak hacim genellikle doğru pozisyonu kapsar. Daha yüksek hassasiyetli modeller, boyanın floresan ömrü boyunca dönme konusunda tamamen serbest olduğu varsayımını kullanır. ISO modeli, klasik model gibi, boyanın erişilebilir hacim içinde sabit bir konumda olduğunu varsayar.

meanpos-iso modeli, tüm olası konumlar üzerinde dinamik ortalamayı varsayar. ISO modellerinin güvenilir hacimleri, iso olmayan modeller tarafından hesaplananlardan çok daha küçük olsa da, ölçülen verilerle tutarsızdır. Mevcut yapısal araçlar tarafından ele alınamayan bir sorun olan geçici komplekslerin dinamik yapısal bilgilerini yakalamamıza izin veren bir teknik geliştirmek istedik.

Tek moleküllü FRET verileri kaydedildikten sonra, FastNPS analizi birkaç saat içinde yapılır ve farklı boya modellerinin hızlı bir şekilde karşılaştırılmasına olanak tanır. Bu prosedürü takiben, deneysel tek moleküllü FRET verileriyle tutarlı yapılandırılmış modeller elde etmek için MD simülasyonları gibi diğer yöntemler daha sonra gerçekleştirilebilir.