Name: Bir UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmunoassay Platformu imalatı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Öğrenin, UV-Vis ve Raman spektroskopisi kullanarak altın nanopartikül tabanlı özelleştirilebilir bir immunoassay platformunun nasıl geliştirileceğini. Bu yöntem, antijen tespiti ve nanomalzeme fonksiyonelleştirme süreçlerini optimize eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Utah Eyalet Üniversitesi'nden bir Araştırma Katalizörü Ödülü ile desteklenmiştir. Yazarlar katkılarından dolayı Annelise Dykes, Cameron Zabriskie ve Donald Wooley'e teşekkür eder.

Tamponlar 1. Hazırlık <ol><li> Fosfat tamponlu tuz (PBS) <ol><li> 1x PBS konsantrasyonu yapmak için, 450 ml HPLC dereceli su ile 10 kat PBS 50 ml seyreltilir. Steril filtre 0.22 um filtre ile çözeltisi. </li><li> oda sıcaklığında saklayın çözüm. </li></ol></li><li> Tris Tamponlu Tuzlu Su + Tween 20 (TBST) hazırlanması <ol><li> 1x konsantrasyonunu yapmak için, 450 ml HPLC dereceli su ile 10x Tris tamponlu tuz (TBS), 50 ml seyreltilir. Tween-20% 0.05 (h / h) Tween-20, 250 ul ekle. Steril filtre 0.22 um filtre ile çözeltisi. </li><li> Oda sıcaklığında saklayınız. </li></ol></li><li> Insan serum albümini hazırlanması (HSA) Bloklama çözeltisi, <ol><li> HSA çözeltisi ağırlık / hacim% 3 olmak üzere steril filtre edildi 1x PBS 15 ml HSA 0.45 g tartılır. HSA kadar Vortex çözüm tamamen çözülür. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın HSA çözüm. Not: Sığır Serum Albümini(BSA), bir bloklama çözeltisi olarak kullanılabilir. </li></ol></li><li> PEG&#39;lenmiş antikorun hazırlanması (PEG-Ab) çözeltisi Not: antikor çözeltisi bağlanma yerleri N-hidroksi-(NHS) için rekabet ederek konjugasyon reaksiyonlara müdahale böyle BSA gibi taşıyıcı veya stabilize proteinler, bağımsız olmalıdır. Antikor bir Tris veya glisin tampon çözeltisi içinde gelirse, NHS konjügasyon reaksiyonu engellemeyen aminlerin ya da amonyum tuzlan önlemek için bir tampon değişimi geçmesi gerekir. antikor, bir liyofilize formda ise, 1-10 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda, üreticinin tavsiyesine göre yeniden süspanse edilebilir. <ol><li> Tris veya glisin tampon içinde antikorlarla, bir tuz giderme kolonu kullanılarak, 100 mM sodyum bikarbonat tampon değişimi. Konjugasyon reaksiyonu hızlandırmak için yaklaşık 8.5&#39;a pH değerini yükseltmek için, 100 mM tampon kullanın. </li><li> 100 mm s olan hidrat orto-piridil disülfür, PEG-NHS (OPSS-PEG-NHS)1 mg / ml veya daha büyük bir konsantrasyonda kullanıldıklarında, 1 ml &#39;lik bir hacme kadar, sodyum bikarbonat. Not: OPSS-PEG-NHS taze ve yaklaşık 20 dakika içinde kullanılmalıdır. OPSS-PEG-NHS NHS grubu pH 8.5&#39;te, bir sulu çözelti içinde, yaklaşık 20 dakikalık bir yarı ömre sahiptir. </li><li> 1 oranında (PEG: antikoru) 2 antikor çözeltisine OPSS-PEG-NHS ekleme konjügasyon oranı test numuneleri için kullanılır. kontrol için kullanılacak 1 konjügasyon oranı: Ayrı bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir 2 antijen çözeltisine OPSS-PEG-NHS ilave edin. Not 2: 1 oranında bir% 50 birleşme etkinliğinin üstlenmektedir. Hedef Bir PEG zincirinin her antikorunu etiketlemek için. Bu adımda, aşırı etiketleme altında etiketleme daha iyidir. OPSS-PEG-NHS ve antikor çözeltisi, uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklem kullanarak: <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_2.jpg" /> V hacmidir, Cı molekülleri ya da ifade edilen konsantrasyondurml başına antikorlarının verilmesinin. İndisler PEG ve Ab sırasıyla OPSS-PEG-NHS ve antikor bulunmaktadır. Nihai hacim, yaklaşık 250 ul olmalıdır. </li><li> 8 saat veya gece boyunca 4 ° C &#39;de, PEG-Ab çözelti inkübe edin. donma ve erime döngülerinde sınırı ve düşük bağlama tüpler kullanımı emin olmak için, -20 ° C &#39;de yaklaşık 25 ul hacimde çalışan saklayın çözeltisi. </li></ol></li></ol> 2. hazırlayın UV-Vis / Raman Sondalar <ol><li> Çıplak AuNP çözüm hazırlayın <ol><li> Ml başına yaklaşık olarak 1 x 10 11 parçacıkların bir konsantrasyon ile AuNPs bir 2 mi çözelti hazırlayın. <ol><li> AuNPs konsantre gerekiyorsa, 20 dakika veya süpernatant netleşene kadar 5.000 xg&#39;de 2.000 Stokta AuNP ul ve santrifüj ile düşük bağlanma santrifüj tüpleri doldurmak. AuNP pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak, pipetleme süpernatantı. </li><li> bir tüp içine kalan AuNP çözümleri birleştirin ve konsantrasyonunun tahminUV-Vis ölçümü elde etmek ve bu doğrusal bir ilişki olarak bilinen konsantrasyonlarda değerleri karşılaştırarak yon. </li></ol></li></ol></li><li> Uygun Raman muhabiri etiketleme oranını belirlemek <ol><li> metanol içinde çözülmüş Raman raportör bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Bu konsantrasyon kullanılan muhabiri bağlı olacaktır. Bu çalışmada, 200 uM&#39;lik bir çalışma çözeltisi olarak 3,3-diethylthiatricarbocyanine iyodür (DTTC) hazırlanması. </li><li> Her bir kuyu için 100 ul nihai bir hacim varsayarak, Raman raportör 0.2 uM ila 10 uM konsantrasyonu aralığında olacak şekilde 96 oyuklu bir plakanın birinci sırasındaki her çukuruna çalışma raportör çözeltisi kadar ekleyin. hacmi 80 uL olduğu her bir tür için yeterli HPLC dereceli su ilave edilir. Her bir hazne, 100 ul&#39;lik bir son hacim de yapma AuNP 20 ul ekle. Bir örnek, Tablo 1 &#39;de verilmektedir. </li><li> UV-Vis spektrumları 400 ila ölçünBir plaka okuma UV-Vis spektrofotometre kullanılarak 700 nm. uygun bir konsantrasyon, UV-Vis spektrumu için tanımlanan tepe en yüksek konsantrasyondur. AuNPs Raman gazetecilere en yüksek konsantrasyon oranına kadar Artan konsantrasyonlarda adımı yineleyin 2.2.2 bulunmuştur. NOT: boya ve AuNP şekli, boyutu ve üretici uygun konsantrasyonunu etkiler. Bu nedenle, sıralanan adımlar kullanılan bileşenlere bağlı olarak değerlendirilir ve değiştirilmesi gerekir. Bu protokol, pozitif yüklü bir boya kullanımını kapsamıştır. Bu nedenle, AuNP ve raportör arasındaki bağlanma negatif yüklü AuNPs kullanılarak geliştirilmiştir. Bu sitrat şapkalı AuNPs kullanılarak yapıldı. Daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın. </li></ol></li><li> Raman muhabiri ve PEG-Ab Binding AuNP için <ol><li> Raman raportör oda sıcaklığında 30 dakika boyunca AuNPs bağlanmasına izin önceden belirlenmiş konsantrasyonda AuNP ve Raman raportör iki 1.5 mi toplu hazırlayın.</li><li> parçacıklara antikor: 1 oranını 200 oluşturmak için AuNP ve Raman raportör çözeltisinin bir toplu PEG&#39;lenmiş antikoru (PEG-Ab) ekleyin. Bu çözelti, test numuneleri için olacaktır. kontrol olarak kullanılmak üzere taneciklerin antikorun: 1 oranında ayrı bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir 200 AuNP ve Raman raportör çözümün diğer toplu PEG&#39;lenmiş antijeni ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika için çözümler inkübe edin. NOT: parçacıklara antikorların oranı AuNPs özgü ve kullanılan boya ve her durum için optimize edilmelidir olacaktır. AuNP probları partiküllerin toplanmasını önler bağlanma burada amaç antikorların en yüksek orana sahip olmaktır. Birlikte eklemek için uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_200.jpg" /> V hacmidir, Cı ml başına parçacıklar veya antikorlar olarak ifade konsantrasyondur. yüzgeçark hacmi yaklaşık 1.5 ml olmalıdır. </li></ol></li><li> Blok mPEG-SH ile AuNP yüzeyde siteleri kalan. <ol><li> su kullanarak bir 200 uM konsantrasyonuna katı metoksi polietilen glikol tiyol eriterek mPEG-SH hazırlayın. mPEG-SH tamamen eriyene kadar çözelti vorteksleyin. </li><li> Adım 2.3 yapılan AuNP-PEG-Ab çözüm: 1 oranında bir 40.000 mPEG-SH ekleyin. Altın nanopartikül kalan kısımlar bloke edilmiştir sağlamak için 10 dakika boyunca oda sıcaklığında çözelti inkübe edin. Birlikte eklemek için uygun hacimleri belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın: <img alt="denklem" src="/files/ftp_upload/54795/54795eq_40000.jpg" /> V hacmidir, Cı ml başına parçacıklar veya antikorlar olarak ifade konsantrasyondur. Nihai hacmi, yaklaşık 1.5 ml olmalıdır. </li></ol></li><li> Fonksiyonalize Raman probları kurtarın. <ol><li> Düşük bağlama c 20 dakika boyunca 5.000 xg&#39;de santrifüj parçacıklarentrifuge tüpler veya süpernatant netleşene kadar. AuNPs rahatsız etmemek için dikkatli olmak pipetleme süpernatantı. </li><li> Daha önce yapılan 1x PBS çözeltisi 1 ml parçacıklar yeniden süspanse edin. çözeltisi (3 uL), küçük bir hacim içinde bir UV ölçümü alınarak AuNP konsantrasyonu hesabının ve bilinen AuNP konsantrasyonundan ölçümlere karşılaştırın. Nihai çözüm ml başına en az 1 x 10 11 parçacıklar olacak şekilde ses seviyesini ayarlayın. </li><li> 4 ° C&#39;de saklayın çözümleri immunoassay plaka işlevselleştirilmesi için kullanılan kadar. bir hafta içinde çözümleri kullanın. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Hacimler her bileşenin eklemek için (mi) </td></tr><tr><td> DTTC nihai konsantrasyon (mM) </td><td> DTTC çalışma çözeltisi (200 mM) </td><td> AuNP </td><td> Su </td></tr><tr><td> 0.2 </td&gt; <td> 0.1 </td><td> 20 </td><td> 79.9 </td></tr><tr><td> 0.6 </td><td> 0.3 </td><td> 20 </td><td> 79.7 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0.5 </td><td> 20 </td><td> 79.5 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1.0 </td><td> 20 </td><td> 79 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 2.5 </td><td> 20 </td><td> 77.5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 3.5 </td><td> 20 </td><td> 76.5 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 5.0 </td><td> 20 </td><td> 75 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. DTTC seyreltme, örneğin. DTTC çeşitli seyreltileri ve stok DTTC altın nano partıküler çözeltisi ve su ilişkili hacimleri. 3. İmmunoassay Plaka Hazırlama <ol><li> Bağışıklık plakasının istenen antijeni bağlayan. <ol><li> polistiren kuyu doldurmak için yeterli seyreltilmiş antijen (50 ug / ml) hazırlayın. , Çözüm vortekshemen plaka oyuklarına solüsyonu ekleyin. Antijen, oda sıcaklığında 1 saat boyunca plakaları bağlanmasına izin verir. </li></ol></li><li> Ilişkisiz antijenleri yıkayın. <ol><li> Bir bertaraf kabına çözüm damping ve bir kağıt havlu kaplı masa karşı plaka vurarak aşırı antijen çözüm çıkarın. </li><li> daha önce belirtildiği gibi aynı şekilde yıkama daha sonra yüzey yıkama kaldırmak için oyuklara TBST ilave edin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li></ol></li><li> Blok spesifik olmayan önlemek için plaka bağlama bölgeleri. <ol><li> plakanın her oyuğuna HSA engelleme çözeltisi 70 ul ilave edin ve 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Çıkarın ve adım 3.2 &#39;de belirtildiği gibi aynı prosedürü kullanarak plaka yıkayın. Daha fazla kullanım için hazır olana kadar 4 ° C&#39;de plaka ve saklamak kuru örtün. </li></ol></li><li> Immunoassay plaka işlevselleştirmek. <ol><li> T 70 ul ekleBir 96-yuvalı plakanın birinci sütuna Bölüm 2&#39;de hazırlanan nano-tanecikleri prob ve 1 ile daha sonra sütun seyreltik: 2 dizi dilüsyon. Plaka, en az 1 saat boyunca inkübe izin verin. Immünolojik plaka hazırlanması için nasıl bir örneği Şekil 3&#39;te verilmiştir. </li><li> uygun AuNPs imha etme emin adımlar 3.2 detaylı olarak TBST ile beş kez plaka yıkayın. Son yıkamadan sonra her bir göze 1x PBS 70 ul ve bir plaka conta ile kapak. NOT: Kontrol numuneleri açık olmalıdır. Spesifik olmayan bağlanma, söz konusu ise, kontrol numuneleri test numuneleri benzer bir renk vardır. </li></ol></li><li> UV-Vis ve Raman spektroskopisi ile test tahlil duyarlılık. <ol><li> her bir için, UV-Vis spektrumu, bir plaka okuma UV-Vis spektrofotometre kullanılarak 400 ila 700 nm arasında değişen ölçer. </li><li> ters bir Raman mikroskobu kullanılarak, AuNP probları vardır kuyunun yüzeyine hedefi odaklanır. obiyi bir Raman tain. 1800 cm -1 400 cm arasında değişen bir spektrum toplayın -1. Tüm kuyuları için bu adımı tekrarlayın. </li><li> Uygun bir spektral yazılımı kullanarak, UV-Vis spektrumları için Raman için 11. dereceden çok terimli temel düzeltme ve 3. sipariş Polinom gerçekleştirin. </li><li> Uygun bir spektral yazılımı kullanarak, Raman ve UV-Vis spektrumları normalleştirmek. 1 maksimum değeri belirler ve buna göre tüm diğer değerleri ölçek. Raman normalleştirmek için, benzersiz bir polistiren tepe seçmek ve eşit 1&#39;e set ve buna göre tüm diğer değerleri ölçek. </li><li> Uygun bir spektral yazılımı kullanarak, her spektrum için zirve entegrasyonu gerçekleştirmek. Raman için, Raman raportör temsil pik polistiren zirveleri bir bölge Evde olmayan olmalıdır. zirve entegrasyonunu gerçekleştirmek için, istenilen zirve için ayrılmaz sınırlarını belirlemek ve kontroller dahil olmak üzere tüm örnekler için istenen pik alanı kaydedin. </li><li> plilişkili standart sapma gösteren her bir nokta için hata çubukları ile beraber AuNP konsantrasyonunun log bir fonksiyonu olarak ilgi ortalama pik alanı ot. 4 parametreli bir lojistik eğri bu kalibrasyon noktası uygun. </li><li> Boş numune için ilgi zirve alanının ortalamasının alınmasıyla boş ortalama değerini belirler. Bu alanların standart sapmasını belirlemek; Bu boşluğun standart sapma olduğunu. </li><li> önceki adımda analiz Aynı zirve için, en düşük konsantrasyonu için bu zirve alanının standart sapması bulabilirsiniz. </li><li> Temsilcisi sonuçları bölümünde belirtildiği gibi algılama boş ve alt limit sınırını hesaplayın. AuNP konsantrasyonu cinsinden LLOD belirlemek için 4 PL kalibrasyon eğrileri bu değerleri kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIsraelsen%2C+ND+%22Sci.+World+J%22">Sci. World J</a>. , e124582(2015).</li>
<li>Wang, Y., Schlücker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+and+synthesis+of+SERS+labels%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Rational design and synthesis of SERS labels.</a> Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Yan, B., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERS+tags%3A+novel+optical+nanoprobes+for+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">SERS tags: novel optical nanoprobes for bioanalysis.</a> Chem. Rev. 113 (3), 1391-1428 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Immunoassay+Handbook%3A+Theory+and+applications+of+ligand+binding%2C+ELISA+and+related+techniques%22">The Immunoassay Handbook: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques</a>. , Elsevier Science: Oxford. Waltham, MA. (2013).</li>
<li>Cox, K. L., Devanarayan, V., Kriauciunas, A., Manetta, J., Montrose, C., Sittampalam, S. Immunoassay Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCox%2C+KL+%22Assay+Guid.+Man%22">Assay Guid. Man</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	">
	http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/
	</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ELISA+development+guide%22">ELISA development guide</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf">https://resources.rndsystems.com/pdfs/datasheets/edbapril02.pdf</a> (2016).</li>
<li>Israelsen, N. D., Wooley, D., Hanson, C., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+Raman-labeled+nanoparticles+for+a+dual-modality%2C+light+scattering+immunoassay+on+a+polystyrene+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Rational design of Raman-labeled nanoparticles for a dual-modality, light scattering immunoassay on a polystyrene substrate.</a> J. Biol. Eng. 10, (2016).</li>
<li>Menges, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMenges%2C+F+%22Spekwin32+-+optical+spectroscopy+software.+Version+1.72.1%22">Spekwin32 - optical spectroscopy software. Version 1.72.1</a>. , [Accessed: 28-Mar-2016] 
 <a target="_blank" href="http://www.effemm2.de/spekwin/">http://www.effemm2.de/spekwin/</a> (2016).</li>
<li>Findlay, J. W. A., Dillard, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appropriate+calibration+curve+fitting+in+ligand+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Appropriate calibration curve fitting in ligand binding assays.</a> AAPS J. 9 (2), E260-E267 (2007).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+Antibody+Binding+on+Protein+Microarrays+using+Microarray+Nonlinear+Calibration%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Quantifying the Antibody Binding on Protein Microarrays using Microarray Nonlinear Calibration.</a> BioTechniques. 54, 257-264 (2013).</li>
<li>Armbruster, D. A., Pry, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limit+of+blank%2C+limit+of+detection+and+limit+of+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Biochem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation.</a> Clin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49-S52 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EP17-A2%3A+Evaluation+of+Detection+Capability+for+Clinical+Laboratory+Measurement+Procedures%3B+Approved+Guideline%22">EP17-A2: Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures; Approved Guideline</a>. 32. No 8, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, 19087, USA. 
 <a target="_blank" href="http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html">http://shop.clsi.org/method-evaluation-documents/EP17.html</a> (2012).</li>
<li>Leigh, S. Y., Som, M., Liu, J. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+assessing+the+reliability+of+molecular+diagnostics+based+on+multiplexed+SERS-coded+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Method for assessing the reliability of molecular diagnostics based on multiplexed SERS-coded nanoparticles.</a> Plos One. 8 (4), e62084(2013).</li>
<li>Sinha, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+binding+potential+of+cell-surface+receptors+in+fresh+excised+specimens+via+dual-probe+modeling+of+SERS+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantification of the binding potential of cell-surface receptors in fresh excised specimens via dual-probe modeling of SERS nanoparticles.</a> Sci. Rep. 5, 8582(2015).</li>
<li>Shi, W., Paproski, R. J., Moore, R., Zemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+circulating+tumor+cells+using+targeted+surface-enhanced+Raman+scattering+nanoparticles+and+magnetic+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Detection of circulating tumor cells using targeted surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and magnetic enrichment.</a> J. Biomed. Opt. 19, 056014(2014).</li>
<li>Xia, X., Li, W., Zhang, Y., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silica-coated+dimers+of+silver+nanospheres+as+surface-enhanced+Raman+scattering+tags+for+imaging+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Silica-coated dimers of silver nanospheres as surface-enhanced Raman scattering tags for imaging cancer cells.</a> Interface Focus. 3 (3), 20120092(2013).</li>
<li>McLintock, A., Cunha-Matos, C. A., Zagnoni, M., Millington, O. R., Wark, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+surface-enhanced+Raman+tags%3A+individual+nanorods+for+measurements+from+the+visible+to+the+infrared+%28514-1064+nm%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">Universal surface-enhanced Raman tags: individual nanorods for measurements from the visible to the infrared (514-1064 nm).</a> Acs Nano. 8 (8), 8600-8609 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Ayrıntılı protokolde, adres birçok kritik noktalar vardır. Tek sorun Raman muhabir ve altın nanopartikülünün seçimdir. Protokol bağımsız kullanım için adapte edilmesi yazılmış de, Raman raportör DTTC örnek olarak kullanılmıştır. DTTC pozitif yüklü bir muhabir ve olumsuz gibi sitrat şapkalı AuNPs olarak yüzeyleri ücret bağlanır. Bu protokol, yüzey yükü ile altın nano parçacıklar kullanarak negatif yüklü muhabir için adapte edilebilir. Örneğin, polietilenimin (PEI) başlıklı AuNPs pozitif yüzey yüküne sağlamak ve daha iyi ...

Tipik sandviç immüno dolaylı iki antikor kullanarak bir antijen mevcudiyetini algılar. zaptedilen antikoru bir katı yüzeye bağlanmış ve uygun bir antijene yakın bir antikor-antijen kompleksi olduğunda oluşturur. Bir saptama antikor kişiye ve antijene bağlanır. Şekil 1A gösterildiği gibi yıkandıktan sonra, antikor / antijen / antikor kompleksinin kalıntıları ve etiketlenmiş algılama antikoru ile tespit edilir. Tipik algılama geniş bir spektrum zirveleri 2,3 nedeniyle 10 analitlerle çoklama sınırlayan, bir flüoresan veya renk ölçümsel detektörü ile yapılır. Buna karşılık, Raman-tabanlı sistemler kadar 100 analitlerin 2,3 eşzamanlı algılama iddia kaynaklarla gelişmiş çoğullama yetenekleri ile sonuçlanan daha dar emisyon zirveleri var. Birçok literatür kaynakları IMMUNOASSAYS ilgili önemli yönlerini kapsayacak hangi mevcuttur 4-6 gibi adım-adım olarakAyrıntılar kişiselleştirilmiş ELISA kitleri oluşturun. Ne yazık ki, bu protokoller özelleştirilmiş immun çoklayıcı kapasitesini sınırlayan, flüoresan veya kolorimetrik tespiti içindir. Bu ihtiyacı karşılamak için, biz Şekil 1B gösterildiği gibi doğrudan bir immunoassay için daha önce 7 yayınlanmış UV-Vis / Raman immunoassayin imal etmek detaylı bir prosedür mevcut. Bu protokol, işlevselleştirilmiş altın nanopartikül bazlı prob imalat, Şekil 2&#39;de gösterilen içerir. Altın nano partiküller yüzeyi (AuNPs) için Raman habercilerin bağlanarak başlar Raman / UV-Vis probları yapmak için prosedür. AuNPs daha sonra polietilen glikol (PEG) ile ilişkilendirilmiş antikorlar ile fonksiyonalize edilir. AuNPs üzerinde kalan bağlanma yerleri analizi sırasında daha sonra spesifik olmayan bağlanma bilmek AuNPs metoksi polietilen glikol tiyol (mPEG-SH) bağlanmak suretiyle engellenir. hazırlanan AuNP Probes antijenlere bağlanması ile test edilmiştirŞekil 1B &#39;de gösterildiği gibi bir polistiren plaka oyuklarına sabit. ilişkili Raman habercilerin Raman spektroskopisi ile tespit edilirken plakayı yıkayarak üzerine, AuNP sondaları UV-Vis spektroskopisi kullanılarak tespit edilir. UV-Vis ve Raman spektral verileri birleştiren Bu immünodenemenin yeteneklerini arttırmak, analiz iki yöntem sağlar.

<table><tbody><tr><td>60 nm Altın</td><td>Nanoparçacık Ted Pella, Inc.</td><td>15708-6</td><td>Bunlar sitrat başlıklı altın nanopartiküllerdir. Raman muhabiri ile AuNP yüzey yükü arasındaki ilişki ve bunun AuNP ve/veya Raman muhabirinin doğru seçimine etkisi için lütfen Tartışmaya bakın.</td></tr><tr><td>Sodyum Bikarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Tamponlu Salin (10x) pH 7.5</td><td>Scy Tek</td><td>TBD999</td><td></td></tr><tr><td>Şişe Üstü Filtrasyon Ünitesi</td><td>VWR</td><td>97066-202</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polisorbat 20)</td> <td>Scy Tek</td><td>TWN500</td><td>Yıkama aşamaları için emülsifiye edici bir ajan olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su 10x Konsantresi, pH 7.4</td><td>Scy Tek</td><td>PBD999</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tüpü 2.0&nbsp; ml</td><td>Eppendorf Tüpleri</td><td>22431102</td><td>LoBind tüpleri, proteinlerin ve AuNP'lerin tüplerin yüzeylerine bağlanmasını önler.</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tüpü 0.5&nbsp; ml</td><td>Eppendorf Tüpleri</td><td>22431064</td><td>LoBind tüpleri, proteinlerin ve AuNP'lerin tüplerin yüzeylerine bağlanmasını önler.</td></tr><tr><td>Mikroplaka Cihazları UniSeal</td><td>GE Healthcare</td><td>7704-0001</td><td>İşlevselleştirilmiş plakaların sızdırmazlığı ve saklanması için kullanılır.</td></tr><tr><td>Düşük Buharlaşma Kapaklı Test Plakası, 96 Kuyu Düz Tabanlı</td><td>Costar</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı su</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270733-4L</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Dietiltiyatrikarbosiyanin iyodür (DTTC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>381306-250MG</td><td>Raman muhabiri</td></tr><tr><td>mPEG-Thiol, MW 5.000 - 1 gram</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td>MPEG-SH-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>OPSS-PEG-SVA, MW 5.000 - 1&nbsp; gram</td><td>Laysan Biyo A.Ş.</td><td>OPSS-PEG-SVA-5000-1g</td><td>OPSS-PEG-SVA'nın bir NHS ucu vardır.</td></tr><tr><td>Fare IgG, Tüm Molekül Kontrolü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31903</td><td>Antijen</td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31164</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>İnsan Serumu Albümin Bloke Etme Çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1887-1G</td><td>Sığır serum albümini kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Mini Santrifüj</td><td>Fisher Schientific</td><td>12-006-900</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis Spektrofotometre</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>Tuz Giderme Kolonu</td><td>Thermor Scientific</td><td>87766</td><td></td></tr><tr><td>Şirket içi inşa 785&nbsp; nm ters Raman mikroskop ünitesi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ters çevrilmiş bir Raman mikroskobu, kuyu plakasının yüzeyine düzgün bir şekilde odaklanmak için en iyisidir. Aksi takdirde, 96 oyuklu plakanın yüksekliği nedeniyle çok düşük bir büyütme kullanılacaktır. Bir satıcıdan satın almaktan daha ucuz olduğu için şirket içi inşa edilmiş bir sistem kullanıldı. Bununla birlikte, ticari olarak temin edilebilen herhangi bir ters Raman mikroskop sistemi kullanılabilir.</td></tr></tbody></table>

bir uv-vis ve raman spektroskopisi İmmunoassay platformu imalatı

Fabricating a UV-Vis and Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

Immünolojik ilişkili antikorların varlığını temel proteinleri tespit etmek için kullanılır. Çünkü araştırma ve klinik ortamlarda onların geniş kullanım, immunoassay aletleri ve malzemelerin büyük altyapı bulunabilir. Örneğin, 96- ve 384-kuyucuklu polistiren plâkalara ticari olarak temin edilebilir ve çeşitli üreticilerden morötesi görünür (UV-Vis) spektroskopisi makineleri için uygun standart bir tasarıma sahiptir. Buna ek olarak, bu tür enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA) ve özel bağışıklık tasarımları için immünoglobulinler, tespit etiketleri ve bloke edici maddeler, geniş bir çeşitlilik mevcuttur. mevcut altyapı rağmen, standart ELISA kitleri pahalı ve zaman alıcı olabilir bireyselleştirilmiş immunoassay geliştirme gerektiren, tüm araştırma ihtiyaçlarını karşılamak değildir. genellikle floresan veya col bağlı olarak, örneğin, ELISA kitleri (bir defada birden fazla analitin tespiti) yetenekleri düşük çoklama vartespiti için orimetric yöntemler. Kolorimetrik ve floresan tabanlı analizler, geniş spektral zirveleri nedeniyle çoklama yetenekleri sınırlıdır. Buna karşılık, Raman Spektroskopisi tabanlı yöntemler nedeniyle dar emisyon zirveleri için çoklama için çok daha büyük bir yeteneği var. Raman spektroskopisi bir başka avantajı Raman habercilerin floresan etiketleri 1&#39;den daha az photobleaching tecrübe olmasıdır. Raman habercilerin floresan ve kolorimetrik etiketleri üzerinde sahip olduğu avantajlara rağmen, protokoller Raman tabanlı immünoassaylar sınırlıdır imal. Bu çalışmanın amacı, UV-Vis analizi ve Raman spektroskopisi ile analitlerin doğrudan saptanması için polistiren plakaları ile birlikte kullanmak için fonksiyonalize probları hazırlanması için bir protokol sağlamaktır. Bu protokol, önceden belirlenmiş altyapı üzerinde sermaye ise araştırmacılar gelecekteki çoklu analit tespiti için bir do-it-yourself yaklaşım sağlayacaktır.

Bu çalışmada, 60 nm altın parçacıkları, UV-Vis spektroskopisi kullanıldı. UV-Vis bir açık kaynak spektral analiz yazılımı 8 kullanılarak belirlenir edildi her AuNP konsantrasyonu için 400 700 toplanmıştır nm ve pik alanları absorpsiyon spektrumları. entegrasyon tepe önce toplandı, spektrumları bir üç nokta polinom uygun kullanılarak esas çizgi düzeltmesi yapıldı. Tepe Alanı, Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, bir logaritmik kalibrasyon eğrisi meydana getirmek için kullanıldı. Şekiller ...

Nanoparçacık tabanlı optik problar, Raman ve UV-Vis spektroskopisi kullanarak antijenleri tespit etmek için bir araç olarak tasarlanmıştır. Burada, gelecekteki çoğullama yeteneklerini içerecek şekilde bir UV-Vis/Raman spektroskopisi immünolojik testi için bu tür probların hazırlanması için bir protokol açıklanmaktadır.

Bir UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmunoassay Platformu imalatı

Immunoassays are used to detect proteins based on the presence of associated antibodies. Because of their extensive use in research and clinical settings, ...

Bu protokolün genel amacı, UV-Görünür ve Raman Spektroskopisi kullanılarak analiz edilebilen, özelleştirilebilir altın nanoparçacık tabanlı bir immunoassay geliştirilmesini göstermektir. İki optik yöntemin kullanılması, assay için dahili doğrulama sağlar ve assay'in esnekliğini artırır. Bu yöntem, altın nanoparçacık tabanlı bir immunoassay geliştirilmesine ilişkin temel sorulara yanıt vermektedir.Ve nano partikülün fonksiyonelleştirilmesinin bu analizde nasıl kullanıldığının, optik absorbsiyonu ve ışık saçılımını nasıl etkileyeceğini açıklar. Bu protokol, bireysel araştırma ihtiyaçlarına göre özelleştirilebilen bir immünanaliz platformu oluşturmak için tipik araştırma laboratuvarlarında bulunan malzemeleri içermesi nedeniyle benzersizdir. İmmünanaliz, UV-Vis ve Raman Spektroskopisine dayanmaktadır.Raman Spektroskopisi kullanmak, daha dar bant genişlikleri sayesinde aynı anda birden fazla biyobelirtecin tespitine olanak tanıdığından, floresan veya kolorimetrik yöntemlerden daha avantajlıdır. Başlamak için, bi-fonksiyonel çapraz bağlayıcıyı veya pyridyl disulfide PEG-NHS'yi 100 mL sodyum bikarbonat içerisinde hidrate edin. Orto pyridyl ucu altın nanopartikül yüzeyine bağlanacak ve NH

fabricating-a-uv-vis-and-raman-spectroscopy-immunoassay-platform

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

SiO Kantitatif, yüksek verimli, gerçek zamanlı ve etiket ücretsiz biyomoleküler algılama (DNA, protein,...

Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS)

Bu videoda, spesifik hedef antijenleri tespit etmek için Raman spektroskopisi tabanlı doğrudan immünoassay yöntemini açıklıyoruz. Raman problarına bağlı altın nanopartiküllerin yüzeyine adsorbe edilen antikorlar, hedef antijenlerle etkileşime girer ve daha sonra tespit edilen spesifik bir Raman spektrumu üretir.

Spesifik Bir Antijeni Tespit Etmek için Raman Spektroskopisi Tabanlı Doğrudan İmmünoassay

Nanoyapılı substratları hareketsizleştirilmiş proteinler ve aptamerlerle arayüzleyen nano-biyolojik sistemlerin üretimini ve karakterizasyonunu tanımlıyoruz. Nanoyapılı substratların litografik üretimi, biyo-işlevselleştirme ve yüzey geliştirilmiş Raman spektroskopisi (SERS) karakterizasyonunu içeren ilgili deneysel adımlar rapor edilmiştir. Yüzeyde hareketsizleştirilmiş proteinlerin SERS tespiti ve protein-ligand ve aptamer-ligand bağlanmasının araştırılması gösterilmiştir.

Yüzey EBL Fabrikasyon Nanostructured Alt Tabakalar Kullanma biyomoleküllerin Raman Spektroskopisi Algılama Geliştirilmiş

Imalat ve kimyasal kirleticilerin (örneğin, pestisid ferbam ve antibiyotik ampisilin) ​​tespiti için Raman spektroskopi (SERS) deneyi geliştirilmiş filtre tabanlı yüzey yapmak için bir prosedür sunulmuştur.

Kimyasal bulaşanların Hızlı Algılama için Raman Spektroskopisi Tahlili Geliştirilmiş A Filtre tabanlı Yüzey

Bu ayrıntılı bir yöntem olup bağışıklık geliştirilmesinde kullanım için üç boyutlu kağıt tabanlı mikroakışkan cihazları imal etmek. Cihaz montaj yaklaşımımız çok katmanlı bir tür katkı üretim yapmaktadır. Bu kağıt temelli sistemler bu tür Örnek sonuçları sağlamak için yapılan bir sandviç immünoeseyinde göstermektedir.

İmmüno için üç boyutlu Paper-based mikroakışkan Cihazlar İmalat

Bu iletişim kuralı birden fazla Nükleik asitlerin kullanımı kolay bir tek, testinde görsel algılama için uygulanan küçük, kullanıma hazır bir kaset imalatı açıklar. Bu yaklaşım, kılcal bir dizi GDO hedefleri çok katmanlı ve yüksek verimli tespiti için kullanıldı.

Birden çok nükleik asit kapiller bir dizi görsel algılama

Geçerli Zika, chikungunya ve dang virüs karmaşık numune hazırlama ve pahalı araçları gerektirir ve düşük kaynak ortamlarda kullanmak zor tespit etmek için teşhis multiplexed. Algılamak ve yüksek duyarlılık ve özgüllük ile bu virüs ayırt etmek için hedef özgü strand displaceable probları ile izotermal amplifikasyon kullanan bir tanı gösteriyoruz.

Çoğaltılmış izotermal amplifikasyon Zika, Chikungunya ve dang 1 tespit etmek için teşhis platformu dayalı

Bu protokol, tek hücreli çözünürlüğe ulaşabilen entegre bir Raman spektroskopi-kütle spektrometresi (MS) platformu sunar. Raman spektroskopisi ilaçlara hücresel yanıt çalışma için kullanılabilir, MS ilaç alımı ve metabolizma hedefli ve kantitatif analizi için kullanılabilir iken.

Tek Hücreli İlaç Alımı, Metabolizması ve Etkileri Üzerine Entegre Raman Spektroskopisi ve Kütle Spektrometresi Platformu

Elektrowetting tabanlı dijital mikroakışkan, manipülasyonunu kolaylaştırmak için mikrolitre hacimli damlacıkların görünür temas açısında voltaj güdümlü bir değişiklik kullanan bir tekniktir. Bunu fonksiyonel manyetik boncuklarla birleştirmek, enzime bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) kullanılarak numune hazırlama ve patojenlerin tanımlanması için birden fazla laboratuvar ünitesi operasyonunun entegrasyonunu sağlar.

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Bu makale, hücre dışı vezikül alt kümelerinin karakterizasyonu için artan verime sahip yeni nesil multiparametrik analitik platformlar önermektedir. Yöntem, bir mikroarray biyoçipinde sıkışmış veziküler hedefleri nitelemek için Raman spektroskopisi ile birleştiğinde, atomik kuvvet mikroskobu ile metrolojik ve morfomekanik analizlerle çoklanmış biyosensing yöntemlerinin bir kombinasyonuna dayanmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform

Burada, etiketsiz yüzey takviyeli Raman spektroskopisi (SERS) kullanılarak bireysel küçük ekstrasellüler veziküllerini (sEV) analiz etmek için bir protokol sunuyoruz; bu protokol, minimal invaziv hastalık teşhisi ve sEV'lerin terapötik teslimat araçları olarak değerlendirilmesini mümkün kılmaktadır.

Hastalık Tanısı ve Tedavilerde Bireysel SEV'lerin Yüzeye Güçlendirilmiş Raman Saçılmasına Dayalı Biyosensörleme'nin Uygulanmasını Araştırmak

Öğrenin, UV-Vis ve Raman spektroskopisi kullanarak altın nanopartikül tabanlı özelleştirilebilir bir immunoassay platformunun nasıl geliştirileceğini. Bu yöntem, antijen tespiti ve nanomalzeme fonksiyonelleştirme süreçlerini optimize eder.

Bir UV-Vis ve Raman Spektroskopisi İmmunoassay Platformu imalatı

Daha fazla video keşfet