Interrenal steroidogenik Doku ve Zebra balığı Onun Vasküler Mikroçevre görselleştirme
December 21st, 2016
Zebra balığı interrenal bezi memeli adrenal bezin teleostean karşılığıdır. Enzimatik aktivite deneyi, gelişmekte olan Zebra balığı farklılaşmış steroidogenik hücreleri tespit; Bu protokol 3-β hidroksisteroid dehidrojenaz (3β-Hsd Δ 5-4 izomeraz) nasıl gerçekleştirileceği tanıtır.
Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan zebra balığında farklılaşmış interrenal steroidojenik hücreleri, basit bir tam montajlı enzimatik aktivite testi ile tespit etmektir. Bu boyama prosedürü, interrenal bez oluşumu ve malformasyonunun moleküler ve hücresel mekanizmaları ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu boyama testinin ana avantajı, hızlı, basit ve güvenilir olmasıdır, bu da onu zebra balıklarında genetik veya kimyasal taramalar için güçlü bir araç haline getirir.
Bu prosedür, aynı embriyodaki birden fazla dokunun analiz edilebilmesi için böbreği ve kan damarlarını işaretleyen transjenik floresan raportör hatları üzerinde gerçekleştirilebilir. Vibratom kesiti, immünohistokimya ve konfokal mikroskopi ile birlikte, interrenal dokunun vasküler mikroçevresi de görüntülenebilir. Metin protokolüne göre üç beta-Hsd aktivite boyaması için stok çözeltileri hazırladıktan sonra, pigment oluşumunu engellemek için gelişmekte olan zebra balığı embriyolarını yumurta suyuna% 0.03 PTU içinde yerleştirin.
Dekoryonlu embriyoları veya larvaları, PBS'de% 0.1 Tween 20 veya PFAT ile% 2 veya% 4 PFA'da sabitleyin. PBST ile embriyoları her biri 10 dakika boyunca dört kez yıkayın ve numunelerin yıkamalar arasında kurumamasını sağlayın. Boyama reaksiyonlarından önce, A ve B parçalarını ayrı tüplerde taze olarak hazırlayın, ardından çözeltileri girdaplayın ve santrifüjleyin.
A ve B parçalarının ayrı tüplerde hazırlanması esastır. Tüm bileşenleri doğrudan tek bir tüpe eklemek, hemen şiddetli yağışlara neden olacaktır. İyice karıştırın ve hemen sabit ve yıkanmış embriyoları içeren her bir mikrofüj tüpüne bir mililitre dağıtın.
Tüpleri sarmak için alüminyum folyo kullanın ve oda sıcaklığında bir döndürücü veya hafif sallama ile sallanan bir platform üzerine yerleştirin. Kromojenik sinyalleri izlemek için bir mikroskop kullanarak reaksiyon süresini ampirik olarak belirleyin. Zamanla reaksiyon sürecine müdahale etmeyecek hafif yağışlar gelişecektir.
Embriyoları her biri 10 dakika boyunca dört kez yıkamak için PBST kullanarak reaksiyonu durdurun, ardından lekeli embriyoları 60 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 PFAT ile sabitleyin. Tam montajlı mikroskopi için, embriyoları temizlemek için PBS'de% 50 gliserol kullanın. Ardından, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirdikten sonra, parlak alan aydınlatması altında dik bir mikroskop kullanarak numuneleri gözlemleyin.
Embriyonun sarısını çıkarın ve düz bir montaj hazırlamak için kullanın. Ardından, interrenal doku morfolojisinin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü yakalayın. Steroidojenik dokunun vasküler mikroçevresini analiz etmek için, lekeli embriyoları %2 PFA ile sonradan sabitleyin.
Bir saat boyunca dört santigrat derecede% 1 Triton X-100 ile destekleyin ve embriyoları oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca dört kez yıkamak için PBST-X'i kullanın. Embriyoları gömmek için, agarozu PBS'de 95 santigrat derecede çözerek% 4 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Daha sonra, mikrosantrifüj tüplerinde alikot yapın ve dört ila sekiz santigrat derecede saklayın.
%4 düşük erime noktalı agarozun bir alikotunu 70 derecede 10 dakika eritin, ardından alikotu 47 santigrat derecede tutun. Kalıp olarak% 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünden ayrılmış bir kapak kullanarak, bir embriyoyu erimiş agaroza gömün ve katılaşana kadar soğumaya bırakın. Vibratom kesitini gerçekleştirmek için, vibratomun kuru platformuna bir parça kağıt bant yapıştırın.
Ardından, sertleşmiş agaroz bloğunu kalıptan çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Platformdaki kağıt banda süper yapıştırıcı uygulayın ve agaroz bloğunu, numunenin ön tarafı yukarı bakacak şekilde kağıt bandın üzerine sabitleyin. Daha sonra, agaroz bloğunu, üst ve alt yüzeylerin her iki tarafında sırasıyla yaklaşık dört ila sekiz milimetre olacak şekilde trapez prizma şeklinde kesin.
Agaroz bloğunu durulamak için% 0.5 Trident X-100 ile soğuk PBS ile doldurulmuş bir damlalık kullanın. Ardından, 100 mikrometrelik bölümler hazırlamak için üreticinin talimatlarına göre bir vibratom kullanın. 26 gauge bir iğne ile vibratomdan kesilen bölümleri çıkarın ve bunları oyuk başına 500 mikrolitre soğuk %0,5 PBST-X içeren bir spot plakaya aktarın.
Bir diseksiyon mikroskobu altında kontrol ederek üç beta-Hsd aktivitesi pozitif doku bölümünü toplayın ve bölümleri soğuk% 0.5 PBST-X içeren 96 oyuklu bir plakaya aktarmak için bir pipet ucu kullanın. Bölümleri metin protokolüne göre daha fazla boyayın ve görüntüleyin. Steroidojenik interrenal dokunun pronefrik böbrek glomerulusu ve yeni ortaya çıkan vaskülatürü ile nasıl birlikte geliştiğini belirlemek için, hem böbreğe özgü hem de endotelyal spesifik floresan eksprese eden bir çift transgenik zebra balığı embriyosu üzerinde üç beta-Hsd enzimatik aktivite testi gerçekleştirildi.
Burada gösterildiği gibi, üç beta-Hsd pozitif steroidojenik doku orta hattın sağında bulunur ve hemen pronefrik böbrek glomerulusuna yapışır. Bazı steroidojenik hücreler de orta hat boyunca göç etmeye başlar. Üç beta-Hsd testine tabi tutulan endotelyal GFP'yi eksprese eden transgenik embriyolardan alınan bu vibratom kesitleri, fibronektin ve onun aşağı akış efektörü olan fosforile fokal adezyon kinazı tespit etmek için immünohistokimya ile analiz edildi.
Fibronektinin peri-dorsal aort birikimi, interrenal damar büyümesini desteklemek için gereklidir. Balık embriyosu veya larvası için, tam montajlı histokimyasal boyama, uygun şekilde yapılırsa bir gün içinde yapılabilir. Bu boyama yöntemi basit ve hızlı olmasına rağmen, steroidojenik yolun sadece tek bir enzimini tespit ettiğini hatırlamak önemlidir.
İnterrenal dokunun gelişimsel bir analizi hedefleniyorsa, bu teste ek olarak, steroidogenezde yer alan diğer kritik genlerin ekspresyonunu tespit etmek için in situ habitizasyon yapılması gerekecektir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, gelişmekte olan zebra balıklarında farklılaşmış interrenal steroidojenik hücreleri tespit etmek için bir yöntem tanımlar ve bu yöntem, tam montajlı enzimatik aktivite analizi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu teknik, interrenal bezin oluşumu ve malformasyonunu incelemek için değerlidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Endokrinoloji
Arka Plan
- Zebra balıklarındaki interrenal bez, memeli adrenal bezine benzer.
- Interrenal bezi anlamak, steroidogenez konusundaki bilgiler için kritik öneme sahiptir.
- Bu analiz, gelişim sırasında steroidojenik hücrelerin görselleştirilmesini sağlar.
- Gelişmiş analiz için transgenik çizgilere uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Zebra balıklarında farklılaşmış steroidojenik hücreleri tespit etmek.
- Interrenal bez gelişiminin moleküler mekanizmalarını araştırmak.
- Genetik ve kimyasal tarama için güvenilir bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- 3-β-hidroksisteroid dehidrogenaz için tam montajlı enzimatik aktivite analizi.
- Embriyolardaki pigment oluşumunu inhibe etmek için %0,03 PTU kullanımı.
- Vibratom kesimi ve immünohistokimya ile kombinasyon.
- Konfokal mikroskopi kullanılarak vasküler mikroçevrenin görselleştirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Farklılaşmış interrenal steroidojenik hücrelerin başarılı tespiti.
- Hızlı ve güvenilir boyama prosedürü gösterildi.
- Aynı embriyoda birden fazla dokunun analiz edilme yeteneği.
- Interrenal dokunun vasküler mikroçevresine ilişkin bilgiler.
Sonuçlar
- Analizler, interrenal bez gelişimini incelemek için güçlü bir araçtır.
- Steroidogenez üzerindeki genetik ve kimyasal etkileri araştırmayı kolaylaştırır.
- Bu yöntem, omurgalılarda endokrin sistem oluşumunu anlamamızı geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This enzymatic activity assay enables rapid visualization of steroidogenic tissue in zebrafish embryos, supporting early-stage target validation in endocrine pathway research. By detecting 3β-Hsd activity without reliance on antibodies, the method provides a reliable readout for mechanistic de-risking of compounds affecting steroidogenesis. Its compatibility with transgenic reporter lines and vascular microenvironment analysis enhances predictive confidence in preclinical safety assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of steroidogenic tissue differentiation through direct enzyme activity detection.
- Operational Value: Provides antibody-independent readout for target engagement in zebrafish-based mutant or chemical screens.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of genetic or chemical disruptions in the steroidogenic pathway.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative chromogenic readout correlating with 3β-Hsd enzymatic activity in intact tissues.
- Operational Value: Compatible with whole-mount imaging and sectioning for multiplexed tissue analysis in single embryos.
- Scalability: Rapid staining procedure allows integration into high-throughput screening workflows for endocrine disruptor detection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Permits co-localization of steroidogenic tissue with vascular markers to assess microenvironmental influences on hormone production.
- Operational Value: Enables sequential staining for enzyme activity followed by immunohistochemistry to map fibronectin and phosphorylated FAK in vascular niches.
- Translational Relevance: Models interrenal-adrenal axis conservation, supporting cross-species extrapolation of steroidogenesis findings.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within early discovery workflows where functional readouts of endocrine tissue maturation are required prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports interrogation of steroidogenic lineage specification and tissue morphogenesis in vivo.
- Screening: Delivers enzyme-based phenotypic readout suitable for compound library screening in zebrafish.
- Analytics: Generates spatially resolved activity maps that can be co-registered with vascular or glomerular markers.
- Translational Research: Enables analysis of tissue-stromal interactions critical for endocrine tissue maturation and vascular support.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for developmental endocrinology and toxicology applications across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in steroidogenic tissue identification through direct enzymatic detection.
- Operational Value: Standardizes whole-mount staining across laboratories using defined reagent preparation and reaction timing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early biomarker of pathway disruption in vertebrate models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on steroidogenic tissue integrity and vascular niche formation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, fixation, and whole-mount staining techniques.
- Dependent on access to vibratory microtome, confocal microscopy, and immunohistochemistry infrastructure for vascular analysis.
- Necessitates standardization of reaction timing and chromogenic development across batches for reproducible quantification.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of permeability and staining conditions.
- Limitation: Detects only one enzymatic step (3β-Hsd) in the steroidogenic pathway, necessitating complementary assays for full pathway assessment.
