Name: Squid pigmentlerin çıkarılması için bir yöntem Doryteuthis pealeii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Keşfedin Doryteuthis pealeii mürekkep balığı kromatoforlarından nanoyapılı granüller içindeki pigmentlerin çıkarılması yöntemini. Bu teknik, renk değişimi mekanizmalarını anlamak ve sentetik uyarlanabilir renk sistemleri tasarlamak için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Üniversite Enstrümantasyon Merkezi de dahil olmak üzere New Hampshire Üniversitesi'ndeki tesislerin kullanımını minnetle kabul ederler. Bu çalışma New Hampshire Üniversitesi Kimya Bölümü tarafından desteklenmiştir.

Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde düzenlenmiş değildir, burada yapılan omurgasız hayvan çalışmaları; Bu nedenle Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, protokollerin incelenmesi için yetkisi yoktur. Bu ABD&#39;de düzenlemenin yetki alanına giren değil yerine, yazarlar burada bu çalışmalar samimi etik kullanımı konusunda çaba, özen ve bu hayvanların tedavi, birey sayısı minimize edilmiş ve bu çabaların ile yapılmıştır devlet olduğunu Basel Bildirgesi ve Laboratuar Hayvan Uluslararası Bilim Konseyi (ICLAS) etik kurallarına uyum içindedir. 1. Doryteuthis pealeii (D pealeii) Diseksiyon <ol><li> Satın alma decapitated kalamar D. Woods Hole, MA Marine Biological Laboratory at Deniz Kaynakları Bölümü veya herhangi bir taze balık pazarından pealeii. yuvarlanabilir veya daha önce bu prosedürü uygulamak için değiştirilmiş olan örnekleri kullanmayın. Özellikle, kromatophore tabakası hala örnek üzerinde bozulmamış olmalıdır. <ol><li> Hayvanlar hemen kullanılmazsa, kullanılana kadar -20 ° C&#39;de saklayın. örnekleri defrost için, diseksiyon önce 1 saat boyunca oda sıcaklığında su koyun. </li></ol></li><li> hayvanın arka tarafı boyunca kesilmiş paslanmaz çelik düz ince nokta diseksiyon makas, kullanma. ventral manto üssünde başlayın ve yüzgeç bölgede biter. </li><li> forseps diseksiyon ve diseksiyon makas kullanarak bağ dokusu kesilmesi ile kaldırarak iç organların (mide, solungaç, mürekkep bezi, üreme organları, sistemik kalp ve brakiyal kalp) tüm çıkarın. Bir örnek torbaya organları atın. </li><li> Standart 11-1 / 2&#39;de (fin tarafı) manto pin T-işaretçilerine diseksiyon kullan &quot;x 7-1 / 2&quot; x 1-1 / 2 &quot;esnek bir diseksiyon pedi içeren alüminyum diseksiyon tava. doku Batmak bir tek kullanımlık polistiren vakum filtrasyon sistemi ile filtre edilmiş deniz suyu 250 ml0.2 um gözenek boyutlarına ihtiva etmektedir. </li><li> Dikkatle bozulmamış chromatophore içeren cilt tabakası tutarak, diseksiyon forseps ile epidermal deri tabakası (opak renk) çıkartın. epidermal tabaka kaldırıldıktan sonra, bir numune torbasına atın. </li><li> forseps ve diseksiyon makas ile chromatophore tabakasının küçük (1 cm x 1 cm) bölümleri parçalara ayır. 1.5 ml mikro santrifüj tüplerine numune toplamak (disseke doku ile her boş tüpün yarısını doldurun). </li><li> tüpler içeren dokuya süzülmüş deniz suyu 500 ul ekle. Numuneler 4 ° C&#39;de gece boyunca saklanır. </li></ol> 2. Ayırma chromatophore Pigment Granül <ol><li> Doku sindirimi <ol><li> Papain / kolajenaz hazırlanması <ol><li> Kağıt tartmak kollajenaz 30 mg ve 4 &quot;x 4&quot; düşük azot kullanarak papain 5 mg tartın. bir vida kapaklı 50 ml&#39;lik bir polipropilen santrifüj tüpü içine bu aktarın. </li><li> deioniz 10 ml ölçünBir dereceli pipet kullanarak ed su. papain / kollajenaz içeren flakon doğrudan ekleyin. çözelti kadar yüksek ayarda Vortex açıktır. </li></ol></li><li> Hücre dışı Doku Çıkarma <ol><li> x g 5 dakika 14,000 Aşama 1.7 toplanan chromatophore doku santrifüjleyin. Bir plastik atık kovaya deniz suyunun üst tabaka atın. </li><li> P1000 değişken hacimli tek kanallı mikropipet kullanarak doku papain / kollajenaz çözüm 500 ul ekleyin. En yüksek ayarda 1-2 dakika boyunca her bir örnek Vortex. </li><li> çevreleyen doku hücreleri ayırmak için 40 kHz&#39;lik bir frekansta 5 dakika boyunca numune sonikasyon. </li><li> 14.000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. Bir plastik atık kovaya süpernatant atın. </li><li> x g 5 dakika 14,000 toplanan chromatophore doku santrifüjleyin. Bir plastik atık kovaya deniz suyunun üst tabaka atın. bir kez daha tekrarlayın. </li><li> El ile kalan geniş doku sn kaldırmakBir sonraki adıma geçmeden önce forseps ile bu süreçte sindirimi yoktu leri. </li></ol></li></ol></li><li> Pigment granüller Yalıtımlı <ol><li> Homojenizasyon tamponu hazırlanması <ol><li> 2.38 g tartılır (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit) (HEPES, 100 mM), magnezyum klorür (10 mM), potasyum-aspartat 0.856 g (50 mM) 0.095 gr, 0.015 g ditiyotireitol (1 mM). bir vida kapaklı 150 ml&#39;lik bir polistiren kap içine aktarın. Ticari bir küçük tablet proteaz önleyici. </li><li> Bir dereceli silindir kullanarak, iyonu giderilmiş su, 100 ml ölçün. homojenizasyon tuzlar içeren kabın doğrudan ekleyin. çözelti kadar Vortex açıktır. </li></ol></li><li> Pigment Granül homojenizasyon <ol><li> 5 dakika boyunca 14.000 xg&#39;de adım 2.1 her bir örnek santrifüj. Bir plastik atık kovaya süpernatant atın. Bu örnek dışı doku geçersiz olmalıdır. </li><li> Ekle 500# 181; 1-2 dakika her biri için her bir tüp ve vorteks homojenizasyon tamponu iyice örnekleri karıştırın. 30 dakika (~ 40 kHz) numuneler sonikasyon ve 14,000 x g &#39;de santrifüj 5 dakika ile takip edin. </li><li> Bir plastik atık kovaya supernatant atmak ve chromatophore sakkuluslar ve protein hayvan iplerini tam sindirim sağlamak için önceki adımı 2-3 kez tekrarlayın. Geri kalan çözelti, açık sarı bir süpernatan ve izole pigment granülleri içeren kırmızı renkli bir pelet içermelidir. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Pigment Ekstraksiyon <ol><li> Asidik metanol preparasyonu (HCl-MeOH) <ol><li> Dikkatle 5 ml metanol (MeOH) konsantre (36,5-38% (w / w)), hidroklorik asit (HCI) 25 ul ekle. bir vida kapaklı bir cam numune şişesine HCl-MeOH çözeltisi saklayın. eşit çözüm karıştırmak için hafifçe döndürün. NOT: Daha fazla asidik çözelti, daha pigment fi sırasında çıkartılacaktırilk çıkarma. </li></ol></li><li> Pigment Ekstraksiyon <ol><li> 14.000 xg&#39;de 5 dakika boyunca (2.2.2) pigment granül süspansiyonu Santrifüj ve bir plastik atık kovaya süpernatant atın. </li><li> HCl-MeOH çözeltisi 500 ul ilave edin ve 3-4 dakika ~ için her bir örnek girdap. 10 dakika boyunca (~ 40 kHz) numuneler sonikasyon, daha sonra 14,000 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Bir transfer pipeti kullanarak, bir 1 dramlık vidalı kapaklı cam şişede supernatant toplamak. süpernatant rengi koyu kırmızı olmalıdır. </li><li> başka bir renk (~ 4-5 yıkar) ekstre kadar çıkarma adımı 3.2.2 tekrarlayın. NOT: Her çıkarma ~ pigment 1.5 ml verecektir. Geri kalan renksiz bir pelet pigmenti ekstre granüller olup. Not: renksiz granül ve ekstre pigmentler iki sonraki kullanıma kadar 4 ° C sıcaklıkta su içinde saklanabilir. </li></ol></li></ol> Ekstraksiyon Süreci boyunca 4. Karakterizasyonu <ol><li> Tarama ElECTRON Mikroskopi <ol><li> ekstraksiyon işlemi saflığını doğrulamak için taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak (adım 2.2.1 ve pigment ekstre adım 3.2.3 dan girmemiş) Görüntü granülleri. </li><li> 14.000 xg&#39;de 5 dakika boyunca görüntüleme, ilk santrifüj hem reaksiyona girmemiş granül ve pigment çıkarılan granüller granül örnekleri hazırlamak ve bir plastik atık kovaya süpernatant atmak için. 1 ml etanol ve mevduat bir transfer pipet kullanarak alüminyum SEM taslakları üzerine granül süspansiyonu 2-3 damla bu yeniden askıya. </li><li> gece boyunca örnekleri kurutulduktan sonra 15 mil bir kaplama elde etmek 3 dakika için altın, platin kaplamalı kat püskürtmeyle çökeltilmesi. </li><li> Bir Schottky verici ve bir ikincil elektron dedektörü ile bir SEM ile görüntü. 5-7 kV ışını gerilim ve görüntüye 8 ve 9 mm, bu malzemeler arasında bir çalışma mesafesi kullanın. </li></ol></li><li> Ultraviyole-Görünür (UV-Vis) Spektrofotometrik Ölçümler <ol><li> absorbans pro Monitör200-800 nm bir çift ışın spektrofotometre kullanılarak 3 koşulları için dosyaları (2.2.2 girmemiş granül, 3.2.3 çıkarılan pigment ve 3.2.4 pigment çıkarılan granül). </li><li> reaksiyona girmemiş granüller ve pigment ekstre granüller için 1 ml&#39;lik bir küvete deiyonize su kullanılarak boş bir ölçüm toplayın. Her iki numune için UV-Vis absorpsiyon spektrumları toplayın. </li><li> ekstre pigment için 1 ml&#39;lik bir küvete asidik metanol çözeltisi kullanılarak boş bir ölçüm toplayın. numune için UV-Vis absorpsiyon spektrumu toplayın. </li><li> Soğurma tepe noktasının maksimum görece yüksekliğe ulaşır dalgaboyunu tanımlayarak Her numunenin maksimum bir dalga boyuna belirler. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bell, G. R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+radial+muscle+fibers+anchor+in+flexible+squid+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebr+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatophore radial muscle fibers anchor in flexible squid skin.</a> Invertebr Biol. 132 (2), 120-132 (2013).</li>
<li>Crookes, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflectins%3A+The+unusual+proteins+of+squid+reflective+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reflectins: The unusual proteins of squid reflective tissues.</a> Science. 303 (5655), 235-238 (2004).</li>
<li>Deravi, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-function+relationships+of+a+natural+nanoscale+photonic+device+in+cuttlefish+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">The structure-function relationships of a natural nanoscale photonic device in cuttlefish chromatophores.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (93), 1-9 (2014).</li>
<li>Mäthger, L. M., Denton, E. J., Marshall, N. J., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+behavioural+functions+of+structural+coloration+in+cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and behavioural functions of structural coloration in cephalopods.</a> J. R. Soc. Interface. 6 (2), 149-163 (2009).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+basis+for+camouflaged+polarized+light+communication+in+squid%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Anatomical basis for camouflaged polarized light communication in squid.</a> Biol. Lett. 2 (4), 494-496 (2006).</li>
<li>Mäthger, L. M., Hanlon, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malleable+skin+coloration+in+cephalopods%3A+selective+reflectance%2C+transmission+and+absorbance+of+light+by+chromatophores+and+iridophores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Malleable skin coloration in cephalopods: selective reflectance, transmission and absorbance of light by chromatophores and iridophores.</a> Cell Tissue Res. 329 (1), 179-186 (2007).</li>
<li>Cloney, R. A., Brocco, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatophore+Organs%2C+Reflector+Cells%2C+Iridocytes+and+Leucophores+in+Cephalopods%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Chromatophore Organs, Reflector Cells, Iridocytes and Leucophores in Cephalopods.</a> Amer. Zool. 23 (3), 581-592 (1983).</li>
<li>Hanlon, R. T., Messenger, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+coloration+in+young+cutttlefish+%28Sepia+officinalis+L%29-+The+morphology+and+development+of+body+patterns+and+their+relation+to+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adaptive coloration in young cutttlefish (Sepia officinalis L)- The morphology and development of body patterns and their relation to behaviour.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 320 (1200), 437-487 (1988).</li>
<li>Sutherland, R. L., Mäthger, L. M., Hanlon, R. T., Urbas, A. M., Stone, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cephalopod+coloration+model.+II.+Multiple+layer+skin+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">Cephalopod coloration model. II. Multiple layer skin effects.</a> J. Opt. Soc. Am. 25 (8), 2044-2054 (2008).</li>
<li>Florey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+function+of+cephalopod+chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Amer.+Zool%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and function of cephalopod chromatophores.</a> Amer. Zool. 9 (2), 429-442 (1969).</li>
<li>Florey, E., Kriebel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+mechanical+responses+of+chromatophore+muscle+fibers+of+squid%2C+Loligo+opalescens%2C+to+nerve+stimulation+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vergl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrical and mechanical responses of chromatophore muscle fibers of squid, Loligo opalescens, to nerve stimulation and drugs.</a> Z. Vergl. Physiol. 65 (1), 98-130 (1969).</li>
<li>Williams, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Phenoxazone-Based+Pigments+to+the+Structure+and+Function+of+Nanostructured+Granules+in+Squid+Chromatophores%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Contributions of Phenoxazone-Based Pigments to the Structure and Function of Nanostructured Granules in Squid Chromatophores.</a> Langmuir. , (2016).</li>
<li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ommochrome+pigmentation+of+the+linea+and+rosa+seasonal+forms+of+Precis+coenia+%28Lepidoptera%3A+Nymphalidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ommochrome pigmentation of the linea and rosa seasonal forms of Precis coenia (Lepidoptera: Nymphalidae).</a> Arch. Insect. Biochem. Physiol. 36 (3), 215-222 (1997).</li>
<li>Van Den Branden, C., Decleir, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Study+of+the+Chromatophore+Pigments+in+the+Skin+of+the+Cephalopod+Sepia+Officinalis%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Biol.+Jb.+Dodonaea%22%5BJournal%5D)">A Study of the Chromatophore Pigments in the Skin of the Cephalopod Sepia Officinalis.</a> L. Biol. Jb. Dodonaea. 44 (2), 345-352 (1976).</li>
<li>Aubourg, S., Torres-Arreola, W., Trigo, M., Ezquerra-Brauer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Jumbo+Squid+Skin+Pigment+Extract+and+its+Antioxidant+Potential+ina+Marine+Oil+System%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Jumbo Squid Skin Pigment Extract and its Antioxidant Potential ina Marine Oil System.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 118 (0), (2016).</li>
</ol>

Açıklayacak hiçbir şeyimiz yok.

Bu kalamar chromatophore granüllerden pigmentlerin elde etmek için bir yöntem gösterilmiştir. Özellikle granülleri hedefleyerek, hedefimiz adaptif renklenmeye aracılık rollerini tespit etmektir. Bu yöntem toplu doku örnekleri 14 veya dondurularak kurutulmuş bir cilt 15 kullanılarak cephalopod pigmentler karakterize etmek için tasarlanan önceki raporlarda farklıdır. Bu protokol, chromatophore pigmentler ekstre etkili olsa da, küçük reaksiyon ölçekler ile sınırlıdır. Bir ...

Bu tür kalamar, mürekkepbalığı ve ahtapot gibi kafadan bacaklılar dinamik kamufle ve sinyalizasyon için kendi görünümünü değiştirmek için yeteneği var. 1-6 Bu özellik kromatoforların olarak bilinen pigmentli organların seçici alansal genişleme kısmen destekleniyor. 4,7-9 kromatoforların vardır onlar harekete geçirilir gibi kas lifleri tarafından radyal demirlemiş bir cytoelastic sacculus içinde sınırlı nano yapılı pigment granüllerinin bir ağ ihtiva yumuşak aktüatörler. 1,3, kromatoforlar organı boyunca granülleri dağıtmak sunulan yüzey alanı% 500 genişletin. 3,7 Bu işlem, kromatoforların bir dizi üzerinden birbiriyle uyumlu olduğunda, 10,11, hayvanın genel rengi değiştirilir. Bu pigment granülleri bu renk değişikliğine neden olduğu bilinmekle birlikte, bunların bileşimi bilinmemektedir. Bu izole edilmesi ve gelecekteki kompozisyon çalışmalar için uyarlanabilir chromatophore pigmentler saflaştırmak için bir prosedür açıklanmaktadır. 3,12 chromatophore içeren doku kafadanbacaklı itibaren dikkatli çıkarıldıktan ile hasat edilir. Bir sindirim ve homojenizasyon işlem daha sonra chromatophore hücreleri çevreleyen doku ayırmak ve ayırmak için kullanılır. nano yapılı granüller tekrar sonifikasyon ve santrifüjlemeden kullanılarak geri kalan kromatoforların den daha sonra izole edilir ve saflaştırılır. Saflaştırma üzerine, pigmentler, asidik metanol solüsyonları kullanılarak kelebek kanatları görünür renk ekstre uyarlanmış olan bir işlemde granüller elde edilir. 13 tarama elektron mikroskobu (SEM) ve spektrofotometri chromatophore pigmentler kullanarak başarılı şekilde ekstre onaylamak için kullanılan bu süreç. Bu yöntem, C moleküler katılım keşfetmek için kullanılan chromatophore granüller izolasyonunu anlatmaktadıroloration Kafadanbacaklılarda içinde. Bütün hayvanlardan 12 Küçük molekül ekstraksiyon genellikle uzun ve sıkıcı bir süreç olabilir. Buradaki amaç Kafadanbacaklılarda içinde nanoyapılı granüllerden pigmentlerin edinimi için etkili ve kolay protokolün gelecek araştırmacıları bilgilendirmektir.

<table><tbody><tr><td>Kollajenaz</td><td>Alfa Aesar</td><td>9001-12-1</td><td>Tehlike yok</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3482-12-3</td><td>Tahriş edici, akut toksisite</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td>Hafif tahriş edici</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>EMD Kimyasalları</td><td>7647-01-0</td><td>Aşındırıcı</td></tr><tr><td>k-Aspartat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1115-63-5</td><td>Reaksiyona Girer oksidanlarla şiddetli</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Hafif gözü tahriş edici</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>67-56-1</td><td>Son derece yanıcı</td></tr><tr><td>Mini tablet prtoease inhibitörü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>469315-90-01</td><td>Metal ve cilt için aşındırıcı</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-73-4</td><td>Tahriş edici&nbsp;</td></tr></tbody></table>

squid pigmentlerin çıkarılması için bir yöntem<em&gt; doryteuthis pealeii</em

A Method for Extracting Pigments from Squid Doryteuthis pealeii

Kafadanbacaklılar, algılama, iletişim, savunma ve üreme amaçları için dermal renklenmede hızlı ve uyarlanabilir değişikliklere uğrayabilir. Bu yetenekler kısmen kromatoforlar olarak bilinen pigmentli organların alansal genişlemesi ve geri çekilmesi ile desteklenir. Kromatoforların bağlı bir pigmentli granül ağı içerdiği bilinmesine rağmen, yapı-işlev özellikleri tam olarak detaylandırılmamıştır. Kalamar Doryteuthis pealeii kromatoforlarındaki nanoyapılı granülleri izole etmek için bir yöntem açıklıyoruz ve bunlarla ilişkili pigmentlerin asidik çözücülerde nasıl ekstrakte edilebileceğini gösteriyoruz. Bunu başarmak için, kromatofor içeren dermal tabaka önce yüzeysel bir diseksiyon kullanılarak manuel olarak izole edilir ve pigment granülleri sonikasyon, santrifüjleme ve yıkama döngüleri kullanılarak çıkarılır. Saflaştırılmış granüller içinde hapsedilen pigmentler daha sonra asidik metanol çözeltileri yoluyla ekstrakte edilir ve görünür renkten yoksun daha küçük çaplara sahip nanoyapılar bırakır. Bu ekstraksiyon prosedürü, granüllerden izole edilen% 58'lik bir çözünür pigment verimi üretir. Bu yöntem kullanılarak, kromatofor pigmentlerinin bileşimi belirlenebilir ve kafadanbacaklılarda adaptif renklenme mekanizması hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir.

Kromatoforlar D. disseke edilir pealeii dorsal manto (Şekil 1A, 1B). Bunlar kaldırıldıktan sonra, kromatoforlar lize edildi ve pigment granülleri (Şekil 2A, 2B) üzerinden izole etmek için santrifüj ve yıkama döngüleri kullanılarak saflaştırılır. Asidik metanol solüsyonları (HCl-MeOH) çözülebilir pigment özü ve çözünmeyen, renksiz bir pigment ekstre granüller hasıl granüller (Şekil 2C) i...

Kalamar Doryteuthis pealeii kromatoforlardaki nano yapılı granüllerden pigmentlerin çıkarılması için bir protokol verilmektedir.

Squid pigmentlerin çıkarılması için bir yöntem<em&gt; Doryteuthis pealeii</em

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities ...

Bu prosedürün genel amacı, taze olarak diseke edilmiş mürekkep balığı, Doryteuthis pealeii kromatoforlarının nano yapılı granülleri içinde bulunan pigmentlerin nasıl ekstrakte edileceğini açıklamaktır. Sefalopodlar, dermal renklerinde hızlı ve adaptif değişimler geçiren karmaşık deniz hayvanlarıdır.Buna rağmen, bu sistemlerin nasıl çalıştığına dair hala bilinmeyen pek çok nokta vardır. Bu tekniğin temel avantajı, kromatofor organdaki nano yapılı granülleri spesifik olarak hedeflemesidir. Bu durum, araştırmacıların nano ölçekte başlayan renk değişimi mekanizmasını aydınlatmalarına olanak sağlayacaktır.Sefalopod biyolojisine dair sağladığı içgörünün yanı sıra bu çalışma, önceden paketlenmiş pigmente nano-parçacıklar kullanarak sefalopodlarda görülen adaptif renk değişiminin dinamik aralığını taklit etmek üzere tasarlanmış sentetik sistemlerin geliştirilmesine bilgi sağlayabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, kromatofor dokusunun çevre dokulara yakınlığı nedeniyle saf kromatofor dokusu toplamanın zor olması sebebiyle güçlük çekmektedir. Bizim yöntemimiz, bu kontaminanları azaltmak için optimize edilmiştir.Diseksiyona başlamak için öncelikle diseksiyon kabına yaklaşık 250 mililitre filtrelenmiş deniz suyu dökün. Bir örneği kabın içine yerleştirin ve paslanmaz çelik düz ince uçlu makas kullanarak, ventral mantonun tabanından hayvanın posterior tarafı boyunca, yüzgeç bölgesinde sona erecek şekilde kesin. Diseksiyon pensi ile nazikçe kaldırarak ve bağ dokuyu makasla keserek tüm iç organları çıkarın.Organları bir numune torbasına atarak imha edin. Diseksiyon T iğnelerini kullanarak, mantonun yüzgeç tarafı yukarı gelecek şekilde diseksiyon pedine sabitleyin. Penset yardımıyla, kromatofor içeren deri tabakasını sağlam tutarak, opak epidermal deri tabakasını dikkatlice çıkarın.Epidermal tabakayı bir numune torbasına atın. Ardından, kromatofor tabakasını çıkarın. Kromatofor dokusunu bir santimetreye bir santimetrelik küçük bölümlere ayırın.Kesitleri 1,5 milliliter mikro santrifüj tüplerine yerleştirin ve her tüpü yarıya kadar diseke edilmiş doku ile doldurun. Son olarak, tüplere 500 microliters filtrelenmiş deniz suyu ekleyin. Pigment granüllerini izole etmek için, önce kromatofor doku kesitlerini 14, 000 x g hızında beş dakika boyunca santrifüjleyin.Deniz suyunun üst tabakasını atın. Örneklere 500 µL papain kollagenaz çözeltisi ekleyin ve en yüksek ayarda bir ila iki dakika boyunca vorteksleyin. Ardından, hücreleri çevre dokudan ayırmak için örnekleri 40 kHz'de beş dakika boyunca sonikasyona tabi tutun.14,000 x g hızda beş dakika daha santrifüjleyin ve ardından süpernatantı atın. Santrifüj işlemini, her seferinde süpernatantı atarak iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, kollajenaz içinde resüspansiyonu ekleyin.Devam etmeden önce, sindirilmemiş olan kalan büyük doku parçalarını bir pens yardımıyla manuel olarak çıkarın. Başlangıç granül çözeltisinin saflığı, pigment ekstraksiyonunu etkiler. Bu nedenle, başlangıç kromatofor materyallerinin tamamen sindirildiğinden emin olmak önemlidir.Granüllerin en saf popülasyonunu toplamak için yaklaşık bir santimetrelik doku kesitlerinin optimal olduğunu saptadık. 150 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüp alıp uygun miktarda HEPES, magnezyum klorür, potasyum aspartat ve ditiyotreitol ekleyerek homojenizasyon tamponunu hazırlayın. Bir adet ticari proteaz inhibitörü mini tableti ekleyin.Dereceli bir silindir kullanarak 100ml deiyonize su ölçün ve bunu homojenizasyon tuzlarını içeren tüpe ekleyin. Çözelti berraklaşana kadar karıştırmak için tüpü vorteksleyin. Doku örneklerini santrifüjleyin ve ardından süpernatantı atın.Her tüpe 500 µL homojenizasyon tamponu ekleyin ve tamamen karışması için 2 dakika boyunca vorteksleyin. Örnekleri 40kHz'de 30 dakika boyunca sonikasyon işlemine tabi tutun. Ardından örnekleri tekrar santrifüjleyin.Süpernatan atıldıktan sonra, hücre dışı dokunun tamamen sindirilmesini sağlamak için homojenizasyon eklemesi, sonikasyon ve santrifüjasyon işlemlerini iki ila üç kez tekrarlayın. Sonuç olarak tüp, açık sarı renkli bir süpernatan ve izole edilen pigment granüllerinden oluşan kırmızı renkli bir pelet içermelidir. Süpernatanı atın.İlk olarak, bir vidalı kapaklı cam numune tüpüne 5ml metanol ve 25mcL konsantre hidroklorik asit ekleyerek ekstraksiyon için asidik metanol hazırlayın. Karıştırmak için çözeltiyi hafifçe çalkalayın. Bir numune tüpünü kenara ayırın, bu tüp reaksiyon sonu granül işlemi için kullanılacaktır.Granül içeren ikinci bir tüpten homogenizasyon tamponunu uzaklaştırın. Kalan tüplere 500mcL asidik metanol çözeltisi ekleyin ve üç ila dört dakika boyunca vorteksleyin. Örnekleri 40kHz'de 10 dakika boyunca sonikasyon işlemine tabi tutun ve ardından 14000 x g'de beş dakika santrifüjleyin.Bir mikropipet kullanarak süpernatantı tek dramlık vidalı kapaklı cam bir şişeye toplayın. Bu pigmenttir ve rengi koyu kırmızı görünmelidir. Artık renk ekstrakte edilmeyene kadar süpernatantı toplayarak, asidik metanol ekleme, sonikasyon ve santrifüj adımlarını dört ila beş kez tekrarlayın.Geriye kalan renksiz pelet, pigmenti ekstrakte edilmiş granüllerdir. Görüntüleme için granül örneklerini hazırlamak üzere, öncelikle hem reaksiyona girmemiş granül alikotunu hem de pigmenti ekstrakte edilmiş granülleri 14000 x g'de beş dakika boyunca santrifüj edin, süpernatanı atın ve ardından her bir peleti 1ml %95 etanol içinde yeniden süspanse edin. Bir transfer pipeti kullanarak, her bir granül süspansiyonundan 2-3 damlayı ayrı bir alüminyum SEM stub üzerine yerleştirin.Numuneleri gece boyunca vakum altında kurumaları için desikatöre yerleştirin. 15 nanometrelik bir kaplama elde etmek için stub'ları 3 dakika boyunca altın platin ile püskürtme kaplama işlemine tabi tutun. Numuneleri bir taramalı elektron mikroskobu kullanarak görüntüleyin.Ardından, reaksiyona girmemiş granüllerin, ekstrakte edilmiş granüllerin ve ekstrakte edilmiş pigmentin absorbans profillerini toplamak için bir spektrofotometre kullanın. Temiz bir küvete 1ml deiyonize su ekleyerek granül örnekleri için kör ölçüm yapın. Kör örneği bir atık konteynerine boşaltın.Ardından, reaksiyona girmemiş pigment granüllerini içeren süspansiyonu küvete ekleyin. Granül örneği için UV-vis absorbsiyon spektrumlarını toplayın. 1mL asidik metanol ve temiz bir küvet kullanarak ekstrakte edilmiş pigment için ikinci bir kör ölçüm yapın.Son olarak, pigmentin UV vis absorbans spektrumunu alın ve ardından her bir örneğin maksimum dalga boyunu belirleyin. Taramalı elektron mikroskobu, pigment ekstraksiyon sürecinin granüllerin ortalama çapını azalttığını ortaya koymuştur. Ekstraksiyon öncesinde granüller 527.3nm ortalama çapa sahiptir.Asidik metanol işleminden sonra, bu boyut belirgin şekilde azalarak yaklaşık 202.6nm seviyesine iner. Bu azalmanın pigment ekstraksiyonundan kaynaklandığı düşünülmektedir. Asidik metanol ilavesiyle birlikte, reaksiyona girmemiş granüllerle ilişkili renk de gözle görülür şekilde azalır.Bu hipotezin doğrulaması spektrofotometri kullanılarak elde edilmiştir. Bu grafik, ekstraksiyon öncesi granüller için geniş bir absorbans profili ve ekstraksiyon sonrası granüller için benzer şekilde geniş ancak daha düşük yoğunluklu bir profil göstermektedir. Buna karşılık, çözünür ekstrakte pigment, yaklaşık 500nm'de bir lambda max ve yaklaşık 380nm'de belirgin bir omuz sergilemektedir.Toplamda bu veriler, granüllerden görünür rengin başarıyla ekstrakte edildiğini göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik başlangıçtan bitişe yaklaşık dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, ekstraksiyonu ve analizi engelleyebilecek yansıtıcı protein plaketleri içeren dokunun tamamen uzaklaştırıldığından emin olmak önemlidir.Epidermal doku, homojenizasyon basamaklarını ve pigment ekstraksiyonunu da engelleyebilir. Bu prosedürün ardından, pigmentleri daha fazla saflaştırmak ve bileşimlerini karakterize etmek için ince tabaka kromatografisi ve kütle spektrometrisi gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu basamaklar, sefalopodlarda renklenmeye olan moleküler katkıların aydınlatılmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem, deniz biyologları, kimyagerler ve mühendisler için şu temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Renk değişimi sırasında kullanılan pigmentlerin bileşimi nedir? Ve bu pigmentler, dermal kromatofor organlarındaki nano yapılı granüllerin fonksiyonuna ve yapısına nasıl katkıda bulunur? Bu videoyu izledikten sonra, taze diseke edilmiş mürekkep balığı, doryteuthis pealeii kromatoforlarından pigmentin nasıl ekstrakte edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-method-for-extracting-pigments-from-squid-doryteuthis-pealeii

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video, Hawaii kuyruğu kesik kalamar hemocytes (kan hücreleri) elde etmek için nasıl...

Hawaii Bobteylleri Squid Hemocytes Alınması Euprymna scolopes Ve Simbiyotik ve Non-Simbiyotik Bakteriler bağlılık Gözlem

Bu protokol, hafif hasat komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasını detaylandırır. Bu entegre zar proteinleri, klorofilleri ve karotenoidleri koordine eder ve daha yüksek bitkilerde ve yeşil alglerde ışığın toplanmasından sorumludur.

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

Bu makale, homojenizasyon ve sükroz gradyan santrifüjlemesi kullanılarak domuz/sığır retinasından ultrasantrifüjleme yoluyla fotoreseptör dış segment fragmanlarının (POS) saflaştırılması için protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, daha sonra -80 °C'de saklanabilen, etiketli veya etiketsiz büyük POS stoklarının hazırlanmasına izin verir.

Retina Pigment Epitel Hücreleri üzerinde Fagositoz Tahliller için Domuz veya Sığır fotoreseptör dış Kesimleri Büyük Ölçekli Arıtma

Bu biyo-deney, bir besleyici olarak benzer gıda matris kullanılarak, doğal konsantrasyonlarda deniz organizmalarının dokuların Organik özütlerden besleme-caydırıcı metabolitlerinin varlığını değerlendirmek için bir model yırtıcı balık kullanmaktadır.

Bir Balık-besleme Laboratuvar biyodeneyinde Deniz Organizmaların Dokular Sekonder Metabolitlerin Antipredatory Aktivite değerlendirmek için

Bu yazıda, su içinde yağ emülsiyonları göre hidrofobik pigmentler ile suda çözünür proteinler monte edilmesi için, basit ve yüksek verimli bir yöntem tarif eder. Biz Brassica bitkileri E. ifade rekombinant suda çözünür-klorofil dört varyant bağlayıcı proteinler (WSCPs) ile yerli klorofil montajında ​​yöntemin etkinliğini gösteren E. coli.

Petrol Emülsiyonlar Su: Hidrofobik Pigmentler ile Suda çözünür Klorofil bağlayıcı Proteinler Montaj için Yeni Bir Sistem

Bu çalışma, dijital görüntü analizi kullanarak Drosophila melanogaster'in karın pigmentasyonunu hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, fenotip edinimi ile veri analizi arasındaki usulleri düzene sokar ve numune montajı, görüntü toplama, piksel değeri çıkarımı ve kalitenin ölçülmesini içerir.

Karın Pigmentasyonunun Karaciğer Miktarında Nicelleştirilmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Burada, bir protokol fucoxanthin klorofil a/c proteinler (FCP) Diyatomlarla dan ayırmak ve onları uyarma enerji transferi iyon kompozisyon değişiklikleri üzerine çalışmaya doğal lipit kompozisyonları ile lipozomlar içine dahil mevcut.

İzole ve ışık-hasat antenler Diatom Cyclotella Meneghiniana lipozomlar Thylakoid lipidler ile gelen ekleme

Doliolidler, türleri Dolioletta gegenbauride dahil olmak üzere, dünya çapında üretken kıtaaltı raf sistemlerinde bulunan ekolojik önemi küçük jelatinimsi deniz zooplankton vardır. Bu hassas organizmaları kültüre çekmenin zorluğu araştırmalarını sınırlandırıyor. Bu çalışmada doliolid Dolioletta gegenbauri'nintoplanması, yetiştirilmesi ve bakımı için yetiştirme yaklaşımlarını açıklıyoruz.

Deneysel Çalışmalar için Deniz Pelajik Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) Yetiştiriciliği

Melanosit fonksiyonlarının düzenleyicileri, pigmentasyon sonucundaki gözle görülür farklılıkları yönetir. Aday pigmentasyon geninin moleküler fonksiyonunu deşifre etmek bir zorluk teşkil eder. Burada, adayları tanımlamak ve bunları melanin içeriği ve melanosit sayısının düzenleyicileri olarak sınıflandırmak için bir zebra balığı model sisteminin kullanımını gösteriyoruz.

Zebra Balığı Kullanarak Pigmentasyon Düzenleyicilerini Tanımlamak için Ters Genetik Yaklaşım

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Burada, Gracilaria gracilis'in entegre bir şekilde değerlendirilmesini amaçlayan birkaç protokolü açıklıyoruz: yabani türlerin toplanması, kurum içi büyüme ve biyoaktif bileşenlerin ekstraksiyonu. Ekstraktların antioksidan, antimikrobiyal ve sitotoksik etkileri, bütün deniz yosunu biyokütlesi ve pigmentleri ile zenginleştirilmiş gıdaların beslenme ve stabilite değerlendirmesi ile birlikte değerlendirilir.

Kırmızı Deniz Yosunu Gracilaria gracilis'in Biyorafineri Yaklaşımı ile Değerlendirilmesi

Keşfedin Doryteuthis pealeii mürekkep balığı kromatoforlarından nanoyapılı granüller içindeki pigmentlerin çıkarılması yöntemini. Bu teknik, renk değişimi mekanizmalarını anlamak ve sentetik uyarlanabilir renk sistemleri tasarlamak için temel oluşturur.

Squid pigmentlerin çıkarılması için bir yöntem

Daha fazla video keşfet