Name: Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Öğrenin tek molekül FRET deneyleriyle biyomoleküllerin yapısal analizini TIRF mikroskobu ve Bayes çıkarım yazılımı kullanarak gerçekleştirmeyi. Bu yöntem esnek alanların lokalizasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, akış odasının mekanik çizimleri için B. Gruchmann'a teşekkür eder. Ayrıca, NPS ve temel örnekleme motoru ile ilgili anlayışlı yorumları ve tartışmaları için Max Beckers ve Florian Drechsler'e minnettarlığımızı ifade etmek istiyoruz.

<ol><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Particle+Cryo-EM+at+Crystallographic+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution.</a> Cell. 161, 450-457 (2015).</li>
<li>Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+X-ray+Crystallographic+Structure+Determination+of+Biological+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules.</a> Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).</li>
<li>Sali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+the+First+wwPDB+Hybrid%2FIntegrative+Methods+Task+Force+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop.</a> Structure. 23, 1156-1167 (2015).</li>
<li>Hopfner, K. P., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nucleic+acid+translocases%3A+lessons+from+structural+biology+and+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics.</a> Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+and+applications+to+biomolecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM and applications to biomolecular systems.</a> Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).</li>
<li>Neuman, K. K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Single-Molecule+Fluorescence+Methods+for+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology.</a> Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).</li>
<li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation%3A+single-molecule+FRET+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li>
<li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer%3A+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).</li>
<li>Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+Orientation+and+Domain+Conformation+of+the+E.+coli+Rep+Helicase+Monomer+Bound+to+a+Partial+Duplex+Junction%3A+Single-molecule+Studies+of+Fluorescently+Labeled+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes.</a> J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+tracking+of+mRNA+exiting+from+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).</li>
<li>Schröder, G. F., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0010465504000748">FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments.</a> Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).</li>
<li>Margittai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer+reveals+a+dynamic+equilibrium+between+closed+and+open+conformations+of+syntaxin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).</li>
<li>Kalinin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+benchmark+study+for+FRET-restrained+high-precision+structural+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling.</a> Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).</li>
<li>Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nsmb/journal/v23/n2/full/nsmb.3148.html">N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).</li>
<li>Svensson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+trilateration+of+probes+bound+within+functional+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors.</a> Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).</li>
<li>Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+3D+RNA+structure+by+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET.</a> Methods. (2016), 1-11 (2016).</li>
<li>Lee, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).</li>
<li>Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+molecular+modeling+with+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET.</a> J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).</li>
<li>Schuler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein+structure+and+dynamics+-+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22J+nanoboitechnology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer.</a> J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).</li>
<li>Choi, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET-derived+model+of+the+synaptotagmin+1-SNARE+fusion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientational+freedom+of+molecular+probes.+The+orientation+factor+in+intramolecular+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer.</a> Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).</li>
<li>Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation of single molecules.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).</li>
<li>Muschielok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nano-positioning+system+for+macromolecular+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A nano-positioning system for macromolecular structural analysis.</a> Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).</li>
<li>Muschielok, A., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+nano-positioning+system+to+the+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks.</a> J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano+positioning+system+reveals+the+course+of+upstream+and+nontemplate+DNA+within+the+RNA+polymerase+ii+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).</li>
<li>Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Architecture+of+a+Minimal+RNA+Polymerase+II+Open+Promoter+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex.</a> Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).</li>
<li>Nagy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+architecture+of+the+archaeal+RNA+polymerase+open+complex+from+single-molecule%5BTitle%5D)+AND+%22FRET+and+NPS.+Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule.</a> FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161(2015).</li>
<li>Grohmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Initiation+Factor+TFE+and+the+Elongation+Factor+Spt4%2F5+Compete+for+the+RNAP+Clamp+during+Transcription+Initiation+and+Elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation.</a> Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).</li>
<li>Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+structural+information+from+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Quantitative structural information from single-molecule FRET.</a> Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).</li>
<li>Bennink, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+individual+nucleosomes+by+stretching+single+chromatin+fibers+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.</a> Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).</li>
<li>Chandradoss, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+determination+of+fluorescence+quantum+yields+of+transparent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples.</a> Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. Boston, MA. (2006).</li>
<li>Korkhin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+complex+RNA+polymerases%3A+The+complete+archaeal+RNA+polymerase+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure.</a> PLoS Biol. 7 (5), (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Doğru olarak örneğin biomacromolecules, nükleik asitler ve / veya proteinler esnek bağlayıcılar yoluyla bağlanmış boyalar arasında FRET verimliliğini belirlemek için setup ve deney prosedürü sunulmuştur. hassas smFRET ölçümleri (bölüm 3) sağlamak için, ölçüm sırasında herhangi bir zamanda akış odasından havayı uzak tutmak için çok önemlidir. Ayrıca, fluorophores akış odasına aşırı yüklenmeyin emin olun. fluorophores açıkça doğru analiz sağlamak için ayrılmalıdır. donörün beyazlatma görünmüyor smFRET çiftleri, analize dahil olmak zorunda olduğu gibi, görüş alanında moleküllerin&gt;% 80 filmin sonunda ağartılmış emin olun. Verici ve alıcı kanal cross-talk ve bağıl algılama verimliliği düzeltme, numune β-faktörü ve γ-faktörü homojen olmayan hesaba katılması için, sırasıyla, her biri için ayrı ayrı hesaplanır çifti FRET. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; kamera ayarları (entegrasyon süresi, elektron çoğaltıcı kazanç, pre-amplifikatör kazanç ve Bölüm 3.9&#39;da açıklanan okuma oranı) gürültü oranı, dinamik aralık ve zaman çözünürlüğü sinyali arasındaki en iyi dengeyi sağlayan değerlere ayarlanması gerekir. Farklı deneyler için ya da farklı donanım kullanıldığında yeniden ayarlanması gerekir. kare sayısı verici en gözlem süresi içinde ağartma maddesi molekülleri sağlamak için yeterince yüksek olması gerekir. floresan spektrometresi (Bölüm 7 ila 9) üzerine ölçümler için sinyal yoğunluğu ve kaydedilen verilerin spektral çözünürlüğü arasında iyi bir uzlaşma bulunmalıdır. Bu amaçla, flüoresan spektrometresi eksitasyon ve emisyon yolu yarıklar kullanılan aletin ve örnek konsantrasyonuna bağlıdır adapte edilmesi gerekir. Ayrıca, biz geçici veya dinamik MACROM yapısal bilgi almak için Hızlı NPS analiz yöntem mevcutolecular kompleksleri. NPS olmayan model DNA sarmalının yolu ve arkeal RNA polimeraz açık karmaşık transkripsiyon başlatma faktörleri konumunu göstermek için uygulanmıştır. 60&#39;dan fazla farklı mesafe ölçümlerinin ağını kullanarak, bunu bir yeni uygulamaya örnekleme motoru (hazırlık Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., ve Michaelis, J.) ile donatılmış Hızlı NPS, gösterdi orijinal küresel NPS yöntemine 27 ile karşılaştırıldığında, büyüklük ≈2 emriyle bu karmaşık smFRET ağının analizi için gerekli süreyi azaltır. algoritmanın sağlamlığı paralel tavlama şeması ile birlikte Metropolis-içinde-Gibbs örnekleyici yatmaktadır. Hızlı NPS ağ sonuçlarının tam tekrarlanabilirlik göstermektedir ve önceki 30 yayınlanan sonuçlarla tutarlıdır. Birçok farklı yöntem smFRET ölçümlerinden 11 yapısal bilgi anlaması nişan yayınlandı </sYukarıya&gt;, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Bu yaklaşımların her yalnızca belirli bir boya modelini sağlamaktadır. Bu nedenle, söz konusu modele göre yapılan varsayımlara yerine getirmeyen renklendiriciler, kullanılmış veya sahte yapısal bilgi yol edilemez. Hızlı NPS, tam tersine, her boya molekülü farklı bir model için seçmenize izin verir. Bu, her iki farklı yapısal davranışı için hesap olur, boya molekülü kendisi olarak yapışması için kullanılan bağlayıcı. boya molekülü lokal moleküler çevresi, hem de fiziksel özellikleri en uygun olan bir model belirler. arke başlatma kompleksinin analiz smFRET ağı için, tüm boya molekülleri için izotropik varsayım ciddi bir azalma i yol açarn güvenilir hacimlerinin büyüklüğü klasik modele kıyasla. Tüm boya için ortalama dinamik pozisyonu ile kombinasyon halinde (% 95) tüm güvenilir ses boyutları medyan molekülleri en az 0.5 nM ila 3 azaltır. Bununla birlikte, bu boya molekülü posteriors varsayımlar sahte yapısal bilgilere adına yapılan işaret, kendi smFRET ölçümleri artık tutarlıdır. Bunun aksine, klasik modelinde belirlenen posteriors tespit smFRET verim ile tutarlıdır. Tüm boyalar için ortalama izotropik ve / veya dinamik pozisyon varsayımı Fast-NPS her boya beş modellerden biri atanabilir hangi boya molekülü sabıkası sağlayan, tutarsızlıklara yol açar. Her model aynı erişilebilir hacmi kullanır. boya AVS hesaplanması için algoritma çeşitli varsayımlar yapar. İlk başta, fluorofor mekansal şekil bir küre ile yaklaşılır. Bu durumda, bir çapa hesabı flüorofor en wid alarakinci, boy ve kalınlıkta (Bölüm 12) kullanılmalıdır. Ayrıca, linker&#39;ın şekli esnek bir çubuk ile yaklaşılır. Bölüm 12&#39;de sunulan değerler, 12-Cı bağlayıcı ile bağlanmış boya Alexa 647 için hesaplanmıştır. Bugüne kadar, deneysel geometrisi verilen doğru model en uygundur önsel tespit etmek mümkün değildir, ve bu nedenle tüm modeller test edilmelidir. Hala veriler ile tutarlı olurken, genel olarak, bir, mümkün olan en küçük arka boyutunu verir modelini seçecektir. modellerin bir seçim smFRET verileri ile tutarlı olup olmadığını sınamak için, biz posterior ve olasılığını hem de hesaplar. Tutarlılık posterior alınan örneklerin% 90&#39;dan fazla olasılığının% 95 güven aralığında olduğu anlamına gelir. Bu doğru ise, boya moleküllerinin smFRET ağında, mesafe belirsizliği küçük, anizotropi düşük geometrik düzenlemeler de dikkate alınması gerektiğini. Bu nedenle, ise rTipik bir ilk tercihi bir iso modeli ile düşük floresan anizotropi ile boya molekülleri olan epresenting, tutarlılık testi doğru boya modelini seçmek için daha doğrudan bir araç sağlar. boya modelleri optimal seçim yerelleştirme hassas ciddi bir artışa yol ve aynı zamanda onun FRET verilerle ağın tutarlılık koruyabilirsiniz. Özetlemek gerekirse, Fast-NPS büyük makromoleküler kompleksleri yapısal ve dinamik bilgiler kazanç sağlar. X-ışını kristalografisi veya bu nedenle büyük ölçüde karmaşık biyolojik süreçlerin mekanistik anlama genişleyen son derece esnek veya geçici kompleksleri izleme sağlar kriyo elektron mikroskopisi gibi ortak yapısal yöntemlerin aksine.

Bir biyomolekül yapısını belirleme işlevini anlamak için bir anahtar önkoşuldur. Yapı tayini için iki köklü yöntemler cryo-elektron mikroskobu ve X-ışını kristalografisi 1, 2. Bugün, her iki yöntem angstrom düzeyine kadar bir çözünürlüğe sahip yüksek çözünürlüklü yapısal bilgi sağlar. Bu iki yöntem, bu protein kompleksleri gibi büyük biyomoleküllerin yapısının aydınlatmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Mevcut yöntemler sürekli son yıllarda boyunca geliştirilmiş olmasına rağmen, geniş bir dinamik ve geçici kompleksleri 3 incelenmiştir zaman, biyolojik yapıların karmaşıklığı hala, özellikle yapısal biyoloji için büyük bir sorun teşkil etmektedir. makromoleküler kompleksleri dinamiklerini ve özellikle yapı-fonksiyon ilişkisini incelemek amacıyla, tek-molekül metodolojileri prov vararyans yararlı bilgiler 4. Birkaç yeni stratejiler yapısal ve dinamik bilgi edinme ile ilgili bir ortogonal bir yaklaşım sağlayarak geliştirilmiştir. Örnekler, yüksek hızlı AFM 5, mekanik manipülasyon 6, floresans mikroskopisi yeri 7, hem de tek-molekül Förster Rezonans Enerji Transferi (smFRET) 8, 9 vardır. Oldukça erken FRET üzerinde beri nedeniyle biomacromolecules 10 uzunluğu ölçekte mesafe bağımlılığı, moleküler cetvel olarak adlandırılmıştır. SmFRET özellikle ilginç bir uygulama sonucuna smFRET ölçümlerden elde edilen mesafe bilgileri kullanmak bilgileri 11, 12, 13, 14, 15, yapısal &gt;, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Nedeniyle smFRET yüksek zaman çözünürlüğü, bir protein yapısının hareketli parçaları konumu lokalize edilebilir. Ancak, boya molekülleri hakkında smFRET veri önemli düzeltme parametreleri kantitatif bilgileri ayıklamak için ölçüm 24 sırasında tespit edilmesi gerekmektedir. Bu düzeltme faktörleri ile, verimliliği FRET E FRET formülü kullanılarak hesaplanabilir <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg"> , Nerede Bir ve ben D Şekil 2) vardır. β-faktör alıcı kanalı içine, çapraz konuşma için donör emisyon sızmasını hesapları ve hesaplanır <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg"> Ben A ve ben D nerede donör floresan yoğunlukları ve alıcı molekülün fotoğraf beyazlatma sonra alıcı molekül vardır. γ-faktörü iki kanal nispi algılama verimliliği farkı olarak vericinin flüoresan verim ve alıcı boya farkları düzeltir. Bu her bireyin zaman iz hesaplanır Bu açıklama, bazen önemli hale gelir ve yanı düzeltilmiş olması gerekir alıcı molekül, doğrudan uyarma ihmal olduğunu unutmayın. Bu düzeltme faktörleri belirlemek için foto-fiziksel değişiklikler ve yapısal dinamikleri ayırt etmek için bir alternatif şema 25 donör yanı sıra alıcısını hem heyecanlandırmak için yararlıdır. Nicel smFRET verimlilik değil, aynı zamanda niceliksel yapısal bilgi elde etmek değil, sadece sırayla, Nano-Konumlandırma Sistemi (NPS) 2008 26 tanıtıldı. adı uydu tabanlı Küresel Konumlandırma Sistemi (GPS) olan benzerliklerine göre seçildi. NPS biomacromolecular kompleksleri bilinmeyen boya pozisyonları lokalizasyonu için smFRET ve X-ışını kristalografisi verilerin birleştirilmesi melez bir tekniktir. crystal yapı referans çerçevesi olarak hizmet vermekte ve smFRET sonuçları bilinmeyen bir fluorofor konumunda (anten) ve kristal yapısının (uydu) bilinen bir pozisyon arasındaki mesafe bilgilerini elde etmek için kullanılır. üst üste deneylerde anten ve çeşitli uydu arasındaki mesafeler ölçülür ve anten konumu Bayesian parametre kestirimi göre istatistiksel olarak sıkı bir analiz düzeni vasıtası ile tespit edilir. Bunun bir sonucu olarak, antenin en muhtemel konumunu sadece hesaplanır, ancak tam bir 3D belirsizliği dağılımı denilen arka inanılır hacim ile görüntülenmiştir. Ayrıca, NPS tam smFRET ağları 27 analiz için genişletilmiştir. NPS ökaryotik transkripsiyon önemli sorular, yukarı DNA, şablon olmayan DNA ve RNA Polimeraz II uzama co içinde doğmakta olan mRNA yani tabii bir dizi çözmek için kullanılır olmuşturAyrıca transkripsiyon başlama etkisini gösteren mplex 12, 28, 26 faktörleri ve 29 açık promotundan dinamik mimari kompleks. Ayrıca, NPS transkripsiyon uzama faktörü Spt4 / 5 31 ile aynı merkezine yarışmalı olarak bağlandığı transkripsiyon başlatma faktörü TFE pozisyonuna arke RNA polimeraz açık kompleks 30 ve özellikle de bir yapı ortaya çıkarmak için kullanıldı. O zamandan beri, smFRET göre yapısal yaklaşımlar bir takım 15, 18, 21, 23 yayınlanmıştır. Farklı smFRET merkezli yapısal yöntemleri karşılaştırıldığında, yöntemin belirgin hassas boya modelleri özellikle tercih son derece bağımlı olduğu ortaya çıkıyor. Bir dikkat etmelisinizboya molekülleri kendi yerel ortama bağlı olarak farklı mekansal ve yönelim davranışlar gösterebilir. Bu amaçla, Fast-NPS 32 tanıtıldı. Hızlı NPS ölçüde hesaplama sürelerini azaltarak gelişmiş bir örnekleme algoritması kullanır. Ayrıca, Hızlı NPS bir yapısal analiz yapmak ve her boya molekülü için kullanıcının bir sonraki tarif edilecektir beş farklı boya modelleri bir dizi seçebilirsiniz sağlar. Klasik olarak adlandırılan en muhafazakar model, boya tek, ancak bilinmeyen, konuma sahiptir varsayar. Bu pozisyonda, flüorofor, büyüklüğü, ilgili (zamana bağlı) Fosforlu anisotropi, belirlenen bir koni içinde serbest dönebilir. koni oryantasyon mesafeler içine ölçülen smFRET verimlilik dönüştürürken büyük belirsizlikler yol açar, bilinmemektedir. diğer boya moduna göre en küçük hassas yol açacaktır çünkü bu bağlamda, modeli, muhafazakarls. Sadece çok kısa mesafeler için gereken farkedilir yanlış pozisyon tayin klasik modeli kurşun tarafından yapılan varsayımlar. Tipik smFRET değerleri için doğru pozisyonu her zaman nispeten büyük inandırıcı hacim içine alınır. Daha yüksek hassasiyet arzu edilir çünkü Ancak, geliştirmek ve hassasiyeti geliştirmek için yardımcı olabilir alternatif boya modelleri, test etmek önemlidir. Boya içsel floresans ömrü çok daha hızlı dönerse, sözde ISO modeli uygulanabilir. Burada, 2 k yönlenme faktörü (karakteristik izotropik Förster çapındaki hesaplanması için gerekli olan <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg"> ) 2/3 olarak ayarlanır. Klasik modeli 32 ile karşılaştırıldığında bir sonucu olarak, hesaplanan güvenilir bir hacim küçük büyüklük yaklaşık iki emirleri. Hızlı reori sadece sağlayan fluorofor bir ortamda bulunması halindetüm erişilebilir hacmi üzerinde entation, ancak ek olarak, hızlı hareket, meanpos-izo modeli kullanılır. Bu modelde, boya etkin bir mekansal ortalama bir polinom mesafe dönüşüm 15 ile açıklanabilir sadece bir ortalama konumunu kaplar. (Örneğin, genel olarak hidrofobik) boyası bir hidrofilik bölge, örneğin, DNA eklenmiş, bu model, geçerlidir. Meanpos-izo modeli uygulaması yaklaşık iki faktörü ile güvenilir bir hacim büyüklüğünde daha da azalmasına neden olmaktadır. Bununla birlikte, bir proteine ​​bağlı bir boya olarak, sterik olarak erişilebilir birim (AV) çeşitli hidrofobik yamalara tersinir olarak bağlanan olabilir. Anında bu bölgeler arasındaki geçiş, ancak bir bölgede serbest rotasyon uğrar ve içinde hızlı lokalize hareket en iyi var-meanpos-iso modeli ile tarif edilen bir fluorofor. Benzer bir durum için hangi boya modeli geçerlidir var-meanpos döndürmek için özgür değildir. Daha d Bu modelleri hakkında etails bizim son yayında 32 bulunabilir. Bu modeller, özellikle boya karşılaşabileceğiniz çeşitli ortamlarda hesabını ve bunları uygulamak akıllıca yerelleştirme hassasiyetini optimize etmek kapsamlı bir repertuar sunar. Hızlı NPS içinde belirli bir konuma bağlı her boya molekülü FRET ortakları farklı modelleri var izin verilen şekilde, tek bir modele atanabilir. Bu sınırsız ve yakın-doğa modelleme sağlar. Ancak, son bir modelin kombinasyonu ile elde edilen sonuçlar deneysel verilerle uyum içinde hala olduğundan emin olmak için sıkı istatistiksel testler gerçekleştirir önemlidir. Bu testler Hızlı NPS yazılım yer almaktadır. deneysel verilere Hızlı NPS uygulamak için (sadece) üç giriş parametreleri ölçümü gereklidir. İlk olarak, boya çift, spesifik bir izotropik Förster yarıçapları (/54782/54782eq5.jpg "/&gt;) Tespit edilecek olan donör boya. Bu nedenle, kuantum verimi (QY), donör floresans emisyon spektrumu ve alıcı absorpsiyon spektrumları ölçülmüş olması gerekir. Bu ölçümler de gerçekleştirilebilir standart bir spektrometre ve standart bir floresan spektrometresi kullanılarak toplu. her bir çiftin, R, 0, sonra ücretsiz PhotochemCAD kullanılarak hesaplanır ve NPS analizinde kullanılabilir. Ayrıca, boya moleküllerinin (zaman çözüldü) floresans, anizotropik mi bir polarizasyon (ve zaman) duyarlı flüoresan spektrometresi kullanılarak elde edilmesi. Bununla birlikte, hızlı-NPS için en önemli giriş parametreleri, toplam iç yansıma flüoresans mikroskobu (TIRFM) gibi tek moleküllü floresan mikroskopi kurulum ölçülen smFRET verimliliği vardır . Burada, smFRET verileri elde etmek ve Hızlı NPS (Şekil 1) uygulamak için bir adım adım protokol mevcut.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Akış odası hazırlama</td></tr><tr><td>Özelleştirilmiş metal numune tutucu</td><td>kendi kendine inşa</td><td>edilmiş n/a</td><td></td></tr><tr><td>kuvars cam slaytlar, 76&nbsp; mm x 26&nbsp; mm</td><td>Teknik Cam Ürünleri</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>lameller, 60 mm x 24&nbsp; mm</td><td>Marienfeld</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>deterjan, Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>Synergy UV</td><td>Millipore</td><td>2512600'den</td><td></td>ultra saf su</tr><tr><td>Zepto plazma temizleyici</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropil)-trietoksisilan, pa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>metoksi PEG-süksinimidil valerat, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>biyotinile edilmiş PEG-süksinimidil valerat, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum biyokarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum karbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sızdırmazlık filmi (Nescofilm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Esnek Silikon Boru, 0.8&nbsp; mm ID, 2.4&nbsp; mm OD</td><td>Saint-Gobain Performans Plastikleri</td><td>720958</td><td></td></tr><tr><td>İnce Delikli Polietilen Boru, 0,58 mm ID, 0,96 mm OD (Smiths Medikal)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Total iç yansıma floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Nd:YAG Lazer, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>diyot pompalı katı hal lazeri, 491 nm, Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>diyot lazer 643 nm, iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr><td>dikroik ayna, 532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>dikroik ayna, 476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr><td>akusto-optik ayarlanabilir filtre</td><td>AA Opto-Elektronik</td><td>AOTFnC-VIS</td><td></td></tr><tr><td>plano-dışbükey silindirik lens, f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>plano-içbükey silindirik, f = -300&nbsp; mm</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>prizma, PS 991</td><td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>odaklama lensi, f = 75&nbsp; mm</td><td>Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>şırınga pompası, PHD 2000</td><td>Harvard Aparatı</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 step motor, Z812B</td><td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>piezoelektrik aktüatör, PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>IR diyot lazer</td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>otofokus sisteminin bir parçası</td></tr><tr><td>dikroik ayna, 775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>konum algılama dedektörü (PSD), PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>otofokus sisteminin bir parçası</td></tr><tr><td>suya daldırma objektifi, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>dikroik ayna, 645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>emisyon yolu</td></tr><tr><td>emisyon filtresinin bir parçası, 3RD550-510</td><td>Omega Optik</td><td>3RD550-510</td><td>yeşil kanal girişi emisyon yolu</td></tr><tr><td>emisyon filtresi, 3RD660-760</td><td>Omega Optik</td><td>3RD660-760</td><td>emisyon yolu</td></tr><tr><td>EMCCD kamerasında kırmızı kanal, iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD kamera, iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>VE-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Çeşitli</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>UV-VIS spektrometresi</td></tr><tr><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td><td>floresan spektrometresi</td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>EM-CCD kamera için</td> <td>Andor</td><td></td> kontrol yazılımı</tr><tr><td>Apt kullanıcı yardımcı programı&nbsp; (V1.022)</td><td>Piezo motorlar için</td> <td>Thorlabs</td><td></td> kontrol yazılımı</tr><tr><td>Norland Optik Yapıştırıcı 68</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>yapıştırıcı</td></tr><tr><td>PC-AFN-0.8 Nil kırmızısı</td><td>Kisker Biotech</td><td></td><td>avidin kaplı floresan multispec boncuklar&nbsp;</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>custon yazılı yazılım için teknik hesaplama dili</td></tr><tr><td>Origin (V9.0)</td><td>Originlab</td><td></td><td>bilimsel grafik ve veri analizi yazılımı</td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>absorpsiyon küveti 1&nbsp; cm yol uzunluğu</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-251-15-40</td><td>floresan küvet, 3 mm yol uzunluğu</td></tr></tbody></table>

tek molekülün yapısal bilgiler hızlı nano konumlandırma sisteminin kullanılması deneyler fret

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Tek moleküllü Förster Rezonans Enerji Transferi (smFRET), biyomoleküler kompleksler hakkında gerçek zamanlı olarak yapısal bilgi elde etmek için kullanılabilir. Bu nedenle, trilaterasyon yoluyla bir protein kompleksi içinde bilinmeyen bir boya pozisyonunu lokalize etmek için çoklu smFRET ölçümleri kullanılır. Kantitatif bilgi elde etmek için, Nano Konumlandırma Sistemi (NPS), X-ışını kristalografisinden gelen yapısal bilgileri tek moleküllü floresan verileriyle birleştirmek için olasılıksal veri analizini kullanır ve yalnızca en olası konumu değil, aynı zamanda deneysel belirsizliği gösteren posterior olarak adlandırılan tam üç boyutlu olasılık dağılımını da hesaplar. Kavram, çok sayıda boya molekülü içeren smFRET ağlarının analizi için genelleştirildi. NPS'nin en son sürümü olan Fast-NPS, Markov Chain Monte Carlo örneklemesine ve büyük smFRET ağlarının nispeten kısa sürede analizine olanak tanıyan paralel tavlamaya dayalı Bayes parametre tahminini kullanan yeni bir algoritmaya sahiptir. Ayrıca, Fast-NPS, boya moleküllerinin yerel ortamları nedeniyle sergilediği farklı uzamsal ve yönelimsel davranışı hesaba katan her boya için beş farklı modelden birini seçerek posterior'un hesaplanmasına izin verir.
Burada smFRET verilerini elde etmek ve Fast-NPS'yi uygulamak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Fast-NPS'nin üç giriş parametresinin elde edilmesi için ayrıntılı talimatlar sunuyoruz: smFRET değerleri, ayrıca boya moleküllerinin kuantum verimi ve anizotropisi. Son zamanlarda, NPS, bir arkeal açık promotor kompleksinin mimarisini aydınlatmak için kullanılmıştır. Bu veriler, beş farklı boya modelinin posterior dağılım üzerindeki etkisini göstermek için kullanılır.

Transkripsiyon bütün organizmalarda gen ifadesi ilk adımdır. Archaea olarak, transkripsiyon, tek bir RNA polimeraz (rnap) tarafından yürütülmektedir. ökaryotlar ile karşılaştırıldığında, arke rnap basit bir transkripsiyonel makine yaparken kendi ökaryotik meslektaşları çarpıcı bir yapısal benzerlik taşımaktadır. Bu nedenle, Archaea, RNA polimeraz II (pol II), ökaryotik transkripsiyon inisiyasyon çalışmak için bir model sistem olarak kullanılır. Son zamanlarda, arke RNA polimeraz açık kompleksinin tam mimarisi, tek moleküllü FRET ve NPS tespit edilmiştir. NPS analiz veri transkripsiyon başlama mekanizması yararlı bilgiler sağlar tam arke açık yükseltici kompleksi, bir model oluşturmak için kullanıldı. Bu yapıyı aydınlatmak için smFRET verimlilikleri açık yükseltici com içinde yer alan bilinmeyen anten boya molekülleri arasında ölçüldüplex ve pozisyonları kristalografik yapıların (pdb-ID: 2WAQ) bilinmektedir rnap, beş referans sitelerinde dahil edildi bilinen çeşitli uydu boya molekülleri 37. Anten boyalar olmayan şablon DNA, Araç kullanmayın, TBP ve TFE farklı pozisyonların biri birine bağlanmıştır. Bu çalışmada kullanılan network 60'dan ölçülen uzaklığın oluşturmaktadır. Şekil 7 NPS analizi yapılmış tam arke açık yükseltici kompleksinin modelini göstermektedir. Bu çift sarmallı promoter DNA (açık ve koyu mavi), (gri) RNA Polimeraz ve transkripsiyon başlatma (mor) TBP faktörleri içermektedir, TFB (yeşil) ve TFE (sarı). Model, klasik bir model (A), ISO modeli (B) kullanılarak hesaplandı NPS analizi, güvenilir bir hacim, meanpos-izo modeli (C), var-meanpos-izo modelinden elde edilen sonuçlar ile üstüste bindirilmiştir (D) ve var-meanpos modeli (E). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg"> Şekil 1: Hızlı NPS hesaplanması için gerekli parametrelerin elde edilmesi ve işlenmesi iş akışı. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg"> Şekil 2: smFRET olayı örnek floresan yoğunluğu zaman iz. smFRET II: verici (yeşil) ve üç karakteristik faz, yani bir gösteren alıcı molekül (kırmızı) floresans yoğunlukları verici floresans alıcı ışıkla ağartma sonra III donör Photobleaching sonra eşiğe.g2large.jpg "target =" _ blank "&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg"> Şekil 3: smFRET deneyler için akış odasının şematik gösterimi. Akış odası akrilik cam tutucular ile özelleştirilmiş metal tutucu üzerine monte edilir. akış odasının sandviç tasarımı kuvars cam (erimiş silika) giriş ve çıkış boruları, bir sızdırmazlık filmi ve akış odası kapatan bir lamel bağlanması için iki delikli slayt oluşmaktadır. TIRF aydınlatma için prizma akış odasının alt yarısına üzerine monte edilir. Içi boş sekme vidalar akış odasına için giriş ve çıkışları sağlamak. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img> alt = "Şekil 4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" /&gt; Şekil 4: kuvars cam slayt ve conta filmin hazırlanması. (Milimetre verilen) deliklerin konumlarını gösteren kuvars cam slayt mekanik çizim. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg"> Şekil 5: akış odasının mekanik çizim. cam tutucular ve alüminyum montaj çerçevesi akrilik alüminyum prizma tutucu önlemler, milimetre olarak verilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> ŞEKIL 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/&gt; Şekil 6: smFRET deneyleri için kullanılan prizma tipi TIRF kurulum şematik gösterimi. Optik bileşenlerin kısaltmaları: A, diyafram; DM, dikroik ayna; F emisyon filtresi; L, lens; M, ayna; Objektif O; P, prizma; PSD, pozisyon duyarlı foto-diyot; S, örnek; PS, konumlandırma aşaması; T, teleskop. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg"> Şekil 7: Farklı model varsayımlarının Simülasyon sonuçları. Tüm resimler arke RNA polimeraz gösterir: birlikte geliştirici DNA (sırasıyla T-DNA ve mavi ntDNA ve mavi) için model ile (pdb-ID 2WAQ, üstten görünüm), TBP (mor), TFB (yeşil) ve TFE (sarı)arke karmaşık 30 açın. Güvenilir hacimleri (A) klasik modeli, (B) iso modeli, (C) meanpos-iso modeli, (D) var-meanpos-iso modeli ve (E) değişkenin NPS simülasyon sonuçları için üst üste -meanpos modeli. Tüm birimler% 68 güvenilirlik gösterilmektedir. Klasik ve var-meanpos ağları smFRET verileri ile uyumludur. Buna karşılık, bütün boyalar için iso, meanpos-iso veya var-meanpos-iso modeli seçilir ağlar ölçülen verilerle tutarsız. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

TIRF mikroskobu ile büyük verici-alıcı ağlardan smFRET verilerini elde etmek için kurulum ve deneysel prosedürü sunuyoruz. Bu ölçümlerin Bayes çıkarım yazılımı Fast-NPS ile adım adım analizi, uyarlanmış boya modellerinin uygulanması yoluyla yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler verir.

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

Hızlı Nano konumlandırma sisteminin genel amacı, tek moleküllü FRET deneylerini titiz istatistiksel analizlerle birleştirerek biyomoleküllerin gerçek zamanlı yapısal bilgilerini sağlamaktır. Bu yöntem, standart yapı biyolojisi araçlarının uygulanamadığı makromoleküllerdeki esnek alanların lokalizasyonu gibi yapısal biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlar. Hızlı NPS'nin diğer FRET tabanlı yapısal araçlara kıyasla en büyük iyileştirmesi, farklı boya modellerinin yalnızca en olası konumlar değil, aynı zamanda üç boyutlu bir olasılık dağılımı kullanılarak karşılaştırılabilmesidir.Bu tekniğin temel avantajı, protein veri tabanından gelen yapısal verileri kantitatif tek moleküllü floresan ölçümleriyle birleştirmesidir. Prosedüre başlamak için bir akış odası ve numune tutucu monte edin. Giriş ve çıkış vidalarını hazırlamak için, silikon boruyu içi boş tırnaklı vidalara geçirin ve boruyu her iki ucundan bir tıraş bıçağıyla düz bir şekilde kesin.Tırnak vidalarını numune tutucuya vidalayın. Akış odasının kuvars sürgülü deliklerini numune tutucu dişlerle hizalayın. Akış haznesini yerine sabitlemek için cam tutucu vidaları hafifçe sıkın.20 santimetre uzunluğundaki silikon boru parçalarını giriş ve çıkış vidalarına geçirin. Akış odasını 500 mikrolitre PBS ile yıkayın. Daha sonra akış odasını PBS'de 100 mikrolitre nötravidin çözeltisi ile yıkayın ve havanın numune odasına girmesini önlemek için giriş borusunun sonunda bir damlacık oluşmasını sağlayın.Akış odasından havayı çıkarmak için her manipülasyondan sonra giriş ve çıkış borusunu kapatın. Odayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Ardından, nötravidin çözeltisini 500 mikrolitre PBS ile yıkayın.Prizmanın üzerine bir damla daldırma yağı ekleyin ve prizmayı numune haznesine vidalayın. Tek moleküllü FRET verileri, toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanılarak elde edilir. Kamera yazılımını ve sahne piezo motor yazılımını başlatın.Odayı TIRF mikroskobunun mikrometre aşamasına yatay olarak, mümkün olduğunca düz ve üç lazeri de kesecek şekilde monte edin. Daldırma sıvısı ekleyin ve IR yansımalarını kontrol ederek mikroskop objektifine odaklanın. Kamera parametrelerini, dosya yolunu ve otomatik artış parametrelerini ayarlayın.Canlı kamera beslemesini başlatın ve üç lazeri de tam yoğunlukta kullanarak arka plan floresansını ağartın. Ardından, lazer yoğunluklarını azaltın. Ardından, hazneye 100 mikrolitre floresan boncuk çözeltisi yükleyin.Boncukların hazne yüzeyine yapışması için 10 dakika bekleyin. 50 ila 100 boncuk görüş alanına sahip bir film kaydedin ve yüksek tepe bulma eşiği ile toplu analiz gerçekleştirin. Film dosyasını yükleyin ve görüş alanının zıt köşelerinde farklı merkezlere sahip iki boncuk seçin.Bu boncuklardaki maksimum yoğunluktaki pikselleri seçin. Prizmayı çıkarın ve temizleyin. İkinci bir numune odası hazırlayın ve prizma tutucuyu hazneye vidalayın.Odayı mikrometre aşamasına monte edin. Ardından, 50 ila 100 pikomolar biyotinillenmiş floresan etiketli numune çözeltisinden 100 mikrolitre hazneye yükleyin. Moleküllerin oda yüzeyine bağlanmasını bekleyin.Kaydı başlatmak ve donör uyarma lazerini açmak için Sinyal Al'a aynı anda tıklayın. Görüş alanındaki moleküllerin en az% 80'inin ağartılmasını sağlamak için lazer gücünü ayarlayın, Ardından, ağartılmamış bir alanı göstermek için odayı hareket ettirin ve bir sonraki filmi kaydedin. Numune odasının geri kalanını bu şekilde ağartın.TIRF mikroskobundaki ölçümlerden sonra, elde edilen tek moleküllü FRET verilerinin, ortalama FRET verimliliğini elde etmek için analiz edilmesi gerekir. Numunenin donör ve alıcı filmlerinin toplu analizini yapın. Ardından, toplu film dosyalarını veri analiz yazılımına yükleyin.Bireysel FRET aşamalarını belirtmek için Seçilmedi düğmesine tıklayın. FRET döneminin başlangıcına, ardından beyazlatma nedeniyle alıcı yoğunluğunun azaldığı zaman noktasına ve son olarak ağartma nedeniyle donör yoğunluğunun azaldığı zaman noktasına tıklayın. Bir sonraki pencerede, seçilen FRET verimlilik izini korumak için Evet'i seçin.Her molekül analiz edildikten sonra, izleri kaydedin ve bir sonraki filmi analiz edin. Analiz tamamlandıktan sonra, FRET sonuçlarını birleştirmek için bir komut dosyası çalıştırın. Varsayılan giriş seçeneğini kullanarak birleştirilmiş çerçeve bazında FRET dosyasını veri analizi yazılımına aktarın.Verileri bir histogram olarak çizin ve bir Gauss'a sığdırmak için doğrusal olmayan eğri uydurma aracını kullanın. Aşan değer, ana FRET verimliliğidir. İzotropik Forster yarıçapını ve her boya için kararlı durum anizotropi değerlerini belirlemek için UV VIS ve floresan spektroskopisi kullanın.Nano konumlandırma sistemi, bilinmeyen bir konumu, anteni, bilinen birkaç konumla, uyduları lokalize ederken, iyi bilinen GPS'den ilham aldı. NPS analizine başlamak için FastNPS yazılımını başlatın ve yeni bir iş dosyası oluşturun. Etiketli antenlerin ve uyduların konum öncüllerini tanımlamak için, ModelDyePrior penceresinde, tanımlanan konumun uzamsal çözünürlüğünü girin.İlgili ortalanmış PDB dosyasını yükleyerek makromolekülün iç kısmını hariç tutun. Boya çapını ve iskeletleşme mesafesini girin. Olası boya konumunun minimum ve maksimum konum koordinatlarını doldurun.Tanımlanan konum bir uydu ise, esnek bağlayıcı aracılığıyla boya ekini seçin ve ortalanmış PDB dosyasından atom koordinatlarını girin. Bağlayıcının uzunluğunu ve çapını doldurun. Erişilebilir hacmi hesapla'ya tıklayın, önceki konumu kaydedin ve görselleştirme için dışa aktarın.Bu işlemi tüm uydular ve antenler için tekrarlayın. Pozisyonlar tanımlandıktan sonra, Ölçümü Tanımla penceresini açın ve yeni bir boya molekülü oluşturun. Bu boya ile ilişkilendirilmiş önceki konumu yükleyin.Floresan anizotropisini doldurun, uygun bir boya modeli seçin ve boyayı etkinleştirin. Tüm boyalar tanımlanana kadar bu işlemi tekrarlayın. Ardından, yeni bir ölçüm oluşturun.Tanımlanan boyalardan bir FRET çifti seçin. Hatalı tek moleküllü FRET verimliliğini ve bu boya çiftinin izotropik Forster yarıçapını girin ve ölçümü etkinleştirin. Bunu tüm boya çiftleri için tekrarlayın.Ardından, hesaplama penceresini açın. Boyalar farklı modellere atanmışsa, Kullanıcı Tanımlı'yı seçin. Aksi takdirde, tüm boyalar için kullanılacak modeli seçin.Hesaplamayı gerçekleştirin ve sonuçlar penceresini açın. FastNPS'yi kullanırken, elbette tutarlı kalırken güvenilir hacimleri en aza indirmek için modelleri tüm boyalar için uyarlamayı unutmamak önemlidir. Tutarlılık %90'dan düşükse, ayrıntılı tutarlılığı tıklayın ve %90'dan az tutarlılığa sahip girişler için ortak olan boyaları belirleyin.Ölçü Tanımla penceresini açın ve söz konusu boyanın modelini değiştirin. Hesaplamayı Kullanıcı Tanımlı modunda yeniden çalıştırın. Boyaların güvenilir hacimlerini tek tek veya toplu olarak dışa aktarın.Görselleştirme yazılımında yoğunluk dosyalarını açın ve güvenilirliği istenen seviyeye ayarlayın. Tek moleküllü FRET verimlilikleri, bilinmeyen anten molekülleri ile bir arkeal RNA polimeraz açık promotor kompleksi içindeki bilinen birkaç uydu molekülü arasında ölçüldü. Bu verilerin NPS analizi, arkeal RNA polimeraz açık promotor kompleksine göre bu boya moleküllerinin güvenilir hacimlerini belirledi.Boya moleküllerinin kullanıldığı beş farklı model incelenmiş ve sonuçlar karşılaştırılmıştır. Güvenilir hacimler, boyanın yalnızca bilinmeyen yönelimli bir koni içinde serbestçe dönebileceğini varsayan modellerle hesaplandığında ölçülen verilerle tutarlıydı. Özellikle klasik model, boyanın sabit bir yerde olduğunu varsaydığı için en muhafazakar olanıdır.Bu, nispeten büyük bir güvenilir hacim oluşturur, ancak hacim genellikle doğru pozisyonu kapsar. Daha yüksek hassasiyetli modeller, boyanın floresan ömrü boyunca dönme konusunda tamamen serbest olduğu varsayımını kullanır. ISO modeli, klasik model gibi, boyanın erişilebilir hacim içinde sabit bir konumda olduğunu varsayar.meanpos-iso modeli, tüm olası konumlar üzerinde dinamik ortalamayı varsayar. ISO modellerinin güvenilir hacimleri, iso olmayan modeller tarafından hesaplananlardan çok daha küçük olsa da, ölçülen verilerle tutarsızdır. Mevcut yapısal araçlar tarafından ele alınamayan bir sorun olan geçici komplekslerin dinamik yapısal bilgilerini yakalamamıza izin veren bir teknik geliştirmek istedik.Tek moleküllü FRET verileri kaydedildikten sonra, FastNPS analizi birkaç saat içinde yapılır ve farklı boya modellerinin hızlı bir şekilde karşılaştırılmasına olanak tanır. Bu prosedürü takiben, deneysel tek moleküllü FRET verileriyle tutarlı yapılandırılmış modeller elde etmek için MD simülasyonları gibi diğer yöntemler daha sonra gerçekleştirilebilir.

structural-information-from-single-molecule-fret-experiments-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Biz elektron mikrograflarında fluoresan ışığı ile işaretlenmiş proteinler yerelleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Floresans ilk ince kesitler üzerinde fotoğraf ile aktive localisation mikroskopi kullanılarak yerelleştirilmiştir. Bu görüntüler daha sonra aynı bölümde elektron mikroskop ile hizalanır.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Tek flüoroforlar FIONA'sı kullanarak nanometre hassasiyetle lokalize edilebilir. Burada FIONA tekniğin bir özet bilgi ve nasıl Fiona deneyleri tarif edilir.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak bir protein fotoreseptörünün yapısını araştırmak için bir yöntem bu yazıda açıklanmıştır. PeakForce Kantitatif Nanomekanik Özellik Haritalama (PF-QNM), mika yüzeyindeki bozulmamış protein dimerlerini ortaya çıkarır.

PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu

Çok çeşitli tek molekülleri kovalent olarak bir AFM ucuna bağlamak için bir protokol sunulmuştur. Bu moleküllerin katı mesnetler ve biyo-arayüzler üzerindeki yapışma kuvvetini ve serbest enerjisini belirlemek için prosedürler ve örnekler verilmiştir.

Atomik Kuvvet Spektroskopi Tek Molekül Yapışma incelenmesi

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

İnşaat ve gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskop izleme Nano floresan yetenekli probları yüksek diffusive hızları ve düşük foton sayısı oranları bu protokolü ayrıntıları.

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein'deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Bu makalede, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak mobil, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) tabanlı probların mekansal analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Yeni geliştirilen yazılım araç seti, doğru FRET verimliliği ve moleküler konumlar da dahil olmak üzere hareketli probların smFRET zaman izlerinin zamanın işlevleri olarak belirlenmesini sağlar.

Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Bu protokol, üç boyutlu çok polimerik numunelerin karakterizasyonunda fototermal nano ölçekli kızılötesi spektroskopinin performansını değerlendirmek için atomik kuvvet mikroskobu ve nano ölçekli kızılötesi spektroskopinin uygulanmasını açıklar.

Çok Fazlı Polimerik Sistemleri Keşfetmek için Nano Ölçekli Kızılötesi Spektroskopideki Gelişmeler

Öğrenin tek molekül FRET deneyleriyle biyomoleküllerin yapısal analizini TIRF mikroskobu ve Bayes çıkarım yazılımı kullanarak gerçekleştirmeyi. Bu yöntem esnek alanların lokalizasyonunu sağlar.

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Daha fazla video keşfet