Name: Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Öğrenin, yetişkin fare omurilik dokusundan primer karışık glial kültürler hazırlama yöntemini. Bu teknik nöropatik ağrı ve multipl skleroz gibi nörolojik hastalıklarda glial hücre rollerini in vitro ortamda araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yetişkin omurilik karışık kültürleri ilk olarak bir NIH/NIDA R01 ödülü (PI De Leo) ve bir NIH T32 eğitim hibesi (PI Green) hibe desteği ile sıçanlar kullanılarak geliştirilmiştir. Bu yöntemler, aşağıdaki hibelerin desteğiyle fare omurilikleri için daha da uyarlandı: NIH / NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH / NINDS 5R21NS066130 (PI Cao) ve NIH / NIGMS P20GM103643 (PI Meng). Yazarlar ayrıca, Chicago Osteopatik Tıp Koleji Farmakoloji Bölümü'nden Dr. Alejandro M. S. Mayer'e, mikroglia açısından zengin karışık glial hücrelerin elde edilmesindeki teknik yardımı için teşekkür eder.

Aşağıdaki protokol New England Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Aşağıdaki protokol 4 yetişkin fare omurilik gelen glial kültürler hazırlamak içindir. Aseptik Koşullarında bir kültür Hood Solutions hazırlanması 1. <ol><li> Kültür ortamı hazırlayın: Eagle ortamı (cDMEM) DMEM içeren tam Dulbecco modifikasyonu,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin (4.5 g / L glukoz ile), 100 mg / ml streptomisin 250 ng / ml amfoterisin B ve 50 uM 2-merkaptoetanol (2-Me, 1.1.1 bakınız). Mix ve diğer tüm bileşenler sterilize filtre ve sonra FBS ekleyin. 4 o C&#39;de kültür ortamı Mağaza <ol><li> 50 mM 2-ME / fosfat tamponlu salin (PBS) bir stok çözelti hazırlayın: 100 mcL konsantre edildi 2-ME 28.6 1x PBS mL ve filtre ile sterilize (çözelti 4 o C&#39;de saklanabilir halinde (14.3 M) Birkaç ay). UKültür ortamı, her 1000 ml için 2-ME, stok çözeltisinin GD 1 mi. </li></ol></li><li> Yoğunluk gradyan ortamının hazırlanması <ol><li> Bir hisse senedi izotonik yoğunluk gradyan medya çözümü hazırlayın (örn% 100 Percoll) 1 kısım 10x normal steril PBS ve 9 parça steril stok yoğunluk gradyan medya (örneğin, Percoll) dan. </li><li> % 20 yoğunluk gradyan ortamı (örneğin, 1 x PBS, 40 mL% 100 yoğunluk gradyan, 10 mL ortam) yapmak için normal 1x steril PBS ile (1.2.1) yapılan% 100 yoğunluk gradyan ortamı seyreltilir ve 4 ° C&#39;de saklayın o C hücre kültürü hazırlamak önce oda sıcaklığında (RT) 20% yoğunluk gradyan ortamı getirin. </li></ol></li><li> Papain ayrışma sisteminden çözeltilerin hazırlanması Not: Papain ayrışma kaplama için Tablo l&#39;de tespit edilebilir. (In-house monte dahil) benzeri diğer ayrışma kitler de kullanılabilir. Tüm components steril olması gerekmektedir. <ol><li> ovomukoid inhibitörü karışımı (toz) için Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) 32 ml. </li><li> bir papain flakon (toz) için EBSS&#39;ye 5 ml ekleyin. 10 dakika süre ile ya da papain çözünene kadar 37 o C su banyosu içinde papain flakon yerleştirin. </li><li> bir DNaz flakon (toz) için EBSS&#39;ye 500 uL ekleyin. hafifçe karıştırın. </li><li> Papain şişeye DNase çözeltisi (yukarıda) 250 ul. </li><li> gerekli Yukarıdaki papain / DNaz karışımı (fare omurilik başına papain / DNaz karışımının yaklaşık 800 uL) &#39;nin toplam miktarını hesaplayın ve Doku sindirimi (adım 3.2) bir 50 ml tüp içine gerekli karışımı aktarın. en az iki hafta boyunca 4 ° C&#39;de orijinal şişeye, artmış saklayın. </li><li> ihtiyaç kadar buz üzerinde kitleri tüm bileşenleri tutun. </li></ol></li><li> spinal kord toplama tüpleri hazırlanması: Bir steril 15 ml tüp 5 ml Hank&#39;in dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS ile, Papain ayrılma sistemi,0; 1X PBS ile omurilik) ve bir steril 15 ml tüp toplanması için (5 ml şırıngaya doldurulmasında) adım 2.4. Buna ek olarak, HBSS 5 ml ile bir steril petri (35 mm veya 60 mm) hazırlamak ve kültürü kaputu içinde tutmak. </li></ol> 2. Omurilik Koleksiyonu Not: Tüm ekipman steril olması gerekmektedir. IACUC tarafından onaylanmış belirlenmiş bir alanda toplanmasını gerçekleştirin. <ol><li> hasat fare omurilik için aşağıdaki araçları edinin: düz keskin / künt 18 cm cerrahi makas, 12 cm standart neşter (# 3 katı), karbon çelik steril neşter bıçakları 10., küçük bir hayvan decapitator, 12 cm standart kavisli forseps ve steril bir 20G iğne 5 ml şırıngaya bağlanmış. </li><li> CO2 ile hayvan Euthanize ve fare baş ve% 70 etanol (EtOH) ile arka bölgeyi dezenfekte. </li><li> decapitator ile hayvan başını kesmek. kas tabakası açığa alt geri bir orta uzunlamasına bir kesi yapmak. YapmakKalça düzeyinde omurgalı sütun üzerinden temiz bir kesik steril düz cerrahi makas (18 cm) (aynı zamanda omurgalı sütunu kapsayan kas tabakası ile kesme). </li><li> tek kullanımlık taze mendil bir kağıda hayvan yerleştirin. Dikkatle rostral tarafına doğru omurganın içerisine (steril 1 x PBS (adım 1.4) ile doldurulmuş, 5 ml şırıngaya bağlanmış) 20 G iğne yerleştirin. aşağı sıkıca hayvan tutun ve hızlı bir şekilde şırınga itin. Bütün omurilik servikal ucundan çıkması gerekir. HBSS içeren 15 ml tüp içine omurilik toplayın. </li><li> Farelerin kalanı için yineleyin 2.4. Her bir hayvan arasında,% 70 EtOH ile kullanılan tüm araçların dezenfekte edin. NOT: Genellikle, bir tek 12-plaka her 4 fare omurilik (4.3 bakınız) kurulabilir. </li></ol> Tek Hücre Süspansiyon 3. hazırlanması Not: Steril her şeyi tutmak için bir kültürü kaputu adım 3 ve 4 gerçekleştirin. <ol><li> HBSS içeren petri (adım 1.4) içine tüm omurilik aktarın. Steril makas ve forsepsle bir çok ince, küçük parçalar halinde omurilik her kesim. bu daha hazırlıklı sulandırmak gibi steril forseps veya 10 ml pipet kullanarak hazırlanan papain / DNaz enzim karışımı (adım 1.3.5) içeren 50-ml konik tüp omurilik doku transferi (enzim karışımı HBSS eklemekten kaçının enzim çözeltisi ve enzimin azalmış performansa neden olabilir). </li><li> karıştırmak için tüp hafifçe karıştırın. Yörünge 150 rpm&#39;de çalkalanarak bir inkübatör / çalkalayıcıda 1 st için 37 o C&#39;de tüp inkübe edin. </li><li> Vorteks tüpü tekrar ve şiddetle ileri ayrışmasını teşvik etmek için bir 5 ml pipet kullanarak doku ile enzim çözeltisi çiğnemek. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de 15 ml tüp ve santrifüj içine hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Santrifüj sırasında yeniden albüminsiz ovomukoid inh 300 ul 2.7 mL EBSS karıştırınsteril tüp içinde ibitor çözeltisi (1.3.1). DNaz solüsyonu (adım 1.3.3) 150 mcL ekleyin. </li><li> Santrifüj sonrasında, süpernatant kaldırmak ve (3.5 adım a) yukarıda hazırlanan çözelti ile hücre pelletini. Vortex iyi hücre pelletini kırmak için. </li><li> Hücre süspansiyonuna yeniden albümin ovomukoid inhibitör çözeltisi (aşama 1.4.1) 3 ml. Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 70 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. (Membran parçaları içerir) süpernatantı. </li></ol> Tek Hücre Süspansiyon gelen Miyelin 4. Ek Kaldırma <ol><li> Freni olmaksızın, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 800 xg&#39;de hücreleri topak bozmaya yavaşça Hücre topaklarını içeren tüpe girdap (adım 1.2.2 hazırlanmıştır)% 20 yoğunluk gradyan ortam 8 mL ekleyin ve santrifüjlenir. Dikkatle enkaz (çoğunlukla miyelin) ve süpernatant üst tabakasını kaldırmak, ancak pelet tutmak. </li><li> resuspendi hücreleri yıkayın, yoğunluk gradyanı kalıntıları çıkarmak içinBir seyreltilmiş cDMEM 8 mL (1 kısım cDMEM ve 2 kısım HBSS) hücre pelletini ng. 4 O C &#39;de 10 dakika boyunca 400 x g&#39;de santrifüj hücreleri Süpernatantı ve aynı şekilde seyreltilmiş cDMEM (yukarıda) ile tekrar yıkama hücreleri. Onları tohumlama kadar buz üzerinde hücreleri tutun. </li><li> Süpernatantı ve kültür ortamında hücre pelletini (cDMEM ile birlikte 2-ME (adım 1.1 hazırlanmış)). Bir 12-yuvalı plaka için, 3 mL x 4 (kullanılan farelerin sayısı) + 2 ml = 14 ml ortamı kullanın. Bu, tüm plaka için yeterli hücre süspansiyonu (12 oyuk) olmasını sağlamak ve oyuk başına ortalama hücre sayısı ve kültür mikroglial içeriğini belirlemek için kullanılabilir ilave kuyu sağlayacaktır. kültür damarlarının diğer türleri kullanılacak ise, orantılı gerekli kültür ortamı toplam hacmini hesaplamak. </li><li> 12 oyuklu plakanın her bir hücre süspansiyonu 1 ml. </li><li> % 5 CO 2 ile 35.9 o C&#39;de inkübe hücreleri. </li><l4 d sonra (1, 4, 8, ve 11, ve sonra 12. günde hücreleri kullanmak genellikle D ortamı değiştirmek) - i&gt; D 1 medya (aspirasyon yoluyla eski medya kaldırmak) değiştirin ve sonra her 3. NOT: 1. günde, kültür nedeniyle omurilik dokusundan kalıntı miyelin enkaz önemli miktarda içerebilir; böylece, 1 gün medyayı değiştirme (Daha fazla bilgi için tartışma bakınız) tavsiye edilir. D 12, oyuk başına 100,000 hücre 12 oyuklu bir plaka içerisinde bulunmaktadır, 14. hücreler genellikle D 12% 80 konfluent ve tipik olarak D 14 ile% 100 konfluent civarındaki olabilir - Kültürler 12 D arasında tedavi için hazır . </li></ol><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54801/54801fig4.jpg" /> Şekil 2:. Karışık glia kültürünün kurulmasından sonra farklı zamanlarda karışık glial hücreler Örnek Çıkan Birincil spinal kordon karışık Glia yetişkin C57BL / 6 farelerinden elde edildi. temsilcisi görüntülerikaplama sonrası glial kültür ilerlemesini gösterir. 1. günde, bazı hücreler kültür plakasına bağlı, ama çoğunlukla hala yuvarlak edilir. yüzen hücreleri ve önemli enkaz birçok vardır. 4. günde, hücreler çoğunluğu kültür plakasına bağlıdır. Hücreler görebilir süreçlerle dallanmış görünür. Hücreler sporadik dağıtılır ve kültürler şu anda yaklaşık% 20-30 konfluent. 8. günde, kültürler% 50-60 konfluent arasındadır. kültürlerin Bazı alanlar hücrelerinin büyük yamalar var. kültürlerin diğer alanlar hücrelerin seyrek bir büyüme var. yamalar içindeki bazı hücreler &quot;kare&quot; gibi görünüm alır. 12. günde, kültürler (Burada gösterilen görüntü ile ilgili olarak% 90 kaynaşık), ya da% 80 konfluent üzerindedir. Hücre şu anda büyüme log fazında ve 12-14 deneyler için glia hücreleri kullanarak için en uygun zaman gün arasında değişmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54801/54801fig4large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonu. <ol start="7"><li> Anti-fare-CD45 ve anti-fare CD11b monoklonal antikorların kombinasyonu kullanılarak Standart flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre tasnif (FACS) boyama protokolü 11 üzerinden ilave kuyulardan hücreler (4.3 aşama) kullanarak mikroglial içeriği inceleyin. CD45 + CD11b + hücrelerinin mikroglialar olarak tanımlanır. </li></ol>

<ol><li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain%22%5BJournal%5D)">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li>
<li>Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+and+pain%3A+Is+chronic+pain+a+gliopathy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?</a> Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M., et al. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNi%2C+M+%22Curr+Protoc+Toxicol%22">Curr Protoc Toxicol</a>. Maines, M. D., et al. , (2010).</li>
<li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures%3A+microglial-dependent+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li>
<li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+%2F+v-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li>
<li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li>
<li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li>
<li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li>
<li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+%28CGRP%29+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li>
<li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+Infiltrating+CD4%28%2B%29+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li>
<li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability%2C+tumor+necrosis+factor-alpha%2C+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7(2001).</li>
<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li>
<li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li>
<li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Tüm adımları dahil deneyler arasında tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tutarlı bir şekilde programı değişen ortama gerçekleştirmek için çok önemlidir. Aşağıdaki adımlar mükemmel kalitede yetişkin karışık glia elde özellikle kritiktir. enzimatik sindirim Bu protokolün önemli bir yönüdür. Doku parçaları, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için iyi sindirilir çok önemlidir. Bununla birlikte, aşırı sindirim önemli ölçüde daha az hücreleri neden olur. Her laboratuar inkübasyon için kull...

Kronik ağrı kadar 635.000.000.000 $ 1 tahmini yıllık maliyeti, ABD&#39;de yaklaşık 100 milyon yetişkin etkileyen ciddi bir sağlık sorunudur. Montaj kanıtlar nöropatik ağrı, kronik ağrı 2 en yıkıcı tür bir geliştirme omurilik glial hücrelerin önemli bir katkı göstermiştir. Uygun bir in vitro kültür sistemi ayrıca hücresel ve moleküler seviyede gliyal hücrelerinin rolleri araştırmak önemli ölçüde yardımcı olur. Şu anda, araştırmacılar tarafından kullanılan in vitro glial kültür sistemleri yenidoğan fare veya sıçan beyinleri kortikal dokulardan elde edilen ağırlıklı glial hücreler içerir ve ölümsüzleştirdi neonatal fare türetilen glial hücre hatları veya primer glial hücreler sıçan. Yenidoğan hücreleri böylece sağlayan başka (özellikle astrositler ve mikroglia) glial hücrelere ayırt edilebilir farklılaşmamış hücreler önemli miktarda içerenDeneysel kullanım 3 bundant hücreleri. Bununla birlikte, daha önceki bir çalışma neonatal beyin gliyal hücreler, lipopolisakkarit (LPS) ile stimülasyon üzerine yetişkin omurilik, glial hücrelerinden önemli ölçüde farklı yanıt göstermiştir. Örneğin, interlökin (IL) -4 neonatal beyin glia 4 ile karşılaştırıldığında, yetişkin fare omurilik glia (NO) üretimi, LPS ile uyarılmış nitrik oksit önleyici etkilerini arttırdığını sergiledi. Bundan başka, gen-ilişkili peptid (CGRP) kalsitonin bir nöro-peptid ile stimülasyon üzerine kemokin üretiminin profilleri, (5. Referans açıklanan yöntemlere) yenidoğan fare beyin glia arasındaki tartışmasız farklıdır ve yetişkin fare omurilik glia (Şekil 1). Hücre serileri kullanımı ve bakımı kolay olan ve kısa bir süre içinde geniş hücre temin edebilmektedir. Genel olarak, hücre çizgileri oluşturulur ya da 6, 7 ya da aşağıdaki TH (örneğin yaygın olarak kullanılan mikroglial hücre hattı BV2 gibi) bir virüs aracılı ölümsüzleşme sistemi kullanan ölümsüzleştirilmişSpontan dönüşümün e tespiti (örneğin astrosit hücre hattı C8-D1A ve mikroglial hücre hattı C8-B4 gibi) 8, 9 Hücre hatları ayrı ayrı astrositler ve mikroglia moleküler özelliklerini okuyan mükemmel.; Ancak, hücre çizgilerinden elde edilen sonuçlar her zaman birincil hücrelerde veya in vivo koşullara de doğrulama gerektirir. Aynı zamanda, bir kemirgen omurilik glia türetilen bir glial hücre hattının bir rapor olmamıştır unutulmamalıdır. Nöropatik ağrı, yetişkin sıçan karışık glial kültürler 4 üretmek için kullanılan daha önce bildirilen yöntem adapte tarafından geliştirilmiştir yetişkin fare omurilik türetilen bir kültür sisteminin geliştirilmesi, 5 omurilik glial hücre rolünü araştıran yardımcı olmak . fare omurilik glial kültürünü, en son 10 rafine edildi ve bu makalede daha detaylı olarak tarif edilmektedir. Yetişkin omurilik karışık glial kültürleri cBir özel çalışmada ihtiyaçlarına uygun seçilen türlerden bir fare ile kurulacak ve hücreler kültür başlatılmasını yayınlamak d fazla 21 için kültür içinde muhafaza edilebilir. Bu yöntem, hem de bu -associated amiyotrofik lateral skleroz (ALS), insan bağışıklık eksikliği virüsü (HIV), duyusal nöropati, ve birden fazla sıra omurilik içinde patolojik değişikliklerin dahil çeşitli nörolojik hastalıkların araştırmalarda, nöropatik ağrı çalışmalarında kullanılabilir skleroz (MS).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' Eagle'ın modifikasyonu 4,5 g/L glukozlu s ortamı (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>cDMEM ortamı standart, yaygın olarak kullanılan bir kültür ortamıdır. Bireysel araştırmacılar, DMEM'i ve cDMEM ortamını yapmak için kullanılan diğer tüm bileşenleri nereden satın alacaklarına karar verebilirler.</td></tr><tr><td>L-Glutamin (100x)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td>L-glutamin, çeşitli kültür ortamları için standart, yaygın olarak kullanılan bir bileşendir. Bireysel araştırmacılar L-glutaminin nereden satın alınacağına karar verebilirler.</td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik Çözelti (100x)</td><td>Corning-Mediatech</td><td>30-004-CI</td><td>Bu, 10.000 birim / mL penisilin G, 10 mg / mL streptomisin sülfat ve 25 & mikro içerecek şekilde formüle edilmiş bir penisilin, streptomisin ve Amfoterisin kombinasyonudur; g/mL amfoterisin B. Bireysel araştırmacılar, tek tek bileşenleri nereden satın alacaklarına karar verebilirler.</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol (2-ME)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>Hücre kültürü, moleküler biyoloji ve elektroforez için uygun bir BioReagent.</td></tr><tr><td>Papain ayrışma sistemi</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>Bu kitin ayrı bileşenleri ayrı olarak satın alınabilir.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Health Care</td><td>17-0891-01</td><td>Percoll steril solüsyon olarak satılmaktadır. Seyreltilmemiş Percoll gerekirse yeniden otoklavlanabilir.</td></tr><tr><td>Laboratuvar hattı inkübatör/çalkalayıcı&nbsp;</td><td>Barstead / Laboratuvar hattı</td><td>MaxQ4000 & nbsp;</td><td>Bu, şu anda sahip olduğumuz kuluçka makinesi/çalkalayıcıdır. Bunun yerine başka tür çalkalayıcılar kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Lipopolisakkaritler, Salmonella Minnesota Re595</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-9764</td><td>LPS'nin diğer suşları da glial yanıtları indükleyebilir. Yine de yanıtların büyüklüğü değişebilir.</td></tr><tr><td>Fare IL-6 DuoSet ELISA&nbsp;</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>DY406</td><td>Her bir Araştırmacı tercih ettiği ELISA kitini seçebilir.</td></tr><tr><td>Fare TNF-alpha DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY410</td><td>Her bir Araştırmacı tercih ettiği ELISA kitini seçebilir.</td></tr><tr><td>Fare IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td><td>R& D Systems</td><td>DY466</td><td>Her bir Araştırmacı tercih ettiği ELISA kitini seçebilir.</td></tr><tr><td>Fare MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia seti</td><td>BD Biosciences</td><td>555260</td><td>Her bir Araştırmacı tercih ettiği ELISA kitini seçebilir.</td></tr><tr><td>Fare kemokin Q-Plex</td><td>Quansys Biosciences</td><td>120251MS</td><td>Bu ürün o sırada kurum içi tahlil için mevcut değildi. Bunun yerine, analiz için üreticiye numune gönderdik.</td></tr><tr><td>APC-anti-fare-CD45 (klon 30-F11)</td><td>eBioscience</td><td>17-0451</td><td>Aynı klonun ancak diğer satıcılardan gelen antikoru kullanılabilir.</td></tr><tr><td>FITC-anti-fare-CD11b (klon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Aynı klonun ancak diğer satıcılardan gelen antikoru kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Accuri C6 akış sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>BD Accuri C6&nbsp;</td><td>Her bir Araştırmacı tercih ettiği herhangi bir akış sitometresini kullanabilir.</td></tr><tr><td>FlowJo yazılımı</td><td>Ağaç Yıldızı, Inc.</td><td>FlowJo7.6.5</td><td>Her bir Araştırmacı, tercih ettiği herhangi bir analiz yazılımını kullanabilir.</td></tr></tbody></table>

yetişkin fare omurilik doku İlköğretim karışık glial kültürler hazırlanması

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Omurilik glial tepkiler nöropatik ağrı gelişimine önemli ölçüde katkıda bulunduğunu çok iyi kabul edilmiştir. Hücresel ve moleküler seviyede glial faaliyetlerine ilişkin muazzam bilgiler, in vitro hücre kültür sistemleri ile elde edilmiştir. Kullanılan in vitro sistem, esas olarak neonatal beyin kortikal dokudan türetilen primer glia içerir ve hücre hatları ölümsüzleştirilmiş. Bununla birlikte, bu sistemler, in vivo olarak, spinal kord, glial hücrelerin özelliklerini yansıtmayabilir. Daha iyi in vivo durumunu yansıtan bir kültür sistemi kullanılarak periferik sinir hasarı-kaynaklı nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücre rollerini araştırmak üzere, laboratuar primer omurilik karışık glial kültürleri oluşturulması için bir yöntem geliştirmiştir yetişkin fareler. Kısaca, omurilik, yetişkin farelerden toplandı ve dens olan miyelin uzaklaştırılarak elde edilmiş papain sindirim yoluyla işlenirSığ gradyanlı araç. Tek hücre süspansiyonları, 35.9 O ° C&#39;de 2-merkaptoetanol (2-Me) ile desteklenmiş tam Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (cDMEM) kültürlenmiştir Bu kültür koşulları karışık glial hücrelerin büyümesi için özel olarak optimize edilmiştir. Bu koşullar altında, hücrelerin 12 ile deney için kullanılmak üzere hazır olan - 14 kültürde kurulması (D 0) sonra, (hücre, bu süre içinde log fazında genellikle) ve D 21 kadar kültür koşullarında muhafaza edilebilir. Bu kültür sistemi, çeşitli maddeler ve maddeler ile stimülasyonu ile omurilik glial hücre yanıtları araştırmak için kullanılabilir. Nöropatik ağrı Bunun yanı sıra, bu sistem, spinal kord, glial hücrelerin patolojik değişiklikler içeren diğer hastalıklarda glial yanıt incelemek için kullanılabilir.

Bu yöntem, farelerde ve sıçanlarda karma glial hücrelerini hazırlamak için de kullanılabilir. Hücreler fare omurilik elde zaman kültür D12 sonrası başlatma üzerinde 12 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına ortalama hücre sayısı göz başına yaklaşık 100,000 hücre ile nispeten kararlı olmalıdır. Bu yöntemle elde edilen glial hücreler madde ve ilgi maddelerin uygulanması üzerine, yetişkin omurilik, glial yanıt incelemek için dizayn edilmiştir deneylerde kullanılabilir. 3 t...

nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücrelerin patolojik değişiklikleri kapsar. Bu hücrelerin in vitro incelenmesi için, yetişkin omurilik dokusu elde edilir ve tasarlanmış güvenilir bir glial kültür sistemi yoksundur. Bu nedenle, biz yetişkin fare omurilik dokusu primer karışık glial kültürlerin nasıl kurulabileceğini burada gösteriyor.

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Bu protokolün genel amacı, in vitro çalışmalar için yetişkin fare omuriliklerinden primer karışık glial kültürler oluşturmaktır. Bu yöntem, nöropatik ağrı ve multipl skleroz gibi omurilik içindeki patolojik değişiklikleri içeren nörolojik hastalıklarda glial hücrelerin rollerini incelemek için bize in vitro bir sistem sunar. Bu tekniğin temel avantajı, glial kültürlerin yetişkin fare omuriliğinden hazırlanmasıyla in vivo koşulları daha doğru yansıtan bir sistem sağlamasıdır.Prosedürü laboratuvarımdan bir teknisyen olan Jennifer Malon gerçekleştirecektir. Bir doku kültürü hudu altında çalışarak, dört fare omuriliğini HBSS içeren bir petri kabına aktarın. Her bir omuriliği küçük parçalara ayırmak için steril makas ve pens kullanın.Ardından, parçaları Papain DNAse enzim karışımı içeren 50 milimetrelik konik bir tüpe aktarın. Enzimin performansının düşmesine neden olabileceği için HBSS'in enzim karışımına aktarılmasından kaçının. Tek hücre süspansiyonu elde etmek için doku parçalarının iyice sindirilmesi kritik önem taşımaktadır.Ancak, aşırı sindirim daha az canlı hücre ile sonuçlanacaktır. Her laboratuvarın, kendi hücreleri için en uygun olanı belirlemek amacıyla kesin sindirim süresi

preparation-primary-mixed-glial-cultures-from-adult-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, fetal spinal kablolarından Glial Yasak Öncüleri derivasyon özetliyor ve transplantasyon için veya oligodendrocytic soyunun çalışma için ya in vitro korunmuştur.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

Beynin hücresel heterojenite birincil mikroglia Yalıtımlı fizyolojik ve patolojik hem de kendi rolünü araştırmak için esastır. Bu protokol bir mekanik izolasyon ve yüksek verim ve yüksek saflıkta sağlar karışık hücre kültürü tekniği için geçerli birincil mikroglia hücreleri...

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Bu video, yetişkin fare beyninden lateral ventrikül duvarlarını izole etmek ve tek hücreler elde etmek için enzimatik doku ayrışması gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol göstermektedir. Bu hücreler daha sonra nöral kök hücrelerin proliferasyonunu seçici olarak artıran ve bunların oligodendrositlerin ve astrositlerin ko-kültürlerine farklılaşmasını teşvik eden spesifik kültür koşullarına tabi tutulur.

Yetişkin fare nöral kök hücrelerinden karışık oligodendrosit ve astrosit kültürü elde edilmesi

Video, yenidoğan bir fare beyninden hücreleri izole etme ve kültürleme yöntemini gösterdi. Beynin enzimatik ve mekanik ayrışmasını ve ardından karışık bir glial popülasyon elde etmek için nöronal büyüme faktörü olmayan büyüme ortamında kültürlemeyi içeriyordu.

Yenidoğan Fare Beyninden Karışık Glial Hücre Kültürü Elde Edilmesi

Bu videoda, yetişkin fare omurilik dokusundan birincil karışık glial hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesi için bir teknik gösterilmektedir. Protokol, dokunun enzimatik sindirimini ve ardından tek hücreli bir popülasyon elde etmek için kırık hücre zarlarının ve miyelin kalıntılarının çıkarılmasını içerir. Hücreler daha sonra karışık glial hücre büyümesi için optimize edilmiş ortamda kültürlenir.

Bir Fare Omuriliğinden Primer Karışık Glial Hücre Kültürlerinin Oluşturulması

Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

Adipoz kaynaklı mezenkimal stromal hücreler (AdMSC'ler), inflamasyonla ilişkili hastalıkların tedavisinde yararlı olan güçlü immünomodülatör özelliklere sahiptir. Murin AdMSC'lerin ve primer karışık gliaların nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini, AdMSC'lerin anti-inflamatuar genleri ve büyüme faktörlerini yukarı regüle etmek için nasıl uyarılacağını, AdMSC'lerin göçünün nasıl değerlendirileceğini ve AdMSC'lerin primer karışık prion ile enfekte glia ile nasıl ko-kültür yapılacağını...

Prion Kaynaklı Enflamasyonu Azaltmak için Primer Karışık Glia ile Ko-Kültürlenmiş Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreler

Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.

İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Öğrenin, yetişkin fare omurilik dokusundan primer karışık glial kültürler hazırlama yöntemini. Bu teknik nöropatik ağrı ve multipl skleroz gibi nörolojik hastalıklarda glial hücre rollerini in vitro ortamda araştırmak için kullanılır.

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

Daha fazla video keşfet