Hücrelerin ultra hızlı Mıknatıslanma için katyonize Magnetoferritin sentezi

Bu yöntemin genel amacı, bir protein kafesi içinde bir manyetik nanoparçacığı sentezlemek ve daha sonra proteini, manyetik nanoparçacığın hücrelere hızlı bir şekilde bağlanmasını sağlayacak şekilde işlevsel hale getirmektir. Bu yöntem, MRI veya manyetik hücre ayırma gibi uygulamalar için önemli olan hücrelerin hızlı ve verimli manyetik etiketlenmesini sağlayan manyetik nanopartiküller üretmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hücre manyetizasyonunun düşük nanopartikül konsantrasyonları ve kısa inkübasyon süreleri kullanılarak elde edilebilmesidir, bu da nanopartikül maruziyetinden kaynaklanan potansiyel olumsuz etkileri önler.

Başlamak için, bir nitrojen gazı silindirine bağlı bir tüpü suya yerleştirerek ve kabı streç filmle kapatarak 500 mililitre deiyonize suyun oksijenini giderin. Ardından, nitrojen gazını yaklaşık 60 dakika boyunca kabarcıklandırın. Çift cidarlı reaksiyon kabına bağlı bir su banyosunu 65 santigrat dereceye ısıtın.

Daha sonra, reaksiyon kabına 75 mililitre 50 milimolar HEPES tamponu, pH 8.6 ekleyin. Kabı kapatın ve nitrojen gazını tampon çözeltisinden yaklaşık 20 dakika köpürterek oksijenden arındırın. Aynı zamanda, tampon çözeltisini manyetik bir karıştırıcı kullanarak karıştırın.

HEPES tampon çözeltisinin oksijenini giderdikten sonra, nitrojen tüpünü tampondan çıkarın ve bir nitrojen atmosferi sağlamak için çözelti üzerinde asılı tutun. Mililitre başına 3 miligramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için apoferritin ekleyin. Manyetik karıştırmaya devam edin, ancak köpürme meydana gelirse karıştırma hızını azaltın.

Manyetoferritin sentezi için, dakikada 0.15 mililitre akış hızında apoferritin çözeltisine aynı anda 10.1 mililitre demir-kobalt öncüsü ve 10.1 mililitre hidrojen peroksit enjekte etmek için iki şırınga pompası kullanın. Metin protokolünde açıklandığı gibi sentez adımlarıyla devam edin. Ardından, numuneyi dakikada 10 mililitre akış hızında peristaltik bir pompa kullanarak katyonik bir matris içeren bir kolona yükleyin.

Dakikada 10 mililitre akış hızında bir gradyan pompası kullanarak sütunu yaklaşık 100 mililitre çalışma tamponu ile yıkayın. Proteini çıkarmak için, sütunu dakikada 10 mililitrede 150 mililitre artan konsantrasyonlarda sodyum klorür ve tris tamponu ile yıkayın. Protein, 500 milimolar sodyum klorür konsantrasyonunda ortaya çıkarken, otomatik bir fraksiyon toplayıcı kullanarak 50 mililitrelik fraksiyonlar halinde toplayın.

150 mililitre manyetoferritini, 15 mililitrelik bir santrifüj filtre ünitesi ve ardından dört mililitrelik bir hacim birimi kullanarak yaklaşık iki mililitrelik bir hacme konsantre edin. Bu prosedürün ayrıntılı bir protokolü için santrifüj filtre ünitelerinin üreticisinin talimatlarına bakın. Ardından, konsantre numuneyi bir enjeksiyon döngüsü kullanarak bir jel filtrasyon kolonuna yükleyin.

Sütunu dakikada 1,3 mililitre akış hızında çalışan tamponla yıkayın. Otomatik bir kesir toplayıcı kullanarak altı mililitrelik kesirler toplayın. Protein monomerleri en son elüte olur.

Bu noktada, saflaştırılmış manyetoferritin, katyonizasyona kadar dört santigrat derecede saklanabilir. 10 miligram manyetoferritin için, 374 miligram DMPA tartın ve 2.5 mililitre 200 milimolar MES tamponunda çözün. Konsantre hidroklorik asit kullanarak çözelti pH'ını yaklaşık yediye ayarlayın.

DMPA çözeltisinin pH'ını hidroklorik asit ile ayarladığınızda zehirli dumanlar açığa çıkar. Bu malzemeleri çeker ocakta kullandığınızdan emin olun. Mililitre başına dört miligramda 2.5 mililitre manyetoferritin çözeltisi ekleyin.

Manyetik bir karıştırıcı ekleyin ve dengelemek için iki saat karıştırın. Çözeltiyi pH 5.0'a ayarladıktan sonra, DMPA manyetoferritin çözeltisine 141 miligram EDC tozu ekleyin. Üç buçuk saat karıştırmaya devam edin.

Herhangi bir çökeltiyi gidermek ve proteini metin protokolünde açıklandığı gibi diyalize etmek için çözeltiyi 0.22 mikronluk bir şırınga filtresinden süzün. Metin protokolünde açıklandığı gibi kültür hMSC'leri. Kaplanmış hücreleri iki mililitre oda sıcaklığında PBS ile yıkayın.

Daha sonra, istenen süre boyunca inkübe etmeden önce kaplanmış hücrelere bir mililitre sterilize katyonlaştırılmış manyetoferritin çözeltisi ekleyin. Hücreleri PBS ile yıkayın ve daha sonra 0.5 mililitre Tripsin-EDTA ekleyerek ve 37 santigrat derecede beş dakika inkübe ederek hasat edin. Tripsin EDTA'yı inaktive etmek için bir mililitre kültür ortamı ekledikten sonra, çözeltiyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 524 kez G'de beş dakika santrifüjleyin

Ardından, mıknatısı çoklu standa takın ve mıknatısa manyetik bir ayırma sütunu ekleyin. Sütuna bir ön ayırma filtresi yerleştirin. Ardından, ön ayırma filtresine 0,5 mililitre manyetik ayırma tamponu ekleyin ve yıkamak için hem filtreden hem de kolondan geçmesine izin verin.

Daha sonra, kolonun altına 15 mililitrelik bir santrifüj tüpü yerleştirin ve manyetik ayırma kolonunun filtre haznesine 0,5 mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Rezervuar boşaldığında, 0,5 mililitre manyetik ayırma tamponu ekleyin. Rezervuar tekrar boşaldığında, 0,5 mililitre daha manyetik ayırma tamponu ekleyin.

Toplam 1,5 mililitre manyetik ayırma tamponu hacmi için yıkamayı bir kez daha tekrarlayın. Bu yıkama adımı, manyetize olmayan tüm hücreleri kolondan çıkarır. Kolonu mıknatıstan çıkarın ve 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne yerleştirin.

Ardından, filtreyi sütun rezervuarından çıkarın. Rezervuara 1 mililitre manyetik ayırma tamponu ekleyin ve üretici tarafından sağlanan pistonu kullanarak hemen kolondan itin. Bu, manyetize hücreleri kolondan santrifüj tüpüne çıkarır.

Metin protokolünde açıklandığı gibi demir miktar tayini yapmaya devam edin. Negatif lekeli manyetoferritin örneklerinin transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri, nanopartiküllerin protein kafesinin içinde oluştuğunu gösterdi. Zeta potansiyeli ölçümleri, manyetoferritinin katyonizasyondan sonra pozitif bir yüzey yükü elde ettiğini doğrular.

İnsan mezenkimal kök hücrelerinin bir dakika boyunca katyonize manyetoferritine maruz bırakılması, hücre popülasyonunun% 92'sinin manyetizasyonuna ve hücre başına 3.6 pikogram demir verilmesine neden oldu. Kuluçka süresinin 15 dakikaya çıkarılması, tüm hücre popülasyonunun manyetizasyonu ile sonuçlandı. Bu videoyu izledikten sonra, protein çözeltisine sırayla metal tuzu öncüleri ekleyerek apoferritin boşluğu içinde bir manyetik nanopartikülün nasıl sentezleneceğini anlamış olmalısınız.

Ve sonra, TMPA kuplajı kullanılarak proteinin kimyasal olarak nasıl katyonlaştırılacağı. Bir kez ustalaştıktan sonra, manyetoferritin sentezi, saflaştırılması ve katyonizasyonu, uygun şekilde yapılırsa üç gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, oksijen kontaminasyonundan kaçınmak ve manyetoferritin sentezi boyunca doğru sıcaklık ve pH'ı korumak önemlidir.

Bu prosedürden sonra, kuantum noktaları veya terapötik ajanlar gibi diğer kargolar, bu malzemelerin hücrelere daha verimli bir şekilde verilmesini sağlamak için katyonlaştırılmış apoferritin kafesi içinde kapsüllenebilir. Bu teknik, manyetik hücre manipülasyonu alanındaki araştırmacıların, nanopartiküllerin zayıf alımını sergileyen veya uzun süreli nanopartikül maruziyetine veya yüksek nanopartikül konsantrasyonlarına karşı çok hassas olan hücrelerde manyetik etiketlemeyi keşfetmelerinin yolunu açabilir.