Name: Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Öğrenin, odacıklı coverglass modeli kullanarak balgam ve antibiyotiklere yanıt olarak biyofilm gelişimini görselleştirmeyi ve nicelendirmeyi. Bu yöntem, antibiyotik etkinliğini ve konak faktörlerinin etkisini anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TB Kistik Fibrozis Kanada araştırma bursu kabul eder.

Araştırma Etik Kurulu (REB) toplamak ve insan denekler gelen balgam örnekleri saklamak için gerekli olduğunu unutmayın. Bu çalışmalar Sick Children REB # 1000019444 için Hastanesi tarafından kabul edildi. 1. Hazırlama CF Balgam Örnekleri <ol><li> kistik fibroz kliniğine rutin ziyaretler sırasında hastaların balgam örneği toplayın ve buz üzerinde tutmak. </li><li> işleme geçmesi, araştırma laboratuarına, koleksiyonun ilk saat içinde buz üzerinde balgam örneği taşıyın. </li></ol> 2. Balgam İşleme <ol><li> Elde edilen balgam örneğinin hacmini kaydedin. Örnek (örneğin, 2 parça PBS, 1 kısım örnek) hacminin 2x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ekleyin. </li><li> Bir transfer pipet yardımıyla iyice örnek karıştırın. Vortex 1 dk tamamen karıştırmak için en yüksek ayarda örnek. </li><li> Kısım uygun sayı, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler içine yukarıdaki karışımın 1 ml ve 5.000 xg aşağı doğru döndürün4 ° C&#39;de 20 dakika. </li><li> santrifüj sonrasında, süpernatant kaldırmak ve pelet atın. </li><li> Filtre 0.22 um&#39;lik bir filtreden süpernatantı steril ve temiz bir mikrosantrfuj tübüne birikir. NOT: süzüntü sterilite LB agar kaplama ve sıvı ortamları aşılayarak test edilir. </li><li> ileride kullanmak üzere, -80 ° C&#39;de, balgam süpernatant saklayın. NOT: Balgam birden hastalar da filtrasyon aşağıdaki havuza edilebilir dan. </li><li> Balgam Süzüntü, 1/10 hac / hac istenen medyada (balgam 100 ul, ortam 900 ul) seyreltilmiş, kullanılmadan önce. NOT: Burada, standart lizojeni suyu (LB) ortamı kullanılmıştır. </li></ol> Biyofilm Oluşumunun 3. odacıklı coverglass Yöntemi <ol><li> (200 rpm) çalkalanarak 37 ° C&#39;de arzu edilen ortam ilgi gece boyunca bakteriyel izolatı büyütün. Not: Farklı bakteri çok sayıda kullanılmış, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus klinik izolatlarının dahil,Burkholderia cepacia karmaşık ve Achromobacter xylosoxidans. ortam seçimi Ancak LB ortamı ilk uygulamalar için kullanılabilir suşları ve ilgi koşullara bağlıdır. </li><li> Gecelik kültürden taze ortam 4 ml kültür, 40 ul koyun ve yaklaşık olarak 0.5, 600 nm (OD 600) de optik yoğunluğu ile bir kültür elde etmek için (200 rpm) çalkalanarak 37 ° C&#39;de 3-4 saat boyunca büyümeye -0.6. </li><li> % 10 balgam süzüntü ya da (kontrol olarak) balgam filtrattan olmadan istenilen medyada 1/5 adım 3.2 kültürünü sulandırmak. Balgam filtre bulunan konsantrasyonu test edilebilir (örneğin,% 50 ya da% 100). </li><li> slayt odaları kuyu tohum seyreltme 200 ul kullanın. </li><li> Bakteriler çalkalamadan 37 ° C&#39;de 4 saat eklemesini sağlar. </li><li> 4 saat sonra, medyayı çıkarın ve yavaşça 1x taze medya ile biyofilm yıkayın. 200 ul taze medya ile değiştirin. NOT: biyofilm üzerindeki fres balgam etkilerini araştırmakh medya balgam süpernatant içermelidir. </li><li> biyofilm mikroskopi için saatine kadar yıkama olmadan Ortam her 12 saat yerine, sallayarak olmadan 37 ° C&#39;de zaman istenilen miktarda büyümeye olanak sağlar. NOT: biyofilm antibiyotik duyarlılık balgam Süpernatantları etkisini incelemek için, antibiyotikler biyofilm büyüme 24 saat aşağıdaki ortama ilave edilir ve boyama ve biyofilm görüntüleme kadar medyada muhafaza edilir. </li></ol> 4. Boyama Biyofilmler ve Konfokal Mikroskop <ol><li> İstenilen büyüme süresi (24-48 saat en iyi şekilde çalışır) ardından, oda kuyulardan ortamını çıkarın ve yavaşça steril PBS 300 ul ile iki kez her odasına yıkayın. </li><li> gerekli çözeltinin her ml (canlılık kitte sağlanan), her boyanın 1 ul karıştırılarak biyofilm boyama karışım hazırlayın. Su veya ortam çözelti içinde boya sağlayın. NOT: Su üretici tarafından tavsiye edilmektedir. </li><li> bölmeli covergla her bir kuyu için boya karışımının 200 ul eklep, 45 dakika süreyle karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edin ve. </li><li> odalarından boyama karışımı çıkarın ve steril PBS 300 ul her bir yıkama. PBS çıkarın ve tatlı su ya da medya ile değiştirin. </li><li> konfokal mikroskobu ile biyofilm görselleştirme ile devam edin. </li></ol> 5. Konfokal Mikroskop ile biyofilm görselleştirme <ol><li> hemen (1 saat içinde) boyandıktan sonra odalarına lekeli biyofilm okuyun. Bir seferde 2 8-kuyu odalarına 1 boyanarak slaytların görselleştirme gecikmeyi en aza indirmek. </li><li> edinimi için uyarma ve filtre setleri için lazerler ile konfokal mikroskop kullanılarak görüntüleme gerçekleştirin. NOT: Burada, spektral borealis lazerler ile dönen disk konfokal sistemi (Yeşil: 491nm, Kırmızı: 561 nm) uyarma için kullanılmıştır. 515/40 ve 624/40 emisyon filtre setleri biyofilm canlılığı kiti lekeleri görselleştirmek için kullanılmıştır. </li><li> kamera ile konfokal mikroskop bir 25X su objektif kullanarak fotoğraf çekmek. </li><li&gt; Kullan Z-Yığınları biyofilm modeli. Her 0.5-1 mikron biyofilm son olarak odak çerçeveye ilk odak düzlemi başlayarak görüntü almak (genellikle 30-80 mikron 48 saat biyofilm kapsayan) </li><li> her bir kuyunun 3-5 görüntüleri çekmek. NOT: Böylece 8 de odacıklı coverglass için, 24-40 görüntüleri oluşturulur. </li><li> Analiz için görüntüleri kaydedin. NOT: OME-TIFF dosyalarını COMSTAT 18,19 kullanılarak analiz edilecek şekilde Görüntüler kaydedilmesi gerekir. biyofilm görüntü analizi için talimatlar http://www.comstat.dk/ adresinde bulunabilir. görüntüleri ithal edildikten sonra, bu tür her kanala (kırmızı ve yeşil) için ortalama kalınlığı, biyokütle ve yüzey kapsama gibi parametreler analiz edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Beaudoin, T., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+with+biofilm+formation%3A+selection+of+antimicrobials+and+role+of+prolonged+antibiotic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.Infect.Dis.J%22%5BJournal%5D)">Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy.</a> Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+microbial+life+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).</li>
<li>Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giving+structure+to+the+biofilm+matrix%3A+an+overview+of+individual+strategies+and+emerging+common+themes%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.Rev%22%5BJournal%5D)">Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes.</a> FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).</li>
<li>Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mini-review%3A+Microbial+coaggregation%3A+ubiquity+and+implications+for+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development.</a> Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).</li>
<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation%3A+a+clinically+relevant+microbiological+process%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process.</a> Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The in vivo biofilm.</a> Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).</li>
<li>Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+basis+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance.</a> Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-specific+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm-specific antibiotic resistance.</a> Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm-specific+antibiotic+resistance+gene+ndvB+is+important+for+expression+of+ethanol+oxidation+genes+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clonal+strains+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+in+Ontario%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada.</a> Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).</li>
<li>Vidya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+infection+phenotypes+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+associated+with+failure+of+eradication+in+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis.</a> Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).</li>
<li>Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+caused+by+mucA+mutations+result+in+activation+of+TLR2+in+addition+to+TLR5+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).</li>
<li>Beaudoin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+level+of+p38alpha+mitogen-activated+protein+kinase+activation+in+airway+epithelial+cells+determines+the+onset+of+innate+immune+responses+to+planktonic+and+biofilm+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.Infect.Dis%22%5BJournal%5D)">The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa.</a> J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).</li>
<li>LaFayette, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis-adapted+quorum+sensing+mutants+cause+hyperinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.Adv%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses.</a> Sci.Adv. 1 (6), e1500199(2015).</li>
<li>Staudinger, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditions+associated+with+the+cystic+fibrosis+defect+promote+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Respir.Crit.Care+Med%22%5BJournal%5D)">Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).</li>
<li>Kennedy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Tobramycin+against+Cystic+Fibrosis+Isolates+of+Burkholderia+cepacia+Complex+Grown+as+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).</li>
<li>Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+High-Dose+Antimicrobials+on+Biofilm+Growth+of+Achromobacter+Species+Isolated+from+Cystic+Fibrosis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients.</a> Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).</li>
<li>Heydorn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).</li>
<li>Vorregaard, M. Comstat2 - a modern 3D image analysis environment for biofilms
 . <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVorregaard%2C+M+%22Informatics+and+Mathematical+Modelling%22">Informatics and Mathematical Modelling</a>. , Technical University of Denmark. Kongens Lyngby, Denmark. (2008).</li>
<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Biofilm+Formation+in+an+8-well+Chamber+Slide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide.</a> J. Vis. Exp. (47), e2481(2011).</li>
</ol>

Bu tarifnamede tarif edilen yöntemler eksojen ürünlerin mevcudiyetinde büyütülen bakteri biyofilmlerin görselleştirme için izin verir. bu tip bir sistem kullanılıyorsa Beklendiği gibi, exoproducts üretimi önem taşımaktadır. Örneğin, Ditiyotreitol (DTT), genellikle örnekleri sıvılaştırılması yardımcı insan balgam kullanılır. Bununla birlikte, tek başına DTT etkisi biyofilm gelişimi ve canlılığı azaltılmış olur (veriler gösterilmemiştir). Bu durumda, tüm koşullar için uygun kontrol gereklidir. Ayrıca, insan tükürük ürünle...

Bakteri biyofilmleri birbirlerine bağlanmış ve bir öz salgılanan matris kaplı olan mikroorganizmaların gruplarıdır. 1,2 Klasik olarak, fiziksel olarak akış koşulları altında meydana gelen bir abiyotik veya biyotik yüzeye bağlı bakteri temsil etmektedir. Biyofilmler, aynı zamanda bu tür test tüplerinde oluşan ısı havuzları veya ince zarlar hava-sıvı arayüzü itibarıyla yüzeylerin statik koşullar altında (akış olmaması) ve distal, büyümeye gösterilmiştir. Onlar biyolojik kirlenme, paslanma ve tıkanmalara neden su rezervuarları veya borularda oluşabilir gibi bu biyofilm uzun, endüstriyel prosesler için büyük bir kayba ortamında tanınan ve vardır oylandı. 3,4 Onlar kateter ile ilişkili enfeksiyonlar, kistik fibroz hastalarında akciğer enfeksiyonları, yanı sıra çok sayıda diğer enfeksiyonlarda rol gösterilmiştir olarak biyofilm, aynı zamanda sağlık ortamlarında kritik önem taşımaktadır. Biyofilm enfeksiyonlarının işaretlerinden 5,6 biri de olanBakterilerin antibiyotiklere duyarlılığının katlanmış ve doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından açıklığı engelli. Biyofilm tabanlı enfeksiyonu kapsayan 7-9 en iyi okudu, klinik olarak anlamlı senaryolar kronik Pseudomonas aeruginosa biyofilm bulaşmış kistik fibrozis (KF) olan hastalarda ortaya çıkar. P. aeruginosa çok zor tedavi yapmak, kronik enfeksiyon kurulması sırasında bir dizi değişiklik uğrayabilir. 10,11 Biyofilmler farklı olarak doğuştan gelen bağışıklık etkinleştirmek ve inflamasyonu sürebilirim. Bu enfeksiyonlar KF hastalarında artmış morbidite ve mortalite neden 12-14 gibi, bu bağlamda biyofilm gelişimini etkileyen faktörleri anlamak önemlidir. Yeni yapılan bir çalışmada konak faktörleri P. aeruginosa biyofilm agrega oluşumunda kritik olduğunu göstermektedir. 15 Bu biyofilm antibiyotik ve konak savunma mekanizmaları indirgenmiş duyarlılık katkıda bulunur. preseörneğin nötrofil elastaz gibi CF akciğer mikroorganizmaların salgılanan ürünler olarak ev sahibi türevli faktörlere nce, büyük ölçüde biyofilm oluşumunu ve gelişimini modüle potansiyeline sahiptir. 16 Ayrıca, biyofilm sayısız yolların ifadesini modüle ve inflamasyonu başlatmak için ev sahibi ile etkileşim. Böyle standart kristal viyole deneyi olarak yüksek kapasiteli yöntemleri, biyofilm süreci ile ilgili olarak bazı bilgiler sağlayabilir iken, bu faktörlere yanıt olarak biyofilm görselleştirme daha derinlemesine bilgi sağlar. Bu yazıda in vitro biyofilm gelişimini incelemek için KF&#39;li hastaların balgam faktörlerini kullanmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, bir ticari biyofilm canlılığı kiti kullanılarak balgam içeren konak faktörlerine maruz kalan biyofilm hızlı görselleştirme sağlar. Bu teknik, görsel exogeno mevcudiyetinde biyofilm büyüme sırasında oluşan değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilirUS ürünleri ve çeşitli koşullar altında biyofilm gelişme değişiklikleri analiz etmek için geliştirilmiş bir yöntemi temsil eder.

<table><tbody><tr><td>Lab-Tek II Odacıklı kapak camı, # 1.5 borosilikat, 8 kuyulu</td><td>Thermo Sicher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer Canlı/Ölü Biyofilm Viabilty Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>Kanlı agar plakaları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R10215</td><td>CFU sayımları veya innokülasyon için koloni seçimi yoluyla canlılığın doğrulanması</td></tr><tr><td>COMSTAT</td><td>Availble yazılımı çevrimiçi</td><td></td><td>COMSTAT, biyofilm görüntülerini analiz etmek için kullanılan bir yazılımdır. Mevcut www.comstat.dk&nbsp;</td></tr><tr><td>Millers LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780-052</td><td>Gece boyunca gowth/biyofilm büyümesi için standart ortam</td></tr><tr><td>Millex-GV Şırınga Filtreleri</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td>Balgam süpernantlarının filtrelenmesi</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>Ortam çıkarıldıktan sonra biyofilm odalarının yıkanması</td></tr><tr><td>Zeiss AxioVert 200M</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu C9100-13 EM-CCD</td><td>QS Teknolojileri A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektral Borealis</td><td>Qs Teknolojileri A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Volocity</td><td>QS Teknolojileri A.Ş.</td><td></td><td>Bu yazılım için talimatlar şu adreste bulunabilir: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf</td></tr></tbody></table>

bir odacıklı coverglass modeli kullanılarak biyofilm kalkınma sputum etkilerinin görselleştirme

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biyofilmler kendinden salgılanan matris kaplı bakteri gruplarından oluşur. Bu endüstriyel kirlenme hem de bir çok sağlık ile ilgili enfeksiyonların gelişmekte ve önemli bir rol oynamaktadır. insan hastalığında en iyi tarif ve çalışılan biyofilm biri kistik fibroz hastalarının kronik akciğer enfeksiyonu meydana gelir. konak bağlamında biyofilm öğrenim görürken, birçok faktör biyofilm oluşumunu ve gelişimini etkileyebilir. Ev sahibi faktörleri biyofilm oluşumunu ve gelişimini etkileyen nasıl tespit etmek amacıyla, balgam yüzer şeklinde bir ev sahibi türevli faktör varlığında, biyofilm büyümeye statik odacıklı coverglass yöntemi kullanılmıştır. Bakteri odalarına tohumlanmış ve balgam süzüntüler maruz kalmaktadır. büyüme 48 saat sonra, biyofilm önce konfokal mikroskopi ve analiz için ticari bir biyofilm canlılığı kiti ile boyandı. Görüntü alınmasının ardından, biyofilm özellikleri farklı yazılım platformları kullanarak değerlendirilebilir.Bu yöntem antibiyotikler de dahil olmak üzere, farklı maddelerin varlığında biyofilm büyüme önemli özelliklerini görselleştirmek sağlar.

Deney genel tasarımı, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Bu protokolün kullanılması farklı zaman aralıklarında (örneğin, 24, 48 veya 72 saat) için yetiştirilen biyofilm değişiklikleri görselleştirmek için uygun bir yöntem sağlar. Önemli bir şekilde, örneğin, balgam süzüntüler gibi dış sinyaller, biyofilm gelişme değişiklikleri görselleştirmek için ilave edilebilir. Şekil 2&#39;de de görüldüğü gibi,% 10, balgam süzülen maddelerin varlığı biyofilm mi...

Bu protokol, bir slayt odası modeli kullanılarak konak faktörlerine maruz kaldıktan sonra biyofilm gelişiminin görselleştirilmesini açıklar. Bu model, biyofilm gelişiminin doğrudan görselleştirilmesinin yanı sıra bilgisayar yazılım programları kullanılarak biyofilm parametrelerinin analizine olanak tanır.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Bu prosedürün genel amacı, balgam ve antibiyotiklere yanıt olarak biyofilmlerde meydana gelen değişiklikleri görselleştirmek ve nicelleştirmektir. Bu yöntem, çeşitli antibiyotiklerin bakteriyel biyofilmlere karşı etkinliğinin balgam varlığından nasıl etkilenebileceği gibi temel soruları anlamak için araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Bu metodolojinin temel avantajı, bireylerin farklı faktörlere yanıt olarak biyofilmlerde meydana gelen değişiklikleri görmesine olanak tanımasıdır.Deneye başlamak için, daha önce elde edilen balgam örneğinin hacmini kaydedin. Örnek hacminin iki katı kadar fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin. Ardından, örneği tamamen karıştırmak için bir transfer pipeti kullanın.Karışımın tamamen homojenleşmesi için örneği en yüksek ayarda bir dakika boyunca vorteksleyin. Karışımdan bir mililitreyi 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine paylaştırın. Ardından tüpleri santrifüjleyerek çöktürün.Santrifüj işleminin ardından süpernatantı saklayın ve peleti atın. Süpernatantı 0.22 mikronluk bir filtreden geçirerek sterilize edin ve temiz bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Balgam süpernatantını gelecekte kullanmak üzere 80 degrees Celsius'ta saklayın.Önceden hazırlanmış kültürden 40 µL'yi, dört mL taze Luria besiyerine veya LB besiyerine ekleyin ve bakterileri 600 nm'de 0,55 optik yoğunluğa ulaşana kadar büyütün. Ardından, 0,5 OD'lik kültürden 100 µL'yi, LB içinde hazırlanmış %10'luk sputum filtratlarının 400 µL'si ile seyreltin. Lam odacıklarının kuyucuklarını ekmek için bu seyreltiden 200 µL kullanın. Bakterilerin 37 °C'de, çalkalamadan dört saat boyunca yapışmasını sağlayın.Dört saat sonra, besiyerini uzaklaştırın ve biyofilmi 1X taze LB ile nazikçe yıkayın. Kalan besiyerini 200 µL taze LB ile değiştirin. Biyofilmlerin 37 °C'de, çalkalama yapmadan büyümesine izin verin. Biyofilm mikroskobi için hazır olana kadar, yıkama yapmadan her 12 saatte bir besiyerini yenileyin. Bağlı bakterileri yerinden oynatmamak için lamları nazikçe yıkamak çok önemlidir.Büyümenin ardından, ortamı hazne kuyucuklarından uzaklaştırın ve her bir hazneyi 300 µL steril PBS ile nazikçe iki kez yıkayın. Ardından, biyofilm boyama karışımını hazırlamak için, gereken her 1 mL çözeltiye viabilite kitinde sağlanan her bir boyadan 1 µL ekleyin ve çözeltiyi karıştırın. Optimal boya miktarı ve boyama süresi, her organizma için ampirik olarak belirlenir.Hazneli lam örtü camının her bir kuyucuğuna 200 µL boyama karışımı ekleyin. Lam örtü camını inkübe edin. İnkübasyon sonrası, boyama karışımını haznelerden uzaklaştırın ve her bir kuyucuğu 300 µL steril PBS ile yıkayın.PBS'yi taze besiyeri ile değiştirin. Son olarak, konfokal mikroskopi ile görselleştirmeye geçin. Sadece besiyerinde veya %10 balgam filtratları varlığında, hazneli lamel camda 48 saatlik büyüme sonrası Burkholderia cepacia kompleksinin veya BCC klinik izolatlarının temsili görüntüleri, bunların varlığının biyofilm mimarisini değiştirebileceğini göstermektedir.Görüntüler, %10 balgam ile tedavi edildiğinde arttığı gözlemlenen ortalama biyofilm kalınlığı dahil olmak üzere temel biyofilm parametrelerini elde etmek için Comstat yazılımı ile analiz edildi. Farklı faktörlerin biyofilm büyümesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek amacıyla, klinik izolatlar sadece besiyerinde veya balgam ile birlikte büyütüldü ve her iki grup da antibiyotik ile veya antibiyotik olmadan tedavi edildi. Bu videoyu izledikten sonra, bölmeli lamel camlar üzerinde biyofilmlerin nasıl oluşturulacağı ve tedavi edileceği ile bunların boyama ve konfokal analiz için nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

visualizing-effects-sputum-on-biofilm-development-using-chambered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu kağıt büyüyen farklı yöntemleri açıklar.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Bu makalede, 8 kuyu odasına slayt içinde yetişen bir bakteriyel biyofilm oluşumu ve görselleştirme için prosedürü anlatılmaktadır.

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

Kaynak: Beaudoin, T. ve diğerleri. Balgamın biyofilm gelişimi üzerindeki etkilerini odalı bir örtü cam modeli kullanarak görselleştirmek. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, kistik fibrozis hastasından kaynaklanan balgam konak faktörlerinin bakteriyel biyofilm gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için odalı bir örtü camının kullanımını göstermektedir.

In vitro bakteriyel biyofilm oluşumu için odalı bir kapak cam yöntemi

Kaynak: Beaudoin, T. ve diğerleri. Balgamın biyofilm gelişimi üzerindeki etkilerini odalı bir örtü cam modeli kullanarak görselleştirmek. J. Vis. Exp. (2016)Bu video, hastadan kaynaklı kistik fibroz balgamının bakteriyel biyofilm oluşumunu nasıl etkilediğini değerlendirmek için in vitro bir yöntemi göstermektedir. Oda slaytları, floresan boyama ve konfokal mikroskopi kullanılarak, balgamla yetiştirilen biyofilmlerde kalınlığın arttığını, mimarinin değiştiğini ve daha yüksek canlı biyokütleyi...

Kistik Fibroz Hastalarından Balgam Filtratları Tarafından İndüklenen Bakteriyel Biyofilmlerin Konfokal Görüntülemesi

Gözenekli ortamı taklit eden mikroakışkan bir cihazda biyofilm oluşumunun incelenmesi için protokoller tartışılmaktadır. Mikroakışkan cihaz, bir dizi mikro sütundan oluşur ve bu cihazda Pseudomonas floresanları tarafından biyofilm oluşumu incelenir.

Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Bu çalışma, biyofilm inhibitörlerini ve bunların Bacillus subtilis çok hücrelilik üzerindeki etkilerini incelemek için tekrarlanabilir metodolojilerin geliştirilmesini sunmaktadır.

Araştırma yöntemleri<em&gt; B. subtilis</emKüçük Molekül Biyofilm İnhibitörleri Karakterizasyonu için Bir Model Olarak&gt; Biyofilmler

mukus kistik fibrozis solunum yolları (CF) hastalarının mikrobiyal patojenler gelişmek için ideal bir ortam vardır takılı. el yazması onlar kimyasal koşulların hastalığı ve nasıl değişikliklere neden taklit mikrobiyal dinamikleri harekete geçirebilir bir ortamda CF akciğer mikrobiyomu eğitimi için yeni bir yöntem tarif eder.

WinCF Modeli - Bir Mukus bir Ucuz ve Çekilebilir Microcosm Akciğer İnfeksiyonları Mikrobiyoloji Eğitim için bronşiole Takıldı

Bu protokol ana bilgisayar fizyolojik koşullar altında Candida albicans biyofilm oluşumu görselleştirmek için özelleştirilebilir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanımını açıklar.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Biz derleme işlemi, tarif ve gerçek zamanlı akış iken altında görüntü mantar biyofilm oluşumu için bir akış cihazları temizlik tasarlanmış. Biz de sağlamak ve elde edilen görüntülerde kullanılmak üzere sayısal algoritmalar tartışıyorlar.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanılabilir.

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Öğrenin, odacıklı coverglass modeli kullanarak balgam ve antibiyotiklere yanıt olarak biyofilm gelişimini görselleştirmeyi ve nicelendirmeyi. Bu yöntem, antibiyotik etkinliğini ve konak faktörlerinin etkisini anlamak için kullanılır.

Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme

Daha fazla video keşfet