HIV-1 enfekte olmuş hücrelerden eksozom SILAC Bazlı proteomik Karakterizasyon

Bu prosedürün genel amacı, HIV-1 ile enfekte olmuş hücrelerden ekzozomal proteomu karakterize etmektir. Bu yöntem, dış streslerin eksozom proteomunun bileşimi üzerindeki etkisi gibi eksozom biyolojisi alanındaki kilit soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, proteomik ve eksozom biyolojisinde sınırlı bir geçmişe sahip olsa bile öğrenilebilmesidir.

Bu yöntem HIV enfeksiyonu hakkında bilgi sağlayabilse de, bakteriyel enfeksiyonlar gibi diğer hastalık çalışmalarına da uygulanabilir. Bu deneyde H9 hücre hattı kullanılır, ancak aktif olarak çoğalma aşamasında oldukları ve tercih edilen test koşuluna duyarlı oldukları sürece çeşitli hücre hatları kullanılabilir. İki hücre kültürü şişesinin her birine iki kez 10 ila altıncı aşama dokuz hücre tohumlayın.

% 10 stilize FBS, litre başına 100 miligram C13 etiketli L-lizin ve litre başına 100 miligram C13 ve N15 etiketli L-arginin içeren 10 mililitre etiketli ortamda bir popülasyon büyütün. Diğer popülasyonu %10 stilize FBS, L-lizin ve L-arginin ile 10 mililitre etiketlenmemiş ortamda büyütün. Hücreleri altı ikiye katlamak için büyütün, bu noktada etiketli ortamdaki hücrelerin proteinleri %99'dan fazla ağır amino asitlerle etiketlenir.

Hücre türüne bağlı olarak düzenli zaman aralıklarında yeni ortam ekleyin veya ortamı değiştirin. Etiketlemenin sonunda, daha fazla hücrenin büyümesini sağlamak için kültür hacmini 30 mililitreye çıkarın. Standart bir HIV-1 enfeksiyon protokolü kullanarak etiketli hücreleri NL4-3 HIV-1 suşu ile enfekte edin.

Hücrelere uygun miktarda virüs ekleyin ve etiketlenmemiş hücreler HIV-1 enfeksiyonu olmadan etiketsiz ortamda büyümeye devam ederken 48 saat boyunca inkübe edin. HIV-1 enfeksiyonunun sonunda, her iki hücre popülasyonundan süpernatanlar eksozom izolasyonu için toplanır. Kültürlerin süpernatantlarını, hücrelerden kaçınarak 50 mililitrelik konik tüplerde toplayın.

Kalan hücreleri çıkarmak için 300 kez g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları yeni 50 mililitrelik konik tüplerde toplayın ve ölü hücreleri çıkarmak için 2.000 kez g'de 10 dakika santrifüjleyin. Elde edilen süpernatantları, ultrasantrifüjlemeye dayanabilen ticari rotor uyumlu tüplere aktarın.

Ultrasantrifüj tüplerini dengelediğinizden emin olun. Hücre kalıntılarını gidermek için tüpleri 10.000 kez g'de 30 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları yeni ultrasantrifüj tüplerinde toplayın.

100.000 kez g'de 70 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Her eksozom açısından zengin peleti beş mililitre taze PBS içinde yeniden süspanse edin ve çözeltiyi taze bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.

100.000 kez g'de 70 dakika tekrar santrifüjleyin. Son dönüşten sonra, süpernatanı atın. Hücre peletleri artık protein ekstraksiyonu için hazırdır.

Bu prosedüre başlamak için, izole edilmiş her bir ekzozomal peleti 100 ila 200 mikrolitre fer-pa-lai-ses ve çok çeşitli proteazı inhibe edebilen ilave proteaz inhibitörleri ile ekstraksiyon tamponu içinde çözün. Çözünmüş çözeltileri 13.000 kez g ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Temizlenmiş süpernatanları yeni 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın.

Her bir numunenin protein konsantrasyonunu standart tahlillerle ölçtükten sonra, etiketli ve etiketsiz numunelerden eşit miktarda proteini karıştırın. Eşit karışımı dört ila %20'lik bir SDS-PAGE jel üzerinde 30 dakika boyunca çalıştırın. Jeli Coomassie mavisi ile boyayın ve ardından lekeyi çıkarın.

Bir tıraş bıçağı kullanarak, numune şeridini jelden kesin, ardından jel şeridini 10 ila 15 eşit parçaya kesin. Her parçayı toplam 10 ila 15 tüp için 1.5 mililitrelik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne koyun ve metin protokolünde açıklandığı gibi protein ekstraksiyon prosedürüne devam edin. Proteomik veri analizi prosedürleri gösterilmeyecektir, ancak bu akış şemasında özetlenmiştir.

Ekstrakte edilen proteinler ilk olarak sıvı kromatografisi, tandem kütle spektroskopisi ile analiz edilir ve verilerin kalitesi değerlendirilir. Daha sonra, veriler, ikiden az niceliksel peptitle sahip proteinlerin çıkarılmasıyla ön işleme tabi tutulur. Daha sonra önemli ölçüde yukarı regüle edilmiş ve aşağı regüle edilmiş proteinler tanımlanır.

Son olarak, tutarlılık sağlamak için önemli adayların kopyaları karşılaştırılır ve tüm kopyalardan elde edilen veriler birleştirilir. Tanımlanan proteinlerin karakterizasyonuna başlamak için, mevcut eksozom veritabanlarında arama yapmak için GenBank erişim numaralarını veya UniProt ID'lerini kullanın. Bu gösteride ExoCarta kullanılacaktır.

Sorguya tıklayın ve gen veya protein adını ya da erişim numarasını girin. Eksozomlardaki herhangi bir kanıt, aday proteinlerin daha önce eksozomlarda bulunduğunu doğrular ve adayların gerçekten eksozomlarda olduğuna dair bir güven katmanı ekler. Ardından, adayları HIV-1 ve insan protein etkileşimi veritabanına göre arayın.

Protein alan adı girişinde, adayın adlarını veya katılım numaralarını girin ve ara'yı tıklayın. Arama sonuçları, HIV-1 ve protein adayları arasındaki etkileşimler hakkında fikir verebilir ve hangi adayların gerçekten HIV-1 ile ilişkili olabileceğini önerebilir. Üçüncü adım, fun-brich gibi bir gen ontolojisi veya GO analiz yazılımı kullanarak adaylar hakkında küresel bilgi edinmektir.

Zenginleştirme analizi altında, veri kümesi ekle'ye tıklayın ve adayların GenBank erişim numaralarını veya UniProt kimliklerini yükleyin, ardından GO analizini görselleştirmek için grafik türünü seçin. GO analiz sonuçları, biyolojik süreç, hücresel bileşen ve moleküler fonksiyon alanlarında aday proteinler hakkında bilgi sağlayan pasta grafikler şeklinde görselleştirilir. Bir sonraki adım, DAVID analizi yoluyla istatistiksel olarak aşırı temsil edilen GO terimlerini belirlemektir.

İşlevsel açıklama aracına tıklayın, aday listesine girin ve UniProt ID gibi genin tanımlayıcısını seçin. Arama tamamlandığında, zenginleştirilmiş GO terimlerini, p değerlerini ve diğer parametreleri görüntülemek için gen ontolojisi kategorisinin altındaki ek açıklama özeti sonuçları sayfasına tıklayın. Son olarak, açık erişilebilir STRING veritabanını kullanarak potansiyel protein-protein etkileşimlerini ve olası biyokimyasal yolları araştırın.

Protein kimliğini veya dizisini belirlenen arama kutusuna girin ve analiz için doğru türü seçin. Ara'yı tıklayın. Sonuçlar hem doğrudan hem de dolaylı ilişkiler hakkında bilgi verecektir.

Sonuçlarda görüntülenen ekzozomal aday için bilinen ilk 10 eşleşme, önemli bir aday seçimi için dikkate alınmalıdır. 14 proteinden oluşan bir setin DAVID analizinden elde edilen temsili sonuçlar gösterilmiştir. Biyolojik süreç zenginleştirmesi, hücre ölümü ile ilgili süreçlerin önemli ölçüde zenginleştirildiğini gösterdi.

Hücresel bileşen zenginleşmesi, hücre içi kökenli birçok proteini gösterir ve moleküler fonksiyon zenginleşmesi, adayların çoğu için protein bağlanmasında bir rol tanımlamıştır. L-laktat dehidrojenaz B zinciri veya LDHB en önemli aday olarak seçildi ve STRING analizi, LDHB'nin en iyi 10 etkileşimli ortağını belirledi. LDHB partnerlerinin çoğunluğu ayrıca fonksiyonel ve konumsal olarak HIV-1'deki eksozomlarla ilişkiliydi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa bir hafta içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, her adımı doğru sıcaklık ve koşulda gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, biyoinformatik analizin tahminlerini doğrulamak için afinite izolasyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, biyolojide HIV-1 enfeksiyonları ile ilişkili ekzozomal proteomdaki değişiklikleri araştırmak için ekzozomal alandaki araştırmaların önünü açtı. Bu videoyu izledikten sonra, eksozomu hücre kültüründen nasıl izole edeceğinizi, proteomlarını nasıl analiz edeceğinizi ve HIV ile ilişkilerini nasıl araştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Unutmayın, HIV veya diğer bulaşıcı ajanlarla çalışmak son derece tehlikeli olabilir ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemler alınmalıdır.