Doğal Bileşik Kütüphaneleri Exploration uygundur Anti-biyofilm Tahliller Bir Platform

Genel olarak, bu tahlil platformunun amacı, yeni, anti-biyofilm bileşiklerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için üç, ilgili uç nokta, canlılık, biyokütle ve biyofilm matrisini birleştiren anlamlı bir tarama iş akışı sağlamaktır. Bu platform, kısa ve uzun vadeli kemoterapötik etkilerin hızlı ve uyumlu bir şekilde erken ayrımına izin vererek, antibiyofilm ajan keşfi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Geliştirilen bu platformun temel avantajı, kimyasal kütüphanelerin, özellikle de doğal bileşiklerin anti-biyofilm etkilerinin daha eksiksiz bir resmini sağlamak için farklı tahlilleri birleştirmesidir.

Deneye başlamak için, steril, 96 mikrokuyu plakasının oyuğu başına mililitre bakteri kültürü başına 200 mikrolitre 10 ila altıncı CFU ile işlenmemiş kontrol numuneleri hazırlayın. Bakteri kültürü olmadan ortam kontrollerini dahil edin. Daha sonra, aynı 96 oyuklu plaka üzerinde, dört mikrolitre 50x antibiyotik stok çözeltisi ve oyuk başına 196 mikrolitre bakteri kültürü içeren numuneler hazırlayın, ardından kültürleri inkübe edin.

Tüm planktonik çözeltiyi, biyofilmlere dokunmadan veya hava kabarcıkları oluşturmadan dikkatlice ayrı, temiz, 96 oyuklu bir plakaya aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanarak resazurin boyamaya devam edin. Yine çok kanallı bir pipet kullanarak, biyofilmleri bir kez steril PBS ile oyuk başına 200 mikrolitre ekleyerek yıkayın ve solüsyonu dikkatlice çıkarın. Biyofilm plakasının oyuğu başına 200 mikrolitre 20 mikromolar resazurin çözeltisi ekleyin ve biyofilmi karanlıkta, 200 rpm'de 20 dakika boyunca, işlenmemiş biyofilm kontrolleri eşit şekilde pembe olana kadar inkübe edin.

Ardından, floresansı bir plaka okuyucu ile ölçün. Resazorin lekesini kuyulardan dikkatlice çıkarın. Biyofilmleri 200 mikrolitre metanol ile 15 dakika sabitleyin.

Sabitlemeden sonra metanolü çıkarın ve plakayı 10 dakika kurumaya bırakın. Ardından, biyofilme dikkatlice 190 mikrolitre% 0.02 kristal viyole çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Pipetleme sırasında kuyucukların kenarlarına leke ile dokunmaktan kaçının ve hava kabarcıklarının oluşmasını önleyin ve üflemeyi tamamlamak için pipete basmayın.

Ardından, plakayı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Çok kanallı bir pipetle lekeyi dikkatlice çıkarın. Biyofilmi 200 mikrolitre deiyonize su ile yıkayın.

Kuyuların oda sıcaklığında beş dakika kurumasını bekleyin ve kalan lekeyi% 33 asetik asit içinde çözün. Plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 595 nanometrede absorbansı okuyun.

Hazırlanan planktonik çözelti plakasının 595 nanometresindeki bulanıklığı ölçün. Bu, kristal viyole lekeli plakanın inkübasyonu sırasında yapılabilir. Daha sonra, planktonik bakterileri resazurin ile lekeleyin ve kuyucuk başına 10 mikrolitre resazurin stoğu ekleyin.

İyice karıştırmak için çözeltiyi pipetleyin. Plakayı karanlıkta, oda sıcaklığında, 200 rpm'de, işlenmemiş kontroller eşit şekilde pembe olana kadar yaklaşık beş dakika inkübe edin. Ardından, floresansı ölçün.

Bu boyama için paralel numune plakalarından birini alın ve planktonik çözeltiyi kuyucuklardan çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Biyofilmlere dokunmadan kuyuları bir kez steril PBS ile dikkatlice yıkayın. Lekelenecek kuyucuk başına 200 mikrolitre buğday tohumu aglütinini veya WGA çözeltisi ekleyin.

Ardından plakayı inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bağlanmamış lekeyi çıkarmak için hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Plakayı oda sıcaklığında 15 dakika kurumaya bırakın.

Numuneleri bir floresan mikroskobu ve bir FITC filtresi ile görselleştirin. Bağlı lekeyi oyuk başına 200 mikrolitre% 33 asetik asit içinde çözün. Kuyuları şerit kapaklarla kapatın ve bir su banyosu sonikatörü kullanarak sonikleştirin.

Sonikasyondan sonra, plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir saat sonra, sonikasyon adımları arasında kuyucukları kapalı tutarken sonikasyonu tekrarlayın. Floresansı bir plaka okuyucu ile ölçün.

Yine, bu boyama için paralel numune plakalarından birini alın ve çok kanallı bir pipet kullanarak planktonik çözeltiyi kuyucuklardan çıkarın. Ardından, kuyuları steril PBS ile bir kez yıkayın. Oyuk başına altı mikrolitre boyama çözeltisi ekleyin ve plakayı 15 dakika karanlıkta inkübe edin.

Mikroskopiden önce, çok kanallı bir pipet kullanarak fazla sıvıyı manuel olarak çıkarın. Canlı hücreleri görselleştirmek için yeşil floresan için FITC filtreli bir floresan mikroskobu ve ölü hücreleri görselleştirmek için kırmızı floresan için bir TRITC filtresi kullanarak görüntüleri yakalayın. Bu boyama için paralel numune plakalarından birini kullanın ve planktonik çözeltiyi kuyucuklardan çıkarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak kuyucukları bir kez steril PBS ile yıkayın.

Daha sonra, kuyucuk başına 200 mikrolitre boyama solüsyonu ekleyin ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Son olarak, floresansı bir plaka okuyucu ile ölçün. Tedavi edilmemiş biyofilm kontrolünün yüzdesi olarak platformun performansını göstermek için iki gösterim yapıldı.

Bir cinchona alkaloid türev kütüphanesinin taranması, bir aktif bileşik tanımladı. Abietan tipi diterpenoidler ve türevlerinden oluşan bir kütüphanenin taranması, beş aktif bileşik tanımladı. Penisilin G ve Siprofloksasin, biyofilm oluşumundan önce canlılığı, biyokütleyi ve biyofilm matrisi PNAG içeriğini önemli ölçüde azaltır.

Ancak, maruziyet sonrası kullanıldığında durum böyle değildi. En belirgin sonuç, önceden oluşturulmuş biyofilmler yüksek konsantrasyonlarda Penisilin G ile muamele edildiğinde biyofilm matrisinin% 200'ün üzerine çıkmasıydı. İşlenmemiş biyofilm kuyuları için yeşil-kırmızı floresan oranlarının ortalaması, canlı hücrelerin baskınlığını gösterir.

Penisilin ile muamele edilen kuyularda ise yaklaşık %56 oranında canlı hücre bulunur. Penisilin tedavisinden sonra hayatta kalan hücreler, tedavi edilmemiş biyofilmlerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek miktarda hücre dışı polimerik madde veya EPS üretti. Bu prosedürü denerken, kuyucuklar arasında bakteri ve leke kontaminasyonunu önlemek için pipetin manuel kullanımına dikkat etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu platformu takiben, Staphylococcus aureus'a karşı etkili antibiyofilm bileşikleri hızlı bir şekilde tanımlanabilir ve karakterize edilebilir. Diğer bakteri türleri kullanılırsa, boyama protokollerinin başka bir optimizasyonuna ihtiyaç duyulacaktır, ancak platformun mantığı aynı kalacaktır.