Bir odacıklı coverglass Modeli Kullanılarak Biyofilm Kalkınma Sputum Etkilerinin görselleştirme
14 Aralık 2016
Bu protokol, bir slayt odası modeli kullanılarak konak faktörlerine maruz kaldıktan sonra biyofilm gelişiminin görselleştirilmesini açıklar. Bu model, biyofilm gelişiminin doğrudan görselleştirilmesinin yanı sıra bilgisayar yazılım programları kullanılarak biyofilm parametrelerinin analizine olanak tanır.
Bu prosedürün genel amacı, balgam ve antibiyotiklere yanıt olarak biyofilmlerdeki değişiklikleri görselleştirmek ve ölçmektir. Bu yöntem, araştırmacılar tarafından bakteriyel biyofilmlere karşı çeşitli antibiyotiklerin etkinliğinin balgam varlığından nasıl etkilenebileceği gibi temel soruları anlamak için kullanılabilir. Bu metodolojinin temel avantajı, bireylerin farklı faktörlere yanıt olarak biyofilmlerde meydana gelen değişiklikleri görmelerine izin vermesidir.
Deneye başlamak için, daha önce elde edilen balgam örneğinin hacmini kaydedin. Fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin, numunenin hacminin iki katını ekleyin. Ardından, numuneyi iyice karıştırmak için bir transfer pipeti kullanın.
Numuneyi tamamen karıştırmak için en yüksek ayarda bir dakika boyunca vorteksleyin. Karışımın bir mililitresini 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine alın. Ardından tüpleri aşağı doğru döndürün.
Santrifüjlemenin ardından, süpernatanı kaydedin ve peleti atın. Filtre, süpernatanı 0.22 mikronluk bir filtreden sterilize eder ve temiz bir mikrosantrifüj tüpünde toplar. Balgam süpernatantını ileride kullanmak üzere 80 santigrat derecede saklayın.
Önceden hazırlanmış 40 mikrolitre kültürü dört mililitre taze Luria suyuna veya LB ortamına yerleştirin ve bakterileri 600 nanometrede 0.55 optik yoğunluğa sahip bir kültür elde etmek için büyütün. Daha sonra, 100 mikrolitre 0.5 OD kültürünü, LB'de 400 mikrolitre hazırlanmış% 10 balgam filtratına seyreltin. Slayt odalarının kuyularını tohumlamak için 200 mikrolitre seyreltme kullanın. Bakterilerin sallanmadan 37 santigrat derecede dört saat boyunca yapışmasına izin verin.
Dört saat sonra, ortamı çıkarın ve biyofilmi 1X taze LB ile nazikçe yıkayın. Kalan ortamı 200 mikrolitre taze LB ile değiştirin. Biyofilmlerin sallanmadan 37 santigrat derecede büyümesine izin verin. Biyofilm mikroskopi için hazır olana kadar ortamı yıkamadan her 12 saatte bir değiştirin. Bağlı bakterileri bozmamak için slaytları nazikçe yıkamak çok önemlidir.
Büyümeyi takiben, ortamı hazne kuyularından çıkarın ve her hazneyi 300 mikrolitre steril PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, biyofilm boyama karışımını hazırlamak için, ihtiyaç duyulan her mililitre çözeltiye canlılık kitinde sağlanan her boyadan bir mikrolitre ekleyin ve çözeltiyi karıştırın. Optimal boya miktarı ve boyama süresi, her organizma için ampirik olarak belirlenir.
Odacıklı kapak camının her bir oyuğuna 200 mikrolitre boyama karışımı ekleyin. Kapak camını inkübe edin. İnkübasyondan sonra, boyama karışımını odalardan çıkarın ve her bir kuyuyu 300 mikrolitre steril PBS ile yıkayın.
PBS'yi yeni ortamla değiştirin. Son olarak, konfokal mikroskopi ile görselleştirmeye devam edin. Burkholderia cepacia kompleksinin veya BCC klinik izolatlarının temsili görüntüleri, odacıklı kapak camında tek başına ortamla veya %10 balgam filtratlarının varlığında 48 saatlik büyümenin ardından, varlıklarının biyofilmin mimarisini değiştirebileceğini göstermektedir.
Görüntüler, %10 balgam ile muamele edildiğinde artan biyofilmin ortalama kalınlığı da dahil olmak üzere temel biyofilm parametrelerini elde etmek için Comstat yazılımı ile analiz edildi. Farklı faktörlerin biyofilm büyümesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, klinik izolatlar sadece ortamda veya balgamla büyütüldü ve antibiyotikli veya antibiyotiksiz tedavi edildi. Bu videoyu izledikten sonra, odacıklı kapak camı üzerinde biyofilmlerin nasıl oluşturulacağını ve işleneceğini ve bunları boyama ve konfokal analiz için nasıl hazırlayacağınızı iyi anlamalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, bir lam odacığı modeli kullanarak balgam ve antibiyotiklere yanıt olarak gelişen biyofilmin görselleştirilmesini ve miktarının belirlenmesini açıklamaktadır. Bu model, biyofilm değişikliklerinin doğrudan gözlemlenmesini kolaylaştırır ve bilgisayar yazılımları kullanılarak detaylı analiz yapılmasına olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Biyofilm araştırmaları
- Antibiyotik etkinliği
Arka Plan
- Biyofilmler, mikroorganizmalardan oluşan karmaşık topluluklardır.
- Biyofilmle antibiyotik yanıtının anlaşılması, tedavi stratejileri için kritik öneme sahiptir.
- Balgam, antibiyotiklerin biyofilmler üzerindeki etkinliğini etkileyebilir.
- Bu çalışma, söz konusu etkileşimleri etkili bir şekilde görselleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Balgam ve antibiyotik maruziyetine bağlı biyofilm değişimlerini görselleştirmek.
- Konakçı faktörlerinin biyofilm gelişimi üzerindeki etkisini nicelleştirmek.
- Antibiyotiklerin biyofilmlere karşı etkinliğine dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Balgam örneklerinin toplanması.
- Balgamın fosfat tamponlu salin (PBS) ile dilüsyonu.
- Homojenlik için örneklerin karıştırılması.
- Lam odacığı modeli kullanılarak biyofilm gelişiminin görüntülenmesi.
Temel Sonuçlar
- Antibiyotiklere yanıt olarak biyofilm değişikliklerinin doğrudan görüntülenmesi.
- Biyofilm parametrelerinin kantitatif analizi.
- Sputum ve biyofilm yanıtı arasındaki etkileşime dair bilgiler.
- Farklı antibiyotiklerin etkinliğinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Slayt haznesi modeli, biyofilm dinamiklerini incelemek için etkilidir.
- Sputum gibi konak faktörleri biyofilm davranışını önemli ölçüde etkiler.
- Bu metodoloji, gelecekteki antibiyotik tedavi stratejilerine bilgi sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Konak kaynaklı balgam ve antibiyotiklerin varlığında biyofilm gelişiminin kantitatif görselleştirilmesi, anti-enfektif keşfi ve translasyonel model sadakati açısından kritik bir zorluğu ele almaktadır. Bu yaklaşım, konak faktörlerinin antibiyotik etkinliğini ve biyofilm mimarisini nasıl modüle ettiğini ortaya çıkararak mekanistik risk azaltma sağlar ve erken aşama hedef doğrulaması ile tarama stratejilerine bilgi sunar. Yöntem, enfeksiyöz hastalıklar Ar-Ge'sindeki portföy kararları için öngörüsel güvenilirlik sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Konak faktörünün biyofilm direnci üzerindeki etkisine ilişkin terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Hastalıkla ilgili matrislerde biyofilmin antibiyotiklere verdiği yanıtı nicelendirerek biyolojik risk azaltımını destekler.
- Belirli koşullar altında biyofilm canlılığını ve mimarisini ölçerek fonksiyonel hedef doğrulamasını kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Klinik olarak ilgili faktörlerin varlığında, sonraki bileşik taramaları için valide edilmiş biyofilm sistemleri hazırlar.
- Deneysel kollar arasında tekrarlanabilirlik ve nicel karşılaştırma için analiz koşullarını standardize eder.
- Güvenilir bileşik değerlendirmesi için biyofilm kalınlığı ve canlılık gibi sağlam, nicel çıktılar üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- İn vitro biyofilm modellerini hastalıkla ilgili konakçı ortamlarıyla uyumlu hale getirerek translasyonel sürekliliği artırır.
- Antibiyotik performansını karmaşık biyolojik matrislerde ortaya çıkararak riskle uyumlu ilerlemeyi destekler.
- Öngörücü risk azaltma için konakçı-patojen-ilaç etkileşimlerine dair mekanistik içgörüler sağlar.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu hazneli lamel modeli, konakçı-mimetik biyofilm sistemlerinde antibiyotik etkinliğinin hipotez odaklı test edilmesine olanak tanıyarak, keşiften preklinik aşamaya uzanan sürekliliğe entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Konak faktörü etkilerine dair hipotezlerin test edilmesini ve biyofilm gelişimindeki yolakların aydınlatılmasını destekler.
- Tarama: Biyofilm ortamlarında bileşik önceliklendirmesi için tekrarlanabilir, kantitatif okumalar sağlar.
- Analitik: Koşullar arası karşılaştırma için görüntü tabanlı ölçümler ve istatistiksel çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hastalıkla ilgili matrisleri dahil ederek, in vitro bulguları preklinik modellere aktarır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Anti-biyofilm stratejilerinin tekrarlı değerlendirmesi için standartlaştırılmış, uyarlanabilir bir platform sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Anti-enfektif Ar-Ge çalışmalarında öngörücü güveni artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Biyofilm analizlerinin standartlaşmasını, tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
- Stratejik Değer: Bağlama bağlı ilaç etkinliğini ortaya çıkararak devam/durdur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Konakçı-mimetik sistemlerdeki performansa dayalı olarak adayların riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Biyofilm kültürü, konfokal mikroskopi ve kantitatif görüntü analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Hazneli lam sistemlerine, canlılık boyama kitlerine ve Comstat gibi analitik yazılımlara erişim gereklidir.
- Numune hazırlama ve görüntüleme protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı bakteriyel türler veya konakçı kaynaklı matrisler için adaptasyon gerektirebilir.
- Her organizma için boyama ve görüntüleme parametrelerinin ampirik optimizasyonuna bağlıdır.
