Name: Interrenal steroidogenik Doku ve Zebra balığı Onun Vasküler Mikroçevre görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Öğrenin, gelişen zebra balığında interrenal steroidojenik hücreleri tespit etmek için bütün-mount enzimatik aktivite testini. Bu yöntem, interrenal bez gelişimini ve bozukluklarını incelemek için hızlı ve güvenilir bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

S843: LI1 ve Tg (EGFP kdrl): Biz Tg (GFP wt1b) hediye Prof. Christoph Englert ve Prof. Didier Stainier teşekkür suşu, sırasıyla, Tg (kdrl: mCherry) sağlanması Tayvan balığı Çekirdek Tesis ci5. Bu çalışma 102-, Bilim ve Teknoloji (96-2628-B-029-002-My3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-My3 Tayvan Bakanlığı hibe ile desteklenmiştir 2321-B-400-018).

Etik Beyanı: zebrabalıkları tüm deneysel prosedürleri Tunghai Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi (KİK Onay NO 101-12.) Ve onaylı kurallarına uygun olarak gerçekleştirdi. 3β-Hsd enzimatik Aktivite Boyama için 1. Stok Çözümleri <ol><li> trans-dehidroepiandrosteron [dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mg / ml] hazırlayın. </li><li> β-nikotinamid adenin dinükleotid hidrat (0.1 M fosfat tampon maddesi içinde 1.2 mg / ml, pH 7.2) hazırlayın. </li><li> Nikotinamid hazırlanması (B3 vitamini, 50 mg / ml H2O). </li><li> 4-nitro mavi tetrazolyum (50 mg / ml% 70 dimetilformamid) hazırlayın. </li><li> -20 ° C&#39;de mikrofüj tüpleri ve mağaza içine kısım tüm bu bileşenler. NOT: bizim deneyim, tekrarlanan donma ve tüm yukarıda belirtilen çözümlerin hacimde çözülme ise 3β-Hsd etkinlik boyama yoğunluğunu etkilemez. </li></ol> 2. Wdelik montaj 3β-Hsd Etkinlik Boyama Not: 3β-HSD &#39;enzimatik aktivitesi erken 28 saat sonra döllenme (HPF) halinde kültürlendiğinde hsd3b1 2,7 mRNA ifadesinin başlangıcı ile tutarlıdır 28.5 ° C, zebra balığı embriyolar tespit edilebilir. Bu çalışmada, tüm montaj 3β-HSD &#39;aktivitesi boyama protokolü daha önce tarif edilen yönteme 8 dayanır ve 7 gün sonra gübreleme 9 gelişmekte zebrabalıkları başarılı olduğu saptanmıştır. Interrenal steroidojenik doku damar mikro-analizi için, 3β-HSD &#39;aktivitesi boyama tüm montaj gibi Tg olarak endotel spesifik floresan ifade eden transgenik kuşaklar (kdrl: EGFP) uygulanması gerekir: ci5 15 14 ve TG (MCherry kdrl) s843 . Zebra balığı böbrek gelişimini göz önünde bulundurarak interrenal steroidogenik doku analiz etmek, 3β-Hsd etkinlik boyama başvurunun olabilirLI1 balık 16 glomerülleri ve Pronephric tübüller oluşumu tarif edilmektedir: Tg (GFP wt1b) ED. <ol><li> Pigment oluşumunu inhibe etmek için, 12 ve 24 HPF arasındaki aşamasından, yumurta suda% 0.03 feniltiyoüre bölgesindeki (deiyonize su içinde 0.06 mg / L resif tuzu) onları kuluçka geliştirme zebrafish tedavi edin. </li><li> gece boyunca, oda sıcaklığında (RT) ya da (B),% 2 PFAT de 1 saat süre ile,% 0.1 Tween 20 (PFAT) ile desteklenmiş fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde (A)% 4 paraformaldehit (PFA) dechorionated embriyolar veya larvaları saptamak 4 ° C ve oda sıcaklığında 4 saat ve ardından 4 ° C&#39;de 2 saat için. Dikkat: PFA Solunduğunda ve cilt ile temasında toksiktir. Bu cilt, mukoza zarları, gözler ve üst solunum yollarında yıkıcıdır. </li><li> PBS oda sıcaklığında,% 0.1 Tween 20 (PBST) ile desteklenmiş olan 10 dakika için embriyo 4x yıkayın. NOT: yıkama solüsyonları değiştirirken örnekleri kuru değil için çok önemlidir. </li><li> Taze sta hazırlamakreaksiyonlar daha önce ining çözeltisi (Tablo 1). Hazırlamak girdap ve ayrı tüplerde santrifüj parçaları A ve B. NOT: Düz tek tüp içine tüm bileşenleri ekleme şiddetli yağış neden olur. </li><li> , B kısmının tamamı çözeltiye A kısmının tüm solüsyonu ilave boyama solüsyonu hazırlamak için iyice karıştırın ve hemen sabit ve yıkandı embriyoları içeren her bir mikrofüj tüpüne 1 mi dağıtın. </li><li> rotator veya oda sıcaklığında nazik çalkalama için sallanan bir platform da ışık ve yerine korumak için alüminyum folyo ile mikrofüj tüpleri sarın. </li><li> Ampirik mikroskobu ile kromojenik sinyalleri izleyerek reaksiyon süresini belirler. zamanla gelişecektir hafif yağışlar; Bununla birlikte, bu reaksiyon işlemi engel olmaz. Not: Embriyolar 4 saat 25 ° C&#39;de 28 HPF boyama sabit için interrenal doku net bir sinyal üretir. </li><li> PBST içinde 10 dakika için 4x yıkama ederek reaksiyonu durdurun. benf başka immünohistokimyasal (IHC) analizi gereklidir sonrası tamir oda sıcaklığında 60 dakika boyunca% 4 PFAT ile boyanmış embriyolar. Aksi takdirde, bir sonraki kullanıma kadar 4 ° C &#39;de yıkandı, embriyolar saklayın. </li><li> tüm montaj mikroskopi için, PBS içinde% 50 gliserol ile lekeli sonradan tespit ve yıkanmış embriyolar temizlemek bir slayt yukarı bakacak şekilde sırt tarafında onları yönlendirmek ve parlak saha aydınlatma altında dik bir mikroskop kullanılarak gözlemlemek. NOT: tavsiye edilir interrenal doku morfolojisi bir yüksek çözünürlüklü görüntü, 3β-Hsd aktivite lekeli ve deyolked embriyo analizi, düz monte yapmak için. Interrenal steroidogenik doku sağ yumurta sarısının üzerine konumlandırılmış olarak, interrenal doku ventral düz montaj analizi interrenal morfolojisi 17 doğrudan ve net gözlem sağlar. </li></ol> 3β-Hsd Etkinlik lekeli Embriyolar 3. IHK Analizi NOT: steroi vasküler mikro analiz içindogenic dokusu, bir transgenik endotel spesifik flüoresan raportör 3β-HSD &#39;aktivitesi lekeli embriyolar vibratome kesilmesi ve daha sonra IHC analizi 12,18 enine tabi tutulur. <ol><li> Post-fiksasyon <ol><li> 4 ° C &#39;de 1 saat süre ile% 1 Triton X-100 ile desteklenen% 2 PFA 3β-HSD&#39; aktivitesi-boyanmış ve yıkandı embriyolar sonrası düzeltmek ve% 1 Triton X-100 içeren PBS içinde 10 dakika boyunca 4x yıkayın (PBSTx) oda sıcaklığında karıştırıldı. </li></ol></li><li> katıştırma <ol><li> % 4, 95 ° C, 4-8 ° C de mikrofüj tüplerine kısım ve mağazada PBS içinde agaroz eritilerek agaroz erime noktası düşük hazırlayın. </li><li> 10 dakika süre ile 70 ° C &#39;de agaroz% 4 düşük erime bir kısım eritin ve sonra 47 ° C&#39;de kısım tutun. Her embriyo yerleştirme eriyik% 4 bir kalıp olarak hizmet veren bir 1.5 mi mikrofüj tüpün müstakil bir kap içinde agaroz, erime noktası düşük, ve katı kadar soğumaya bırakın. </li></ol></li><li> vibratome Kesit <ol><li> Kuru p kağıt şerit bir parça sopavibratome latform. </li><li> bir jilet ile kalıp sertleştirilmiş agaroz blok çıkarın. platformda kağıt şerit superglue uygulayın ve yukarı bakacak şekilde numunenin ön tarafı, kağıt şerit üzerine agaroz blok düzeltmek. sırasıyla, yaklaşık olarak 4 mm, üst ve alt yüzlerin her bir tarafında 8 mm olan, bir yamuk prizma şekline agaroz blok kesin. </li><li> Bir damlalık kullanılarak,% 0.5 Triton X-100 (% 0.5 PBSTx) ile desteklenmiş, soğuk PBS ile numune içeren agaroz blok durulayın. </li><li> vibratome kullanım kılavuzuna göre 100 mikron bölüme agaroz blok dilimleyin. Sürekli kurumasını önlemek için agaroz blok durulayın. Her bir dilim kesme gibi, bir 26 G iğne kullanılarak şırınga vibratome çıkarın ve soğuk% 0.5 PBSTx (500 ul / oyuk) ihtiva eden bir nokta plakaya aktarılır. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında kontrol ederek 3β-Hsd aktivite pozitif doku bölümleri toplayın ve bir pi ile bölümleri aktarmakSoğuk% 0.5 PBSTx (150 ul / oyuk) ihtiva eden bir 96-çukurlu plaka uç kesme (açıklık yaklaşık 1 mm iç çap) sahip Pette ucu. doku örnekleri genellikle bu aşamadan sonra agaroz blok ayırmak. </li></ol></li><li> Permeabilization ve Yıkama <ol><li> PBS içinde 10 dakika% 1 sığır serum albümini /% 1 DMSO /% 0.1 Triton X-100 (PBDTx) ile desteklenmiş dilimler, oda sıcaklığında,% 0.5 PBSTx 15 dakika PBS içinde 10 dakika ve 4 kere 6x yıkayın. </li></ol></li><li> bloke etme <ol><li> Oda sıcaklığında PBDTx 1 saat,% 2 fetal sığır serumu (FCS), dilimler inkübe edin. </li></ol></li><li> Primer antikor reaksiyonu <ol><li> Birincil antikor içeren PBDTx 1.5 gün inkübe dilimleri (örneğin, tavşan poliklonal anti-insan fibronektin ve fare anti-insan fokal yapışma kinaz) 4 ° C&#39;de ilave edildi. </li></ol></li><li> Yıkama <ol><li> Dilimler oda sıcaklığında PBDTx 10 dakika boyunca 6 kat yıkayın. </li></ol></li><li> bloke etme <ol><li> PB içinde% 2 FCS içinde 1 saat boyunca inkübe dilimleriOda sıcaklığında DTx. </li></ol></li><li> İkincil antikor reaksiyonu <ol><li> 4 ° C &#39;de ikinci bir antikor (florofor-konjuge keçi anti-tavşan veya anti-fare IgG&#39;si) ihtiva eden PBDTx 1.5 gün inkübe dilimleri. </li></ol></li><li> Yıkama <ol><li> Dilimler oda sıcaklığında PBST 10 dakika süreyle 10 oda sıcaklığında PBDTx içinde min ve 4x için 6x yıkayın. , Odaklı mikroskopik analizi için PBS içinde% 50 gliserol ile örnekleri temizlemek: NOT. </li></ol></li></ol> 4. Konfokal Analizi <ol><li> tüm montaj embriyo ve 10X / 0.5 ve 20X / 0.75 objektif lens ile donatılmış bir konfokal mikroskop ile bölümüne dikkat ediniz. </li><li> aşağıdaki gibi floresans ve 3β-HSD &#39;boyama birinin eş zamanlı saptanması için, çok kanallı ayar modu: 488 nm argon lazeri ve GFP tespiti için 505-530 nm bant geçişi filtresi; 543 nm Helyum-Neon lazer ve mCherry tespiti için 560-615 nm bant geçiş filtresi; ve 3β-Hsd boyama tespiti için ışık kanalı iletti.iğne deliği boyutu 1 Airey birimi ve çözünürlüğü 1024 x 1024 piksel olduğunu. </li><li> 3D projeksiyon olarak (6 mikron aralığı ile) z yığınları birleştirin ve kullanarak, projeksiyon ve parlak bir alan birleştirme yerleşik konfokal yazılımı. </li></ol>

<ol><li>Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+early+development+of+zebrafish+interrenal+glands+and+pronephros%3A+differential+control+by+wt1+and+ff1b%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b.</a> Development. 130, 2107-2116 (2003).</li>
<li>To, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary-interrenal+interaction+in+zebrafish+interrenal+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development.</a> Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).</li>
<li>Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrenal+organogenesis+in+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Interrenal organogenesis in the zebrafish model.</a> Organogenesis. 3, 44-48 (2007).</li>
<li>Cravioto, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+inherited+variant+of+the+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase-isomerase+deficiency+syndrome%3A+evidence+for+the+existence+of+two+isoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes.</a> J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).</li>
<li>Lachance, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+3+beta-hydroxysteroid+dehydrogenase%2Fdelta+5-delta+4-isomerase+gene+and+its+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 267, 3551(1992).</li>
<li>Simard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+3beta-hydroxysteroid+dehydrogenase%2Fdelta5-delta4+isomerase+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family.</a> Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).</li>
<li>Lin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zebrafish+hsd3b+genes+are+distinct+in+function%2C+expression%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution.</a> Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).</li>
<li>Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+and+adrenomedullary+homologs+in+eight+species+of+adult+and+developing+teleosts%3A+morphology%2C+histology%2C+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry.</a> Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).</li>
<li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev Biol. 260, 226-244 (2003).</li>
<li>Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prox1+is+a+novel+coregulator+of+Ff1b+and+is+involved+in+the+embryonic+development+of+the+zebra+fish+interrenal+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium.</a> Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).</li>
<li>Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ff1b+is+required+for+the+development+of+steroidogenic+component+of+the+zebrafish+interrenal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ.</a> Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).</li>
<li>Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hemodynamically-regulated+vascular+microenvironment+promotes+migration+of+the+steroidogenic+tissue+during+its+interaction+with+chromaffin+cells+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo.</a> PLoS One. 9, e107997(2014).</li>
<li>Liu, Y. W., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium+is+required+for+the+promotion+of+interrenal+morphogenetic+movement+during+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development.</a> Dev Biol. 297, 44-58 (2006).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranial+vasculature+in+zebrafish+forms+by+angioblast+cluster-derived+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis.</a> Dev Biol. 348, 34-46 (2010).</li>
<li>Perner, B., Englert, C., Bollig, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wilms+tumor+genes+wt1a+and+wt1b+control+different+steps+during+formation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros.</a> Dev Biol. 309, 87-96 (2007).</li>
<li>Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+mediates+correct+positioning+of+the+interrenal+organ+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish.</a> Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).</li>
<li>Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+fibronectin+signaling+requirements+of+the+zebrafish+interrenal+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel.</a> PLoS One. 7, e43040(2012).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir rakip mali çıkarları yoktur.

3β-HSD aktivitesinin sinyal gücü reaksiyon boyunca arttı. 3β-HSD aktivitesinin net sinyaller itibaren 28 HPF gelen aşamaları için reaksiyon 4 saat sonra tespit edildi. Bununla birlikte, reaksiyon süresi deneyi amacına bağlı olarak, ampirik belirlenmesini gerektirir. boyama gece boyunca işlem gerektirir durumlarda, hafif mavimsi arka örneklerinin geliştirme eğilimindedir. Bu sorun, 3β-HSD &#39;aktivitesi boyama önce sabitleme süresi (örneğin, oda sıcaklığında 4% PFAT 4 saat) arttırarak aşılabilir. Bu, oda sıcakl...

böbreküstü bezi, hipotalamus-hipofiz-adrenal ekseninin önemli bir bileşeni, steroid salgılar ve steroid homeostazı ve strese bedensel yanıtını koordine eder. böbrek üstü bezi katekolamin sentezleyen bir bölge-spesifik bir şekilde steroid salgılayan dış korteks ve iç medulla içerir. Teleostlarda interrenal bezi, memelilerde adrenal bez karşılığıdır ve adrenal korteks ve medullada sırasıyla 1-3 fonksiyonel eşlenikleridir steroidojenik interrenal ve kromafin hücreleri, oluşmaktadır. Zebra balığı model kullanarak yapılan çalışmalar, hem steroidogenik ve kromaffin hücre soylar yüksek memelilerde 1,2 benzeyen moleküler ve hücresel mekanizmaları tarafından oluşturulan bildirmiştir. Bu nedenle, Zebra balığı, genetik bozukluklar, nöroendokrin kontrolü ve hipotalamus-hipofiz-adrenal (interrenal) ekseninin sistem biyolojisi çalışmak için bir potansiyel olarak güçlü bir modeldir. 4,5 ila 17α-hydroxypregnelolone gelen pregnenolon, 17a-hidroksiprogesteron progesteron dönüşümünü ve androstenedion katalize eder. 3β-HSD &#39;hormonal steroid, yani progesteron, glukokortikoid, mineralokortikoid, androjen ve östrojenlerin her sınıfları üreten mutantı için gereklidir. İki insan 3β-Hsd HSD3B1 izozimine ve HSD3B2 farklı şekilde 6 ifade edilir. HSD3B2 adrenal korteks ve gonadlar ifade edilir ise HSD3B1, plasenta ve periferik dokularda ifade edilmektedir. İnsan HSD3B1 ve HSD3B2 interrenal doku ve yetişkin gonadlar ifade edilen Zebra balığı hsd3b1, eş ortologlar vardır; Zebra balığı hsd3b2 olan transkript organogenez 7 önce kaybolur bir anne olarak ifade gendir. zebrabalıkları için tüm montaj 3β-HSD &#39;enzimatik aktivite deneyi protokol, Levy yöntemini değiştirerek geliştirilenMilano ve diğerleri tarafından tarif s. Sekiz Teleost türlerinin 8 donmuş bölümlerinde. Çünkü doku geçirgenliği ve gelişmekte olan zebrafish optik şeffaflık, 3β-Hsd histokimya başarıyla sabit Zebra balığı embriyo ve larva için kullanılabilir tüm montaj ve özellikle farklılaşmış interrenal dokuları tasvir. Bu, hassas ve hızlı bir deney interrenal dismorfogenezis farklı gösteren Çeşitli mutantlar ve morphants uygulanmıştır. Interrenal 3β-HSD &#39;aktivitesi interrenal doku dağılımı Ff1b transkripsiyon faktörünün belirli bir devirme yoluyla bozulur ve interrenal farklılaşma Ff1b coregulator Prox1 9,10 bir devirme etkilenir azaltılır embriyoda yoktur. Özellikle, 3β-Hsd faaliyeti gibi tek gözlü toplu iğne başı, şiddetli erken evre defekti olan mutantlar tespit edilebilir ve nerede 3β-H, şaşılıksd histokimyası interrenal hücre göçü 11 nasıl etkilendiğini anlatır. interrenal doku farklılaşması bile kan ve damarsal tam yokluğunda ödün verilmemiş. Bu nedenle endotelyum türevli sinyalleri şekil kadar geliştirilmesi interrenal organı 12,13 belirlenebilir. Genel olarak, bu histokimyasal deney başarıyla zebrabalıkları modelinde özellikleri, farklılaşmasını ve steroidojenik hücrelerinin göçünü incelemek için kullanılmıştır. Bu nedenle, verimli ve adrenal ve interrenal organ bozuklukları hedefleyen herhangi bir genetik veya kimyasal ekranlar için güvenilir bir aracı olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>Konfokal mikroskop</td><td>Carl Zeiss&nbsp;</td><td>LSM510 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>USB</td><td>US16374</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Baldır Serumu&nbsp;</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td>SH30073</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta;-Nikotinamid adenin dinükleotid hidrat</td><td>Sigma</td><td>N1636</td><td></td></tr><tr><td>4-Nitro mavi tetrazolyum</td><td>Promega</td><td>S380C</td><td></td></tr><tr><td>Nusieve GTG</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Feniltiüre</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Sigma</td><td>P4417-100Tab</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Spot Plaka</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>Resif Tuzu</td><td>AZOO</td><td>AZ28001</td><td></td></tr><tr><td>trans-Dehidroandrosteron</td><td>Sigma</td><td>D4000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica</td><td>VT1000M</td><td></td></tr></tbody></table>

interrenal steroidogenik doku ve zebra balığı onun vasküler mikroçevre görselleştirme

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Bu protokol, basit bir tam montajlı enzimatik aktivite testi yoluyla farklılaşmış interrenal steroidojenik hücrelerin nasıl tespit edileceğini tanıtır. 3-β-Hidroksisteroid dehidrojenaz / Δ5-4 izomeraz (3β-Hsd) aktivite pozitif hücrelerin kromojenik histokimyasal boyanması yoluyla farklılaşmış steroidojenik dokuların tanımlanması, sırasıyla memelilerde ve teleostlarda adrenokortikal ve interrenal dokuların morfolojisini ve farklılaşmasını izlemek için kritik öneme sahiptir. Zebra balığı modelinde, gelişmekte olan embriyoların ve larvaların optik şeffaflığı ve doku geçirgenliği, 3β-Hsd aktivitesinin tam montajlı boyanmasına izin verir. Gelişmekte olan pronefrik ve endotel hücrelerini işaretleyen transgenik floresan raportör hatlarında gerçekleştirilen bu boyama protokolü, böbrek ve komşu damar sistemine ek olarak steroidojenik interrenal dokunun da saptanmasını sağlar. Vibratom kesiti, immünohistokimya ve konfokal mikroskopi ile birlikte, interrenal steroidojenik dokuların vasküler mikroçevresini görselleştirebilir ve test edebiliriz. 3β-Hsd aktivite testi, zebra balığı interrenal bezinin hücre biyolojisini incelemek için gereklidir, çünkü bugüne kadar zebra balığı steroidojenik hücrelerini etiketlemek için uygun bir antikor mevcut değildir. Ayrıca, bu test hızlı ve basittir, bu nedenle adrenal (interrenal) genetik bozuklukları hedefleyen mutant taramalar için ve ayrıca farmasötik veya toksikolojik çalışmalarda kimyasalların steroidogenez üzerindeki bozulma etkilerini belirlemek için güçlü bir araç sağlar.

Pronephric böbrek glomerül ve doğmakta olan damarsal ile steroidogenik interrenal doku codevelops, 3β-Hsd enzimatik aktivite deneyi çift transgenik Tg (wt1b: GFP) üzerinde gerçekleştirildi nasıl belirlemek için LI1; Tg (kdrl: mCherry) ci5 embriyo 34 hpf (Şekil 1). Bu aşamada, 3β-Hsd aktivitesi pozitif steroidogenik doku sağ orta hatta yer alan ve bazı steroidogenik hücreler orta hatta genelinde göç başlar ve dorsal görünümünden bir...

Zebra balığı interrenal bezi memeli adrenal bezin teleostean karşılığıdır. Enzimatik aktivite deneyi, gelişmekte olan Zebra balığı farklılaşmış steroidogenik hücreleri tespit; Bu protokol 3-β hidroksisteroid dehidrojenaz (3β-Hsd Δ 5-4 izomeraz) nasıl gerçekleştirileceği tanıtır.

Interrenal steroidogenik Doku ve Zebra balığı Onun Vasküler Mikroçevre görselleştirme

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Bu prosedürün genel amacı, basit bir tüm vücut enzim aktivite testi aracılığıyla, gelişmekte olan zebra balığında farklılaşmış interrenal steroidojenik hücreleri tespit etmektir. Bu boyama prosedürü, interrenal bez oluşumu ve malformasyonunun moleküler ve hücresel mekanizmalarıyla ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu boyama testinin temel avantajı hızlı, basit ve güvenilir olmasıdır, bu da onu zebra balığındaki genetik veya kimyasal taramalar için güçlü bir araç haline getirir.Bu prosedür, böbreği ve kan damarlarını işaretleyerek aynı embriyodaki birden fazla dokunun analiz edilmesine olanak tanıyan transgenik floresan raporlayıcı hatlar üzerinde gerçekleştirilebilir. Vibratom kesitleme, immünohistokimya ve konfokal mikroskopi ile birlikte, interrenal dokunun vasküler mikroçevresi de görselleştirilebilir. Metin protokolüne uygun olarak üç beta-Hsd aktivite boyaması için stok çözeltiler hazırlandıktan sonra, pigment oluşumunu engellemek için gelişmekte olan zebrafish embriyoları yumurta suyundaki %0,03 PTU içine yerleştirin.Dekoryone edilmiş embriyoları veya larvaları, 0,1% Tween 20 içeren PBS içinde %2 veya %4 PFA veya PFAT ile sabitleyin. Embriyoları PBST il

visualizing-interrenal-steroidogenic-tissue-its-vascular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada yetişkin zebrafish retroorbital enjeksiyon nasıl yapılacağını göstermektedir.

Yetişkin Zebra balığı retro-orbital Enjeksiyon

Zebrafish böbrek, her iki böbrek ve hematopoetik yetişkin kök / progenitör hücrelerin ev ve bu omurgalı bir model organizmadaki hücre tipleri ve onların soyu incelemek için olağanüstü bir fırsat teşkil etmektedir. Burada, yetişkin zebrafish böbrek hücre izolasyonu, nakli, böbrek ve / veya kan hücre popülasyonlarının ifade çalışmaları gibi uygulamalar için de kullanılabilir belirlemek ve cerrahi kaldırmak için araştırmacı sağlayan ayrıntılı bir diseksiyon prosedürü göstermektedir.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Larva Zebrafish serebrovasküler gelişme görüntüleme açıklanmıştır. 3D görüntüleme kolaylaştırmak ve kimyasal tedaviler kullanarak serebrovasküler gelişimini değiştirme teknikleri de verilmektedir.

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

Burada anlatılan yöntemi fokal ve düzlemsel kaymasını düzeltmek için optik bölümlendirilmeleri ve güçlük basit stratejileri yürütebilecek diseksiyon mikroskobu bir floresan kullanılarak Zebra balığı embriyolarının organ gelişiminin time-lapse analiz sağlar.

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Burada, Yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara kolay bir analizini neoangiogenesis ve yapısal değişiklikler bağlantılı uzun vadeli vasküler patolojiler ayarlarında bir hızlı okuma olarak sağlayacak bir yöntem protokol tartışmak.

Diyabet ile gözleri bir balık eğitim: mikrodiseksiyon, görselleştirme ve yetişkin tg(fli:EGFP) Zebra balığı retina damarlara analizi

Burada, 3 Yetişkin zebra balığı yaralanma model ve immünsupresif ilaç tedavisi ile kombine kullanımları açıklanmaktadır. Biz doku Yenileyici görüntüleme ve kemik Qafqaz orada tespit rehberlik sağlar.

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Burada larva zebra balığında karaciğer boyutunu ölçmek için bir yöntem göstermek, karaciğer büyümesi ve gelişimi üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyonetkilerini değerlendirmek için bir yol sağlar.

Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

Öğrenin, gelişen zebra balığında interrenal steroidojenik hücreleri tespit etmek için bütün-mount enzimatik aktivite testini. Bu yöntem, interrenal bez gelişimini ve bozukluklarını incelemek için hızlı ve güvenilir bir araçtır.

Interrenal steroidogenik Doku ve Zebra balığı Onun Vasküler Mikroçevre görselleştirme

Daha fazla video keşfet