Interrenal steroidogenik Doku ve Zebra balığı Onun Vasküler Mikroçevre görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan zebra balığında farklılaşmış interrenal steroidojenik hücreleri, basit bir tam montajlı enzimatik aktivite testi ile tespit etmektir. Bu boyama prosedürü, interrenal bez oluşumu ve malformasyonunun moleküler ve hücresel mekanizmaları ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu boyama testinin ana avantajı, hızlı, basit ve güvenilir olmasıdır, bu da onu zebra balıklarında genetik veya kimyasal taramalar için güçlü bir araç haline getirir.

Bu prosedür, aynı embriyodaki birden fazla dokunun analiz edilebilmesi için böbreği ve kan damarlarını işaretleyen transjenik floresan raportör hatları üzerinde gerçekleştirilebilir. Vibratom kesiti, immünohistokimya ve konfokal mikroskopi ile birlikte, interrenal dokunun vasküler mikroçevresi de görüntülenebilir. Metin protokolüne göre üç beta-Hsd aktivite boyaması için stok çözeltileri hazırladıktan sonra, pigment oluşumunu engellemek için gelişmekte olan zebra balığı embriyolarını yumurta suyuna% 0.03 PTU içinde yerleştirin.

Dekoryonlu embriyoları veya larvaları, PBS'de% 0.1 Tween 20 veya PFAT ile% 2 veya% 4 PFA'da sabitleyin. PBST ile embriyoları her biri 10 dakika boyunca dört kez yıkayın ve numunelerin yıkamalar arasında kurumamasını sağlayın. Boyama reaksiyonlarından önce, A ve B parçalarını ayrı tüplerde taze olarak hazırlayın, ardından çözeltileri girdaplayın ve santrifüjleyin.

A ve B parçalarının ayrı tüplerde hazırlanması esastır. Tüm bileşenleri doğrudan tek bir tüpe eklemek, hemen şiddetli yağışlara neden olacaktır. İyice karıştırın ve hemen sabit ve yıkanmış embriyoları içeren her bir mikrofüj tüpüne bir mililitre dağıtın.

Tüpleri sarmak için alüminyum folyo kullanın ve oda sıcaklığında bir döndürücü veya hafif sallama ile sallanan bir platform üzerine yerleştirin. Kromojenik sinyalleri izlemek için bir mikroskop kullanarak reaksiyon süresini ampirik olarak belirleyin. Zamanla reaksiyon sürecine müdahale etmeyecek hafif yağışlar gelişecektir.

Embriyoları her biri 10 dakika boyunca dört kez yıkamak için PBST kullanarak reaksiyonu durdurun, ardından lekeli embriyoları 60 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 PFAT ile sabitleyin. Tam montajlı mikroskopi için, embriyoları temizlemek için PBS'de% 50 gliserol kullanın. Ardından, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirdikten sonra, parlak alan aydınlatması altında dik bir mikroskop kullanarak numuneleri gözlemleyin.

Embriyonun sarısını çıkarın ve düz bir montaj hazırlamak için kullanın. Ardından, interrenal doku morfolojisinin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsünü yakalayın. Steroidojenik dokunun vasküler mikroçevresini analiz etmek için, lekeli embriyoları %2 PFA ile sonradan sabitleyin.

Bir saat boyunca dört santigrat derecede% 1 Triton X-100 ile destekleyin ve embriyoları oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca dört kez yıkamak için PBST-X'i kullanın. Embriyoları gömmek için, agarozu PBS'de 95 santigrat derecede çözerek% 4 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın. Daha sonra, mikrosantrifüj tüplerinde alikot yapın ve dört ila sekiz santigrat derecede saklayın.

%4 düşük erime noktalı agarozun bir alikotunu 70 derecede 10 dakika eritin, ardından alikotu 47 santigrat derecede tutun. Kalıp olarak% 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünden ayrılmış bir kapak kullanarak, bir embriyoyu erimiş agaroza gömün ve katılaşana kadar soğumaya bırakın. Vibratom kesitini gerçekleştirmek için, vibratomun kuru platformuna bir parça kağıt bant yapıştırın.

Ardından, sertleşmiş agaroz bloğunu kalıptan çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Platformdaki kağıt banda süper yapıştırıcı uygulayın ve agaroz bloğunu, numunenin ön tarafı yukarı bakacak şekilde kağıt bandın üzerine sabitleyin. Daha sonra, agaroz bloğunu, üst ve alt yüzeylerin her iki tarafında sırasıyla yaklaşık dört ila sekiz milimetre olacak şekilde trapez prizma şeklinde kesin.

Agaroz bloğunu durulamak için% 0.5 Trident X-100 ile soğuk PBS ile doldurulmuş bir damlalık kullanın. Ardından, 100 mikrometrelik bölümler hazırlamak için üreticinin talimatlarına göre bir vibratom kullanın. 26 gauge bir iğne ile vibratomdan kesilen bölümleri çıkarın ve bunları oyuk başına 500 mikrolitre soğuk %0,5 PBST-X içeren bir spot plakaya aktarın.

Bir diseksiyon mikroskobu altında kontrol ederek üç beta-Hsd aktivitesi pozitif doku bölümünü toplayın ve bölümleri soğuk% 0.5 PBST-X içeren 96 oyuklu bir plakaya aktarmak için bir pipet ucu kullanın. Bölümleri metin protokolüne göre daha fazla boyayın ve görüntüleyin. Steroidojenik interrenal dokunun pronefrik böbrek glomerulusu ve yeni ortaya çıkan vaskülatürü ile nasıl birlikte geliştiğini belirlemek için, hem böbreğe özgü hem de endotelyal spesifik floresan eksprese eden bir çift transgenik zebra balığı embriyosu üzerinde üç beta-Hsd enzimatik aktivite testi gerçekleştirildi.

Burada gösterildiği gibi, üç beta-Hsd pozitif steroidojenik doku orta hattın sağında bulunur ve hemen pronefrik böbrek glomerulusuna yapışır. Bazı steroidojenik hücreler de orta hat boyunca göç etmeye başlar. Üç beta-Hsd testine tabi tutulan endotelyal GFP'yi eksprese eden transgenik embriyolardan alınan bu vibratom kesitleri, fibronektin ve onun aşağı akış efektörü olan fosforile fokal adezyon kinazı tespit etmek için immünohistokimya ile analiz edildi.

Fibronektinin peri-dorsal aort birikimi, interrenal damar büyümesini desteklemek için gereklidir. Balık embriyosu veya larvası için, tam montajlı histokimyasal boyama, uygun şekilde yapılırsa bir gün içinde yapılabilir. Bu boyama yöntemi basit ve hızlı olmasına rağmen, steroidojenik yolun sadece tek bir enzimini tespit ettiğini hatırlamak önemlidir.

İnterrenal dokunun gelişimsel bir analizi hedefleniyorsa, bu teste ek olarak, steroidogenezde yer alan diğer kritik genlerin ekspresyonunu tespit etmek için in situ habitizasyon yapılması gerekecektir.