Squid pigmentlerin çıkarılması için bir yöntem Doryteuthis pealeii

Bu prosedürün genel amacı, taze disseke edilmiş kalamar, Doryteuthis pealeii kromatoforlarının nano yapılı granülleri içinde bulunan pigmentlerin nasıl çıkarılacağını açıklamaktır. Kafadanbacaklılar, dermal renklerinde hızlı ve uyarlanabilir değişiklikler geçiren karmaşık deniz hayvanlarıdır. ve dermal renklerinde uyarlanabilir değişiklikler.

Ancak, bu sistemlerin nasıl çalıştığı hakkında hala bilinmeyen çok şey var. Bu tekniğin temel avantajı, özellikle kromatofor organındaki nano yapılı granülleri hedef almasıdır. Bu, araştırmacıların nano ölçekte ortaya çıkan renk değişimi mekanizmasını aydınlatmalarını sağlayacaktır.

Kafadanbacaklı biyolojisine ilişkin içgörüye ek olarak, önceden paketlenmiş pigmentli nano parçacıklar kullanılarak kafadanbacaklılarda görüntülenen dinamik uyarlanabilir renk aralığını taklit etmek için inşa edilmiş sentetik sistemlerin tasarımını bilgilendirebilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, çevredeki dokuya yakınlığı nedeniyle saf kromatofor dokusunun toplanması zor olduğu için mücadele eder. Yöntemimiz bu kirleticileri azaltmak için optimize edilmiştir.

Diseksiyona başlamak için önce yaklaşık 250 mililitre filtrelenmiş deniz suyunu bir diseksiyon tavasına dökün. Tavaya bir örnek yerleştirin ve paslanmaz çelik düz ince uçlu makas kullanarak, hayvanın arka tarafı boyunca ventral mantonun tabanından kesin ve yüzgeç bölgesinde sona erer. Tüm iç organları diseksiyon forsepsleri ile nazikçe kaldırarak ve makas kullanarak bağ dokusunu keserek çıkarın.

Organları bir numune torbasına atın. Diseksiyon T pimlerini kullanarak, manto yüzgeci tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon pedine sabitleyin. Forseps ile, kromatofor içeren cilt tabakasını sağlam tutarak opak epidermal cilt tabakasını dikkatlice çıkarın.

Epidermal tabakayı bir numune torbasına atın. Ardından, kromatofor tabakasını çıkarın. Kromatofor dokusunu bir santimetreye bir santimetrelik küçük bölümler halinde kesin.

Bölümleri 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve her tüpü yarıya kadar diseke doku ile doldurun. Son olarak, tüplere 500 mikrolitre filtrelenmiş deniz suyu ekleyin. Pigment granüllerini izole etmek için, önce kromatofor doku bölümlerini 14.000 x g'da beş dakika santrifüjleyin.

Deniz suyunun üst tabakasını atın. Numunelere 500 mikrolitre papain kollajenaz çözeltisi ekleyin ve en yüksek ayarda bir ila iki dakika vorteksleyin. Daha sonra, hücreleri çevreleyen dokudan ayırmak için örnekleri 40 kHz'de beş dakika boyunca sonikleştirin.

14.000 x g'da beş dakika daha santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın. Santrifüjlemeyi iki kez daha tekrarlayın ve her seferinde süpernatanı atın. Ardından, yeniden süspansiyonu kollajenaz içinde ekleyin.

Devam etmeden önce sindirilmeyen kalan büyük doku bölümlerini manuel olarak çıkarmak için forseps kullanın. Başlangıç granül çözeltisinin saflığı, pigment ekstraksiyonunu etkiler. Bu nedenle, başlangıç kromatofor malzemelerinin tamamen sindirildiğinden emin olmak önemlidir.

Bir santimetre civarındaki doku kesitlerinin, en saf granül popülasyonunu toplamak için en uygun olduğunu bulduk. 150 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüp alarak ve uygun miktarda HEPES, magnezyum klorür, potasyum aspartat ve ditiotreitol ekleyerek homojenizasyon tamponunu hazırlayın. Bir ticari mini proteaz inhibitörü tableti ekleyin.

Dereceli bir silindir kullanarak, 100 ml deiyonize su ölçün ve homojenizasyon tuzlarını içeren tüpe ekleyin. Çözelti berraklaşana kadar karıştırmak için tüpü girdaplayın. Doku örneklerini santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.

Her tüpe 500 mikrolitre homojenizasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırmak için 2 dakikaya kadar vorteksleyin. Örnekleri 40kHz'de 30 dakika boyunca sonikleştirin. Ve sonra onları tekrar santrifüjleyin.

Süpernatanı attıktan sonra, hücre dışı dokunun tam sindirimini sağlamak için homojenizasyon ilavesini, sonikasyonu ve santrifüjlemeyi iki ila üç kez tekrarlayın. Son olarak, tüp açık sarı bir süpernatan ve izole edilmiş pigment granüllerinden oluşan kırmızı renkli bir pelet içermelidir. Süpernatanı atın.

İlk olarak, 5 ml metanol ve 25 mcL konsantre hidroklorik asit ekleyerek vidalı kapaklı bir cam numune aşağısında ekstraksiyon için asidik metanol hazırlayın. Karıştırmak için çözeltiyi hafifçe döndürün. Bir numune tüpünü bir kenara koyun, bu son reaksiyona giren granül muamelesi olacaktır.

Homojenizasyon tamponunu granül içeren ikinci bir tüpten çıkarın. Kalan tüplere 500 mcL asidik metanol çözeltisi ekleyin ve üç ila dört dakika girdap yapın. Örnekleri 40kHz'de 10 dakika boyunca sonikasyon yapın ve ardından 14000 x g'da beş dakika santrifüjleyin.

Bir mikropipet kullanarak, süpernatanı tek dram vidalı cam şişede toplayın. Bu pigmenttir ve koyu kırmızı renkte görünmelidir. Asidik metanol ilavesi, sonikasyon ve santrifüjleme adımlarını dört ila beş kez tekrarlayın ve daha fazla renk elde edilmeyene kadar süpernatanı toplayın.

Kalan renksiz pelet, pigment ekstrakte edilmiş granüllerdir. Görüntüleme için granül numuneleri hazırlamak için, önce hem reaksiyona girmemiş granül alikotunu hem de pigment ekstrakte edilmiş granülleri 14000 x g'da beş dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve ardından her peleti 1 ml% 95 etanol içinde yeniden süspanse edin. Bir transfer pipeti kullanarak, her bir granül süspansiyonundan 2-3 damla ayrı bir alüminyum SEM saplamasına yerleştirin.

Numuneleri gece boyunca vakum altında kuruması için desikatöre koyun. 15 nanometrelik bir kaplama elde etmek için saplamaları 3 dakika boyunca altın platin kaplama ile püskürtün. Numuneleri bir taramalı elektron mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

Ardından, reaksiyona girmemiş granüller, ekstrakte edilmiş granüller ve ekstrakte edilmiş pigment için absorbans profillerini toplamak için bir spektrofotometre kullanın. Temiz bir küvete 1 ml deiyonize su ekleyerek granül numuneleri için boş bir ölçüm yapın. Boşluğu bir atık kabına atın.

Ardından, reaksiyona girmemiş pigment granüllerini içeren süspansiyonu küvete ekleyin. Granül numunesi için UV vis absorpsiyon spektrumlarını toplayın. 1 mL asidik metanol ve temiz bir küvet kullanarak ekstrakte edilen pigment için ikinci bir boş ölçüm yapın.

Son olarak, pigment için UV vis emici spektrumunu alın ve ardından her bir numunenin maksimum dalga boyunu belirleyin. Taramalı elektron mikroskobu, pigment ekstraksiyon işleminin granüllerin ortalama çapını azalttığını ortaya koydu. Ekstraksiyondan önce, granüllerin ortalama çapı 527.3 nm'dir.

Asidik metanol prosedüründen sonra, bu boyut yaklaşık 202.6nm'ye önemli ölçüde azalır. Pigmentin ekstraksiyonundan kaynaklandığı düşünülen bir azalma. Asidik metanolün eklenmesi üzerine, reaksiyona girmemiş granüllerle ilişkili renk de gözle görülür şekilde azalır.

Bu hipotezin doğrulanması spektrofotometri kullanılarak elde edildi. Bu grafik, önceden ekstrakte edilmiş granüller için geniş bir absorbans profilini ve ekstrakte edilmiş granüller için benzer şekilde geniş ancak daha düşük yoğunluklu bir profili göstermektedir. Buna karşılık, çözünür ekstrakte edilen pigment, yaklaşık 500 nm'de bir lambda maks ve yaklaşık 380 nm'de belirgin bir omuz sergiler.

Toplu olarak, bu veriler granüllerden görünür rengin başarılı bir şekilde çıkarıldığını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik baştan sona yaklaşık dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, ekstraksiyon ve analize müdahale edebilecek yansıtıcı protein trombositleri içeren dokuyu tamamen çıkarmayı unutmamak önemlidir.

Epidermal doku ayrıca homojenizasyon adımlarına ve pigment ekstraksiyonuna müdahale edebilir. Bu prosedürü takiben, pigmentleri daha da saflaştırmak ve bileşimlerini karakterize etmek için ince tabaka kromatografisi ve kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu adımlar, kafadanbacaklılarda renklenmeye moleküler katkıların aydınlatılmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem, deniz biyologları, kimyagerler ve mühendisler için aşağıdakiler de dahil olmak üzere önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir: Renk değişimi sırasında kullanılan pigmentlerin bileşimi nedir? Ve dermal kromatofor organları içindeki nano yapılı granüllerin işlevine ve yapısına nasıl katkıda bulunurlar? Bu videoyu izledikten sonra, taze kesilmiş kalamar, doryteuthis pealeii kromatoforlarından pigmentin nasıl çıkarılacağını iyi anlamış olmalısınız.