Hücrelerin ultra hızlı Mıknatıslanma için katyonize Magnetoferritin sentezi

Bu yöntemin genel amacı, bir protein kafesi içinde manyetik bir nanoparçacık sentezlemek ve ardından proteini, manyetik nanoparçacığın hücrelere hızlıca bağlanmasını sağlayacak şekilde fonksiyonelleştirmektir. Bu yöntem, MRI veya manyetik hücre ayırma gibi uygulamalar için önemli olan, hücrelerin hızlı ve etkili manyetik etiketlemesini sağlayan manyetik nanoparçacıklar üretmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücre mıknatıslamasının düşük nanoparçacık konsantrasyonları ve kısa inkübasyon süreleri kullanılarak gerçekleştirilebilmesiyle, nanoparçacık maruziyetine bağlı olası yan etkilerin önlenmesidir.

Başlamak için, azot gazı silindirine bağlı bir tüpü suyun içine yerleştirip kabı streç filmle kapatarak 500 mililitre deiyonize suyun oksijensizleştirilmesini sağlayın. Ardından, yaklaşık 60 dakika boyunca azot gazı kabarcıkları gönderin. Çift cidarlı reaksiyon kabına bağlı su banyosunu 65 °C'ye ısıtın.

Ardından, reaksiyon kabına 75 mililitre 50 milimolar HEPES tamponu (pH 8,6) ekleyin. Kabı kapatın ve yaklaşık 20 dakika boyunca tampon çözeltisi içinden azot gazı kabarcıkları geçirerek oksijensiz hale getirin. Aynı zamanda, tampon çözeltisini bir manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırın.

HEPES tampon çözeltisindeki oksijen uzaklaştırıldıktan sonra, azot atmosferini korumak için azot tüpünü çözeltinin üzerinde asılı tutarak tampondan çıkarın. Nihai konsantrasyon 3 mg/mL olacak şekilde apoferritin ekleyin. Manyetik karıştırmaya devam edin, ancak köpürme meydana gelirse karıştırma hızını düşürün.

Magnetoferritin sentezi için, iki şırınga pompası kullanarak 10,1 mililitre demir-kobalt öncülünü ve 10,1 mililitre hidrojen peroksiti, dakikada 0,15 mililitre akış hızıyla apoferritin çözeltisine eş zamanlı olarak enjekte edin. Sentez adımlarına metin protokolünde açıklandığı şekilde devam edin. Ardından, örneği dakikada 10 mililitre akış hızında bir peristaltik pompa kullanarak katyonik bir matris içeren kolona yükleyin.

Kolonu, gradyan pompası kullanarak 10 mililitre/dakika akış hızında yaklaşık 100 mililitre akış tamponu ile yıkayın. Proteini elüe etmek için kolonu, 10 mililitre/dakika hızında, artan konsantrasyonlarda sodyum klorür ve tris tamponu içeren 150 mililitre çözelti ile yıkayın. Protein 500 milimolar sodyum klorür konsantrasyonunda elüe olduğunda, otomatik bir fraksiyon toplayıcı kullanarak 50 mililitrelik fraksiyonlar halinde toplayın.

150 mililitre magnetoferritini, önce 15 mililitrelik bir santrifüj filtre ünitesi, ardından 4 mililitrelik bir hacim ünitesi kullanarak yaklaşık iki mililitre hacme konsantre edin. Bu prosedürün ayrıntılı protokolü için santrifüj filtre ünitelerinin üretici talimatlarına bakın. Ardından, konsantre edilmiş örneği bir enjeksiyon döngüsü kullanarak jel filtrasyon kolonuna yükleyin.

Kolonu 1,3 mililitre/dakika akış hızında çalışan tamponla yıkayın. Otomatik bir fraksiyon toplayıcı kullanarak altı mililitrelik fraksiyonlar toplayın. Protein monomerleri en son elüe olur.

Bu aşamada, saflaştırılmış magnetoferritin, katyonizasyona kadar dört santigrat derecede saklanabilir. 10 miligram magnetoferritin için 374 miligram DMPA tartın ve 2,5 mililitre 200 milimolar MES tamponu içerisinde çözün. Konsantre hidroklorik asit kullanarak çözeltinin pH değerini yaklaşık yediye ayarlayın.

DMPA çözeltisinin pH değeri hidroklorik asit ile ayarlanırken toksik dumanlar açığa çıkar. Bu maddelerin mutlaka bir çeker ocak içerisinde kullanıldığından emin olun. Mililitre başına dört miligram konsantrasyonda 2.5 mililitre magnetoferritin çözeltisi ekleyin.

Bir manyetik karıştırıcı ekleyin ve dengelemek için iki saat boyunca karıştırın. Çözeltiyi pH 5.0'a ayarladıktan sonra, DMPA manyetoferritin çözeltisine 141 miligram EDC tozu ekleyin. Karıştırma işlemine üç buçuk saat boyunca devam edin.

Çökelekleri gidermek için solüsyonu 0,22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün ve proteini metin protokolünde açıklandığı şekilde diyalize edin. hMSC'leri metin protokolünde açıklandığı şekilde kültüre edin. Plakaya ekilen hücreleri iki mililitre oda sıcaklığında PBS ile yıkayın.

Ardından, istenen süre boyunca inkübe etmeden önce, plakalanmış hücrelere bir mililitre sterilize edilmiş katyonize magnetoferritin çözeltisi ekleyin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve ardından 0,5 mililitre Trypsin-EDTA ekleyip 37 °C'de beş dakika inkübe ederek onları toplayın. Trypsin EDTA'yı inaktive etmek için bir mililitre kültür ortamı ekledikten sonra, çözeltiyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 524 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücre peletini 0,5 mililitre manyetik ayırma tamponunda yeniden süspande edin.

Ardından, mıknatısı çoklu standa sabitleyin ve mıknatısa bir manyetik ayırma kolonu ekleyin. Kolonun üzerine bir ön ayırma filtresi yerleştirin. Daha sonra, ön ayırma filtresine 0,5 milliliters manyetik ayırma tamponu ekleyin ve filtre ile kolonu yıkamak için sıvının her ikisinden de geçmesini sağlayın.

Ardından, kolonun altına 15 mililitrelik bir santrifüj tüpü yerleştirin ve manyetik ayırma kolonunun filtre rezervuarına 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Rezervuar boşaldığında, 0,5 mililitre manyetik ayırma tamponu ekleyin. Rezervuar tekrar boşaldığında, 0,5 mililitre daha manyetik ayırma tamponu ekleyin.

Yıkama işlemini, toplam 1.5 mililitre manyetik ayırma tamponu olacak şekilde bir kez daha tekrarlayın. Bu yıkama adımı, manyetize olmamış tüm hücreleri kolondan uzaklaştırır. Kolonu mıknatıstan çıkarın ve yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne yerleştirin.

Ardından, filtreyi kolon rezervuarından çıkarın. Rezervuara 1 milliliter manyetik ayırma tamponu ekleyin ve üretici tarafından sağlanan pistonu kullanarak tamponu hemen kolonun içinden geçirin. Bu işlem, mıknatıslanmış hücreleri kolondan santrifüj tüpüne elüe eder.

Metin protokolünde açıklandığı şekilde demir miktar belirleme işlemine geçiniz. Negatif boyalı magnetoferritin örneklerinin transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri, nanopartiküllerin protein kafesinin içinde oluştuğunu göstermiştir. Zeta potansiyel ölçümleri, magnetoferritinin katyonizasyon sonrası pozitif bir yüzey yükü kazandığını doğrulamaktadır.

İnsan mezenkimal kök hücrelerinin bir dakika boyunca katyonize magnetoferritine maruz bırakılması, hücre popülasyonunun %92'sinin mıknatıslanmasıyla ve hücre başına 3,6 pikogram demir iletimiyle sonuçlanmıştır. İnkübasyon süresinin 15 dakikaya çıkarılması, tüm hücre popülasyonunun mıknatıslanmasıyla sonuçlanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, protein çözeltisine metal tuzu öncüllerini sırayla ekleyerek apoferritin boşluğu içinde bir manyetik nanoparçacığın nasıl sentezleneceği konusunda bilgi sahibi olmalısınız.

Ardından, TMPA eşleşmesi kullanarak proteinin kimyasal olarak nasıl katyonize edileceği anlatılacaktır. Bu süreçte uzmanlaşıldığında, magnetoferritin sentezi, saflaştırılması ve katyonizasyonu, düzgün bir şekilde yürütüldüğü takdirde üç gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, oksijen kontaminasyonundan kaçınmak ve magnetoferritin sentezi boyunca doğru sıcaklık ile pH değerlerini korumak önemlidir.

Bu prosedürün ardından, kuantum noktaları veya terapötik ajanlar gibi diğer kargolar, bu malzemelerin hücrelere daha verimli bir şekilde iletilmesini sağlamak amacıyla katyonize apoferritin kafesi içine kapsüllenerek yerleştirilebilir. Bu teknik, manyetik hücre manipülasyonu alanındaki araştırmacıların, nanopartikül alımı düşük olan veya uzun süreli nanopartikül maruziyetine ya da yüksek nanopartikül konsantrasyonlarına karşı çok hassas olan hücrelerde manyetik etiketlemeyi keşfetmelerine yol açabilir.