Subretinal Space erişim için bir alternatif ve Onaylı Enjeksiyon Yöntemi

Bu çalışmanın genel amacı, farelerde viral vektörleri, farmakolojik ajanları veyale indüklenmiş pluripotent kök hücreleri subretinal boşluğa yönlendirmek için kullanılabilecek yeni bir subretinal enjeksiyon tekniğini tanımlamaktır. Bu yöntem, retinal dejenerasyonlar için yeni terapötik müdahalelerin etkinliğinin değerlendirilmesi gibi görme bilimi ve oftalmoloji alanlarındaki temel sorulara cevap verebilir. Bu tekniğin temel avantajı, materyallerin subretinal boşluğa yüksek etkinlikte, minimum hasarla ve retinal yapı ile fonksiyonun hızlı iyileşmesiyle iletilmesini sağlamasıdır.

Prosedürü, laboratuvarımdan teknisyen Sachin P gerçekleştirecektir. Bu prosedüre başlamak için, görüntülemeyi kolaylaştırmak amacıyla anestezi altındaki bir farenin bıyıklarını kesin ve hayvanın vücut sıcaklığını sirkülasyonlu bir su pedi ile 37 °C'de tutun. Ardından, göz bebeklerini %2,5'lik fenilefrin göz damlaları ile genişletin.

Ardından, kuruluğu önlemek ve anestezik kaynaklı geçici kataraktları en aza indirmek için metilselüloz göz damlaları uygulayın. Ameliyat öncesinde aletleri sterilize edin. Sonrasında, seyreltilmiş floreseni bir biyogüvenlik kabininde hazırlayın.

Şırıngayı uygun miktarda flüoresein ile doldurun. Ardından, hayvanın derin anestezi altında olduğundan emin olmak için ayak parmağına sıkıştırma testi yapın ve fareyi, enjeksiyon yapılacak göz yukarı bakacak ve disseksiyon mikroskobunda net bir şekilde görülecek şekilde konumlandırın. Temporal konjunktivayı ince uçlu bir pensle nazikçe sıkıştırın.

Ardından, kavisli Vannas makası kullanarak yaklaşık 90 derecelik çevreleyici bir insizyon yapın. Aynı prosedürü alttaki Tenon kapsülü üzerinde tekrarlayın. Bundan sonra, globu nazale doğru döndürürken çevreleyici bağ dokusunu ince uçlu pensetle rezeke edin.

Optik sinirden yaklaşık 0.5 milimetre uzaklıktaki enjeksiyon bölgesine doğru ilerleyin ve retro-orbital sinüsü bozmamaya büyük özen gösterin. Kritik bir adım, gözün kendisine veya ilişkili yapılara, özellikle orbital kan kesesine zarar vermeden gözün döndürülmesini gerektiren enjeksiyon bölgesinin açığa çıkarılmasıdır. Bu prosedürde, 22.5 derecelik bir oftalmik bıçakla göz çukurunu nazikçe çizerek enjeksiyon bölgesindeki skleraya küçük bir insizyon yapın.

Bu insizyon, iğne ucunun sklera arasından geçmesine izin verecek kadar büyük olmalıdır. Ardından, eğimli ucu retinaya paralel olacak şekilde konumlandırarak 33 gauge iğneyi sklerotomiye yerleştirin. Pistonu yavaşça ve eşit basınçla iterek istenilen miktarda %0,01 floresein enjekte edin.

İğne subretinal boşluktayken, pistonla basıldığında hafif bir direnç hissedileceğine dikkat edin. İğne retinayı delerse direnç oluşmaz, ancak iğne sklera veya RPE'ye nüfuz etmezse yüksek direnç hissedilir. Bir diğer kritik adım ise subretinal boşluğu hedefleyen enjeksiyondur.

Bu işlem, nörosensör retinayı delip vitreus boşluğuna ulaşmadan gerçekleştirilmelidir. Geri akışı en aza indirmek için iğneyi geri çekmeden önce birkaç saniye bekleyin. Ardından, gözü steril salinle durulayın ve gözün normal konumuna geri döndüğünden emin olun.

Ardından, enjeksiyon yapılan gözün kornea yüzeyine kalın bir tabaka üçlü antibiyotikli oftalmik krem uygulayın. Sonrasında, fareyi iyileşmesi için temiz ve tekli bir kafese yerleştirin. Anestezi sonrası iyileşme sürecinde solunumu ve vücut sıcaklığını izleyin ve sternal rekumbensi sürdürüp sürdüremediğini kontrol edin.

Ameliyat sonrası ağrı yönetimi için karprofenin deri altına enjeksiyonu da dahil olmak üzere uygun ek postoperatif izleme ve tedavi işlemleri gerçekleştirin. Burada, enjeksiyon bölgesindeki kubbe şeklindeki blebin 3D rekonstrüksiyonu yer almaktadır. Kubbe şeklindeki bleb, retina dekolmanının kapsamını ve sınırlarını göstermek için yoğun beyazla doldurulmuştur.

OCT'den elde edilen retinal kesitler beyaz renkte görülürken, RPE ve fotoreseptör seviyesindeki sıvı dolu alan siyah görünmektedir. Bu şekilde, maksimal retinal ayrılmanın olduğu bölgedeki temsilci OCTB taramaları; enjeksiyon öncesi, enjeksiyondan 10 dakika sonrası ve enjeksiyondan dört hafta sonrası için gösterilmiştir. Bu görüntü, 0,3 µL'lik bir enjeksiyon sonucu oluşan düz bir blebin oluşumunu ve çözünmesini göstermektedir.

Ve bu görüntü 0,5 µL'lik bir enjeksiyondan kaynaklanan kubbe şeklinde bir bleb oluşumunu ve çözünmesini gösterirken, bu görüntü ise 1 µL'lik bir enjeksiyondan kaynaklanan kubbe şeklinde bir bleb oluşumunu ve çözünmesini göstermektedir. Son olarak, burada enjeksiyon bölgesinde şiddetli koroid skarlaşması ve retinal incelmenin bir örneği yer almaktadır. Bleb çözünmesinden sonra retinalar normal fonksiyonlarını korur.

Dokuz farklı aydınlatma yoğunluğunda, 0,3 µL, 0,5 µL ve 1 µL'lik enjeksiyonlar için enjeksiyon öncesi ve enjeksiyondan dört hafta sonraki skotopik çubuk aracılı yanıtların dalga formları gösterilmiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik göz başına 10 ila 15 dakikada tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, işleme başlamadan önce gözlerin sağlık durumunun değerlendirilmesi önemlidir.

Kornea veya lens opaklıkları olan gözleri ya da bu prosedürün uygulanmasının çok zor olacağı derin yerleşimli gözleri hariç tutun. Bu prosedürü takiben, enjeksiyonun kalitesini değerlendirmek amacıyla OCT ve fundus görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir.