Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

nöropatik ağrı gelişimi omurilik glial hücrelerin patolojik değişiklikleri kapsar. Bu hücrelerin in vitro incelenmesi için, yetişkin omurilik dokusu elde edilir ve tasarlanmış güvenilir bir glial kültür sistemi yoksundur. Bu nedenle, biz yetişkin fare omurilik dokusu primer karışık glial kültürlerin nasıl kurulabileceğini burada gösteriyor.

Bu protokolün genel amacı, in vitro çalışmalar için yetişkin fare omuriliklerinden primer karışık glial kültürler oluşturmaktır. Bu yöntem, nöropatik ağrı ve multipl skleroz gibi omurilik içindeki patolojik değişiklikleri içeren nörolojik hastalıklarda glial hücrelerin rollerini araştırmak için bize in vitro bir sistem sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, glial kültürlerin yetişkin fare omuriliğinden hazırlanması ve in vivo koşulları daha doğru bir şekilde yansıtan bir sistem sağlamasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Jennifer Malon olacak. Bir doku kültürü başlığında çalışarak, dört fare omuriliğini bir HBSS petri kabına aktarın. Omuriliklerin her birini küçük parçalara ayırmak için steril makas ve forseps kullanın.

Daha sonra parçaları Papain DNAse enzim karışımı içeren 50 milimetrelik konik bir tüpe aktarın. HBSS'yi enzim karışımına aktarmaktan kaçının, çünkü bu enzimin performansının düşmesine neden olabilir. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için doku parçalarının iyi sindirilmesi çok önemlidir.

Bununla birlikte, aşırı sindirim daha az canlı hücre ile sonuçlanacaktır. Her laboratuvarın, hücreleri için en iyi olanı temel alarak tam sindirim süresini belirlemek için pilot testler yapması gerekir. Daha sonra, tüpü nazikçe girdap haline getirin ve ardından dakikada 150 dönüşte yörünge sallama ile bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyonun ardından, tüpü girdap haline getirin ve daha fazla ayrışmayı teşvik etmek için beş mililitrelik bir pipet kullanarak dokuyu kuvvetlice ezin. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 x g santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, 300 mikrolitre sulandırılmış albümin ovomokoid inhibitör çözeltisinde steril bir tüpte 2.7 mililitre ABSS'ye bölün ve iyice karıştırın.

Sonra 150 mikrolitre DNAse çözeltisi ekleyin. Sentifüjasyonun ardından, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini taze hazırlanmış albümin ovomokoid inhibitörü ve DNAse çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Hücre peletini kırmak için iyice girdaplayın.

Daha sonra, hücre süspansiyonuna DNAse içermeyen üç mililitre sulandırılmış albümin ovomukoid inhibitörü çözeltisi ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında altı dakika boyunca 70 x g'da santrifüjleyin. Döndürme işleminden sonra, zar parçaları içeren süpernatanı çıkarın ve peleti tutun.

Ayrışmış omurilik hücrelerinden miyelini çıkarmak için, önce hücre peletini içeren tüpe sekiz mililitre oda sıcaklığında% 20 gradyan yoğunluklu ortam ekleyin ve hafifçe girdaplayın. Daha sonra, hücreleri 800 x g'da oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kırılmadan santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, çoğunlukla miyelin ve süpernatan içeren üst döküntü tabakasını dikkatlice aspire edin ve peleti bırakın.

Kalan yoğunluk gradyanını çıkarmak için, peleti HBSS ile seyreltilmiş sekiz mililitre cDMEM ile yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın. Hücreleri 400 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri daha önce olduğu gibi seyreltilmiş cDMEM ile yıkayın.

Süpernatanı çıkardıktan sonra, pelet hücreleri tohumlayana kadar buz üzerinde saklanabilir. Kaplama için hazır olduğunda, hücreleri 2-Merkaptoetanol ile takviye edilmiş 14 mililitre cDMEM içinde yeniden süspanse edin. Ve 12 oyuklu bir plakada her bir oyuğa bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.

Oyuk başına ortalama hücre sayısını ve kültürün mikroglial içeriğini belirlemek için kullanılabilecek plaka ekstra kuyucukları. Hücreler kaplandıktan sonra, hücreleri 35.9 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin. Kaplamadan sonraki gün olan 1. günde ortamı değiştirin.

Bazı hücreler kültür plakasına bağlanır, ancak yine de çoğunlukla yuvarlaktırlar. Ayrıca birçok yüzen hücre ve önemli döküntüler vardır. Hücreler 12 ila 14. günler arasında tedaviye hazır olana kadar ortam değişimini üç ila dört gün sonra tekrarlayın.

Yetişkin C57 siyah altı fareden alınan karışık glial hücreler, 37 santigrat derece veya 35.9 santigrat derecede kültürlendi ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Gördüğünüz gibi, bu sıcaklıklarda toplam hücre popülasyonlarında belirgin bir fark yoktur. Bu temsili grafikler, daha önce gösterilen toplam hücre popülasyonlarından izole edilen CD45 pozitif CD11b pozitif mikroglia popülasyonlarını göstermektedir.

Bu şekil, karışık glialar 37 santigrat derece yerine 35.9 santigrat derecede kültürlendiğinde daha yüksek bir mikroglial içerik elde edilebileceğini göstermektedir. Erişkin omurilik, karışık glial kültürler C67 siyah altı fareden hazırlandı. Kültürlenmiş hücrelerin bir, dört, sekizinci ve 12. günlerdeki temsili görüntüleri gösterilir.

Kültürün tipik ilerleyişini göstermenin yanı sıra medyanın önemini de gösteren görüntüler, kültür kuruluşundan sonraki ilk gün değişiyor. Bir kez ustalaştıktan sonra, karışık glia hücre kültürünün ilk kurulumu, uygun şekilde gerçekleştirilirse yaklaşık dört saat içinde tamamlanabilir. Karışık glia kültürünün kurulmasını takiben, mikroglia tükenmiş ve mikroglia ile zenginleştirilmiş kültürler bu ilk karışık popülasyondan elde edilebilir.

Bununla birlikte, kültürler oluşturmak için çok sayıda omurilik kullanılmadıkça, mikroglia ile zenginleştirilmiş hücrelerin verimi sınırlı olacaktır. Bu teknik başlangıçta nöropatik ağrının gelişimi sırasında glial hücrelerin rollerini araştırmak için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, yetişkin omuriliğindeki patolojik değişiklikleri içeren diğer nörolojik hastalıkları incelemek için kullanılabilir.