Name: Farklı Olarak metile ölçümü INS Bir Biyomarker Islet β Hücre Ölümü İnsan serum Örnekleri DNA Türler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Öğrenin, dijital PCR kullanarak insan serumunda INS DNA türlerini ölçerek beta hücre ölümünü erken tespit etme yöntemini. Bu teknik tip 1 diyabet araştırmalarında klinik uygulama potansiyeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi UC4 DK104166 (RGM'ye) tarafından desteklenmiştir. Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi P30 DK097512 tarafından desteklenen Indiana Diyabet Araştırma Merkezi Çeviri Çekirdeği'nin yardımına teşekkür etmek istiyoruz.

Etik Beyanı: Protokoller Indiana Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Deneklerin ebeveynleri yazılı bilgilendirilmiş onam verdi ve 7 yaşından büyük çocuklar katılımları için onay verdi.
1. Serum İşleme
NOT: Tarif edildiği gibi tahlil, aşağıdaki gibi izole edilmiş insan serumu kullanılarak titizlikle test edilmiştir.
<ol>
	<li>Kanı bir kırmızı üst (katkı maddesi içermeyen; kaplamasız) kan alma tüpünde toplayın.</li>
	<li>Pıhtı oluşması için oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.</li>
	<li>Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı (serumu) serum depolanması için tasarlanmış yeni bir tüpe aktarın (polipropilen vidalı tüpler, boyut numunelere bağlıdır).</li>
	<li>DNA izolasyonu için hazır olana kadar numuneleri -80 ºC'de saklayın.</li>
</ol>
2. Serum DNA Ekstraksiyonu
NOT: DNA, bazı modifikasyonlarla üreticinin protokolünü takiben 50 μl serum (önerilir) kullanılarak bir DNA ekstraksiyon kiti ile ekstrakte edilir.
<ol>
	<li>Bir mikrosantrifüj tüpünde numune başına 200 μl lizis tamponu + 1 μl poli(A) (5 μg) hazırlayın. 15 saniye boyunca girdap. Adım 2.3'e kadar bir kenara koyun.</li>
	<li>-80 ºC dondurucudan serum örnekleri alın ve oda sıcaklığında çözdürün. Fosfat tamponlu salin (kalsiyum klorür ve magnezyum klorür ile PBS) kullanarak serum numune hacmini toplam 200 μl'ye getirin.</li>
	<li>Numuneye 20 μl proteaz (1.4 Anson birim / ml) ekleyerek numuneyi parçalayın, ardından 200 μl lizis tamponu/poliA karışımı (Adım 2.2'den itibaren) ve 8 saniye boyunca girdap yapın. Numuneyi 56 ° C'de 10 dakika inkübe edin, ardından bir mikrosantrifüjde (>10.000 x g) en yüksek hızda 7 saniye kısaca santrifüjleyin.</li>
	<li>Numuneye 230 μl% 100 etanol ekleyerek DNA'yı çökeltin ve 8 saniye boyunca vorteksleyin. En yüksek hızda (>10.000 x g) 7 saniye kısaca santrifüjleyin.</li>
	<li>Mini spin kolonuna 600 μl numune karışımı ekleyerek DNA'yı spin kolonuna uygulayın. 1 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın ve sütunu temiz bir tüpe yerleştirin.</li>
	<li>Kolona 500 μl yıkama tamponu 1 ekleyerek DNA'yı yıkayın. 1 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin. Akışı atın ve sütunu temiz bir tüpe yerleştirin. Kolona 500 μl yıkama tamponu 2 ekleyin ve 3 dakika boyunca en yüksek hızda (>10.000 x g) santrifüjleyin. Kolonu 1,5 ml'lik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve tekrar 1 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüjleyin.</li>
	<li>Kolonu yeni bir 1.5 ml'lik mikrosantrifüj tüpüne yerleştirerek ve doğrudan filtreye 60 μl elüsyon tamponu ekleyerek DNA'yı güçlendirin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için numuneler arasında uçları değiştirmek önemlidir. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin, ardından 6.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin. 60 μl daha elüsyon tamponu ekleyin ve 1 dakika boyunca 6.000 x g'da santrifüjleyin. </li>
	<li>DNA'yı daha sonra kullanmak üzere -20 ºC'de saklayın veya hemen bisülfit dönüşümüne geçin.</li>
</ol>
3. Bisülfit Dönüşümü
NOT: Bisülfit dönüşümü, bazı değişikliklerle üreticinin protokolüne uygun olarak bir bisülfit dönüştürme kiti kullanılarak gerçekleştirilir.
<ol>
	<li>Metillenmemiş sitozinleri urasillere dönüştürmek için, bir PCR tüpünde (tek 0.2 ml PCR tüpü veya 8 şeritli PCR tüpleri) 2.7. adımdan 20 μl DNA'ya 130 μl bisülfit dönüşüm reaktifi ekleyin. Kalan 40 μl DNA'yı ileride kullanmak veya replike reaksiyonlarda kullanmak üzere saklayın. Yukarı ve aşağı pipetleyerek 20 kez karıştırın ve yanlarda veya kapakta damla olmadığından emin olmak için kısa bir süre santrifüjleyin. Bir su banyosunda veya termal döngüleyicide şu şekilde inkübe edin: 98 °C 8 dakika, 54 °C 60 dakika, 4 °C 5 dakika.
	<ol>
		<li>Adım 3.2'ye geçin veya 4 °C'de 20 saate kadar saklayın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Döndürme kolonuna 600 μl bağlayıcı tampon ekleyin ve kolonu sağlanan toplama tüpüne yerleştirin. Bisülfitlenmiş DNA'yı kolona uygulayın ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. 30 saniye boyunca en yüksek hızda (>10.000 x g) santrifüjleyin.</li>
	<li>Kolona 100 μl yıkama tamponu ekleyerek DNA'yı yıkayın ve 30 saniye boyunca en yüksek hızda (>10.000 x g) santrifüjleyin.</li>
	<li>Kolona 200 μl kükürt giderme tamponu ekleyerek metillenmemiş sitozinlerin urasile dönüşümünü sonlandırmak için sülfonat grubunu çıkarmak için kükürt giderme işlemi gerçekleştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika bekletin, ardından 30 saniye boyunca en yüksek hızda (>10.000 x g) santrifüjleyin.</li>
	<li>Kolona 200 μl yıkama tamponu ekleyerek DNA'yı yıkayın ve 30 saniye boyunca tam hızda santrifüjleyin. Akışı atın ve bu yıkama adımını tekrarlayın.</li>
	<li>Kolonu 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Doğrudan kolon filtresine 10 μl elüsyon tamponu ekleyerek DNA'yı elute edin. 1 dakika inkübe edin. DNA'yı elüte etmek için tam hızda 30 saniye santrifüjleyin. A260. 'de spektrofotometri ile geri kazanılan DNA'yı ölçün
	NOT: Spektrofotometri ile tespit edilen DNA, esas olarak yukarıdaki adım 2.3'te eklenen taşıyıcı poliA DNA'sını temsil eder. Tipik olarak, poliA'nın geri kazanımı girişin %≥85'idir (>4.25 μg).</li>
	<li>Dijital PCR ile devam etmeye hazır olana kadar DNA'yı -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>
4. Multipleks Dijital PCR
<ol>
	<li>Her numune ve kontrol için yeterli çözelti içeren bir ana karışım yapın. Su içeren en az bir numune (negatif kontrol), metillenmemiş INS içeren bir plazmit numunesi (1 pg, pozitif kontrol), metillenmiş INS içeren bir plazmit numunesi (1 pg, pozitif kontrol) ve 1:1 plazmit karışımı içeren bir numune ekleyin.
	<ol>
		<li>PCR ana karışımını hazırlamak için, PCR tamponunun reaksiyonu başına 12.5 μl (ör., 10 numune başına 125 μl), reaksiyon primer/prob karışımı başına 1.25 μl (örn., 10 numune başına 12.5 μl), reaksiyon suyu başına 8.25 μl (örn., 10 numune başına 82.5 μl), reaksiyon başına 0.5 μl EcoR1 enzimi (örn., 10 numune başına 5 μl). 
		NOT: Burada kullanılan astarlar ve problar aşağıdaki gibidir: İleri Astar: 5'-GGAAATTGTAGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'; Ters Astar: 5'-AAAACCCATCTCCCCTTACCTATCA-3'; FAM sondası: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; VIC probu: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>96 oyuklu bir plakada multipleks PCR reaksiyonu ayarlayın. Her kuyucuğa 19,5 μl ana karışım ekleyin. Her uygun oyuğa 2.5 μl bisülfit dönüştürülmüş DNA örneği ekleyin (kalan 7.5 μl bisülfit dönüştürülmüş DNA'yı kaydedin veya replikasyon reaksiyonlarında kullanın). Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. 
	NOT: Arka arkaya 8 kuyunun tümü numune veya tampon kontrolü içermelidir.</li>
	<li>Bir plaka kapatıcı kullanarak bir folyo conta ile kapatın ve kuyucukların kenarlarında sıvı kalmayana kadar bir plaka döndürücüde santrifüjleyin.</li>
	<li>Otomatik damlacık üretecini dokunmatik ekranda ayarlayın. 
	NOT: Kartuştaki 8 kuyucuğun tümü numune veya tampon kontrolü içermelidir.
	<ol>
		<li>Adım 4.2'den itibaren 96 oyuklu plaka üzerinde numunelerin yüklendiği satırlara dokunarak kullanılan satır sayısını ayarlayın ve etkin bir satırı belirtmek için satırı mavi renkle vurgulayın.</li>
		<li>Kirlenmeyi önlemek için sarf malzemelerini arkadan öne doğru yükleyin. Başlamak için, cihazın arka sırası boyunca kartuşlar ekleyin. Uçları cihazın orta sırasına yükleyin. 
		NOT: Kartuşlar tutuculara yalnızca doğru yönde sığabilir.</li>
		<li>96 oyuklu plakayı cihaza yerleştirin. -20 °C dondurucudan soğuk bir blok çıkarın ve içine yeni etekli 96 oyuklu bir plaka yerleştirin. Numune yüklü 96 oyuklu plakanın yanındaki cihazın içine yerleştirin.</li>
		<li>Cihazın önündeki dağıtıcıya yağ ekleyin. Dokunmatik ekranda yağ türünü seçin.</li>
		<li>Koşuyu başlatmak için mavi başlat düğmesine dokunun. Plaka kurulumunu onaylayın ve başlamak için çalıştırmayı başlat düğmesine dokunun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bitirdikten sonra, yeni oluşan damlacıkları içeren 96 oyuklu plakayı çıkarın ve bir plaka kapatıcı kullanarak bir folyo conta ile kapatın.</li>
	<li>Aşağıdaki programı kullanarak bir termal döngüleyici üzerinde PCR10 gerçekleştirin: 95 °C için 10:00 dakika; 40 döngü: 94 °C için 00:30 dakika, 57.5 °C için 01:00 dakika; 98 °C için 10:00 dakika; 12 °C 10 dakika veya 24 saate kadar.</li>
	<li>Plakayı damlacık okuyucunun üzerine yerleştirin ve okuyucuyu ayarlayın.
	<ol>
		<li>Kurulum sekmesine tıklayın. Yeni bir şablon > tıklayarak yeni bir şablon açın. Bir dosya adı girin.</li>
		<li>Her örnek için parametreleri ayarlamak için kuyu düzenleyicisini kullanın. Her örneğe benzersiz bir ad verin, deneyi Nadir Olay Algılama (R-RED) olarak ayarlayın ve ana karışımı adım 4.1'de kullanılan karışıma ayarlayın.</li>
		<li>Hedef 1'e bir ad verin (yani metillenmemiş) ve Hedef 1'i bilinmeyen (U) olarak ayarlayın. Hedef 2'ye bir isim verin (yani metillenmiş) ve Hedef 2'yi referans ( R ) olarak ayarlayın .</li>
		<li>Çalıştırmayı başlatmak için Çalıştır sekmesine tıklayın. Çalıştırma seçenekleri penceresinde algılama kimyasını (FAM/VIC) seçin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Veri Analizi
<ol>
	<li>Sonuçları analiz sekmesinde açın ve pozitif kontrollere dayalı 2 boyutlu çizim kullanarak analiz edin (bkz. Şekil 1).</li>
	<li>Damlacık okuyucu tarafından oluşturulan CSV dosyasını veri analizi için bir elektronik tablo programına aktarın.</li>
	<li>"μl başına kopya" serum oluşturmak için şu formülü kullanın: (konsantrasyon * 250) / (μl cinsinden DNA izolasyonu için kullanılan serum hacmi). 6 
	NOT: Veriler, normal dağılımı sağlamak için insan serumundan alındığında tipik olarak günlük10'a dönüştürülür. Alternatif olarak, veriler bir log10 ölçeğinde çizilebilir ve parametrik olmayan istatistiklerle analiz edilebilir.</li>
</ol>
<style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px; font: 16.0px 'Times New Roman'}
span.s1 {yazı tipi: 16.0px Calibri}
</style>

<ol><li>Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+crosstalk+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell crosstalk in type 1 diabetes.</a> Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).</li>
<li>Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+beta-cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).</li>
<li>Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+immunobiology+to+%CE%B2-cell+biology%3A+the+changing+perspective+on+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes.</a> Islets. 6 (2), 28778(2014).</li>
<li>Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITN-JDRF+Type+1+Diabetes+Combination+Therapy+Assessment+Group+Developing+combination+immunotherapies+for+type+1+diabetes%3A+recommendations+from+the+ITN-JDRF+Type+1+Diabetes+Combination+Therapy+Assessment+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group.</a> Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).</li>
<li>Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hirnetwork.org/">https://hirnetwork.org/</a> (2016).</li>
<li>Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevations+in+Circulating+Methylated+and+Unmethylated+Preproinsulin+DNA+in+New-Onset+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-Specific+Methylation+of+Human+Insulin+Gene+and+PCR+Assay+for+Monitoring+Beta+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death.</a> PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).</li>
<li>Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2+cell+death+and+dysfunction+during+type+1+diabetes+development+in+at-risk+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals.</a> J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).</li>
<li>Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tissue-specific+cell+death+using+methylation+patterns+of+circulating+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).</li>
<li>Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-directed+enzymatic+amplification+of+DNA+with+a+thermostable+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.</a> Science. 239 (4839), 487-491 (1988).</li>
<li>Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+gene+expression+is+regulated+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Insulin gene expression is regulated by DNA methylation.</a> PloS One. 4 (9), 6953(2009).</li>
<li>Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+%CE%B2+cell+death+in+diabetes+using+differentially+methylated+circulating+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).</li>
<li>Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+islet+%CE%B2-cell+death+in+vivo+by+multiplex+PCR+analysis+of+differentially+methylated+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA.</a> Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).</li>
<li>Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+bisulphite+modification+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: bisulphite modification and analysis.</a> J. Vis. Exp. (56), (2011).</li>
<li>Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR+unraveled%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR unraveled.</a> Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+methylation-specific+polymerase+chain+reaction+method+for+monitoring+beta+cell+death+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes.</a> PloS One. 7 (10), 47942(2012).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Sozzi, G., Roz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+storage+of+whole+plasma+or+isolated+plasma+DNA+on+the+results+of+circulating+DNA+quantification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays.</a> J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

DNA methyltransferases tarafından sitozinler metilasyon birçok genin de transkripsiyon epigenetik kontrol sağlar. İnsanlarda INS gen neredeyse sadece hücrelerde β adacığın ifade ve onun transkripsiyon 11 susturmak için INS geninde sitozinlerin metilasyon sıklığı arasında bir ilişki olması görünür. 13 - Bunun gibi, çoğu hücre tipleri hücreler 11 ß göre çeşitli sitozinlerin de INS geninin metilasyon önemli ölçüde daha yüksek frekansları göstermektedir....

Tip 1 diyabet (T1D) oto-reaktif T hücreleri 1 hücrelerden β insulin üreten bağımsız tahrip edilmesi ile karakterize edilen bir otoimmün hastalıktır. T1D tanısı tipik insülin eksikliği delil olarak ketoasidoz ile karşımıza olabilir yalın, genç birey, hiperglisemi (kan şekeri&gt; 200 mg / dl) ölçümü üzerine yapılır. Tip 1 diyabetin tanısı zamanda, β hücre fonksiyonu ve kütlenin önemli bir kayıp kanıtlar vardır (50 -% 90) 2. Klinik çalışmalarda, tanı anında tesis edildi birkaç immün modülatör ilaçlar, hastalığın klinik remisyon sonuçlanmıştır β hücre fonksiyonu (ve muhtemelen kütle), ancak hiçbiri stabilizasyonu geliştirilmesi için çağrı yükseltti bir bulgu sonuçlandı hastalığın erken tespiti için ve için biyomarkerların kombinasyonun etkinliği uzunlamasına izleme 3,4 terapiler. uluslararası konsorsiyumlar tarafından çabalar, böyle birHeath 5 National Institutes of Human Adacık Araştırma Ağı Konsorsiyumu s, T1D içinde β hücre stres ve ölüm odaklanmak Biyobelirteçleri geliştirilmesi gerektiğini vurgulamışlardır. 9 - Bu çalışmalar doğrultusunda, grubumuz ve diğerleri son zamanlarda β hücreleri 6 ölüyor öncelikle ortaya çıkan epigenetik değiştirilmiş DNA fragmanları dolaşan ölçerek biyobelirtecin deneyleri geliştirdik. Bugüne kadar yayınlanan deneylerin tümünde, odak diğer hücre tiplerine göre kodlama ve yükseltici bölgelerinde metillenmemiş CpG bölgelerinin daha yüksek seviyede gösteren insan geni kodlayan prepro (INS) ölçülmesi olmuştur. Unmethylated INS DNA fragmanları kurtuluş (nekrotik, apoptotik) β hücreleri ölüyor öncelikle kaynaklanan olarak varsayılmıştır. Bizim son çalışmalar gençlik, pozisyon -69 bp metillenmemiş ve metile hem INS DNA&#39;daki yükselmeler (göreceli t olduğunu gösterdiO yeni başlayan T1D gözlendi) sitesi başlatmak ve birlikte bu nüfus 6 gibi özel biyomarkerlar görev transkripsiyon bölgesinin. Bu biyomarker deneyler, izole edilmiş bir DNA bisülfit dönüştürülmesi takip ticari eğirme kitleri kullanılarak serum veya plazma hücre içermeyen DNA izolasyonu, içeren (urasillere olmayan metillenmiş sitosinler dönüştürmek için sağlam metillenmiş sitosinler bırakarak). Bu yazıda farklı şekilde metillenmiş INS DNA serum örneği toplama, serumdan hücre içermeyen DNA, bisülfit dönüşüm ve (bundan böyle, dijital PCR) damlacık dijital PCR performansı izolasyonu teknik yönlerini açıklar.

<table><tbody><tr><td>Kırmızı Üst Vacutainer&nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td>366441</td><td>katkı maddesi içermez, kaplamasız iç kısım, 10 ml</td></tr><tr><td>Kriyoviyal Tüp</td><td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>polipropilen, vidalı kapaklı tüp, her boyutta</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Kan Mini Kiti</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly (A)</td> <td>Sigma</td><td>P9403</td><td>TE tamponunda (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) 5 & mikro; g/&mikro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Mutlak Etanol (200 Kanıt)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (CaCl<alt>2</alt> ve MgCl<alt>2</alt> ile)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 8 şeritli Tüpler</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>8 şeritli Kapaklar, Dome</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Metilasyon-Yıldırım</td><td>Kiti Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>Problar için ddPCR Supermix (dUTP yok)</td><td>Biorad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>Problar için Tampon Kontrolü</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Metillenmemiş/Metillenmiş Primer/Prob karışımı</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR Plakası 96, yarı etekli</td><td>Eppendorf</td><td>951020346</td><td></td></tr><tr><td>Delinebilir Folyo Isı Yalıtımı</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR Plaka Kapatıcı</td><td>Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG Damlacık Dijital PCR Sistemi</td><td>Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>Problar için Otomatik Damlacık Üretim Yağı</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>DG32 Otomatik Damlacık Jeneratörü için Kartuş</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Damlacık Jeneratörü için Pipet Uçları</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Damlacık Jeneratörü için Pipet Ucu Kutuları</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dokunmatik Termal Döngüleyici</td><td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Damlacık Okuyucu</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Damlacık Okuyucu Yağı</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

farklı olarak metile ölçümü<em&gt; ins</em&gt; bir biyomarker islet β hücre Ölümü İnsan serum Örnekleri dna türler

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

Adacık β hücrelerinin ölümünün, hemen hemen tüm diyabet formlarının patogenezinin altında yattığı ve özellikle tip 1 diyabette açık hiperglisemi gelişiminden önce geldiği düşünülmektedir. β hücre ölümünün hassas ve güvenilir biyobelirteçlerinin geliştirilmesi, diyabet gelişimini önlemek veya geciktirmek için erken terapötik müdahaleye izin verebilir. Son zamanlarda, kendi gruplarımız da dahil olmak üzere birçok grup, dolaşımdaki preproinsülini (INS) kodlayan hücresiz, diferansiyel olarak metillenmiş DNA'nın, tip 1 öncesi diyabet ve yeni başlangıçlı tip 1 diyabette β hücre ölümü ile ilişkili olduğunu bildirmiştir. Burada, -69 bp pozisyonunda (transkripsiyonel başlangıç bölgesine göre) sitozinde diferansiyel olarak metillenen hücresiz INS DNA'nın ölçümü için dijital PCR kullanan adım adım bir protokol sunuyoruz. Testin -69 bp pozisyonunda metillenmiş ve metillenmemiş sitozin arasında ayrım yapabildiğini, birkaç büyüklük sırasına göre doğrusal olduğunu, DNA kopya sayılarının mutlak kantitasyonunu sağladığını ve yeni başlangıçlı tip 1 diyabetli bireylerden insan serumu örneklerine uygulanabileceğini ve hastalıksız kontroller. Burada açıklanan protokol, ister dolaşımdan ister izole edilmiş hücre ve dokulardan olsun, diferansiyel olarak metillenmiş sitozinlerin saptanmasının istendiği herhangi bir DNA türüne uyarlanabilir ve DNA fragmanlarının mutlak kantitasyonunu sağlayabilir.

Uygun verileri yorumlamak için, her dijital PCR vadede unmethylated ve metile hedef INS DNA hem de plazmid denetimlerini kullanın. Bu kontroller metil ve unmethylated DNA karşılık gelen sinyaller açıkça ayırt olduğundan emin olun. Şekil 1, bisülfitle dönüştürülmüş metillenmemiş INS DNA (Şekil 1A) ihtiva eden plasmid kontrol, metil INS DNA (Şekil 1B) için damlacık tekabül eden 2-B dağılım grafiklerini gösterir, ...

Adacık β hücre ölümü, tip 1 diyabet gelişiminden önce gelir ve bu sürecin tespit edilmesi, erken terapötik müdahaleye izin verebilir. Burada, β hücre ölümünün bir biyobelirteci olarak insan serumundaki diferansiyel olarak metillenmiş INS DNA türlerinin nasıl ölçüleceğine dair ayrıntılı bir açıklama sunuyoruz.

Farklı Olarak metile ölçümü<em&gt; INS</em&gt; Bir Biyomarker Islet β Hücre Ölümü İnsan serum Örnekleri DNA Türler

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

Bu prosedürün genel amacı, beta hücre ölümü için bir biyobelirteç olarak insan serumundaki farklı şekilde metillenmiş preproinsulin DNA türlerini ölçmektir. Bu yöntem, tip 1 diyabetin gelişimi sırasında belirli bir zaman noktasında beta hücre ölümünün gerçekleşip gerçekleşmediği gibi, diyabet alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, dijital PCR kullanarak çok küçük miktardaki serumda beta hücre ölüm miktarını belirleyebilmemizdir.Metin protokolüne uygun olarak insan kan örneklerinden serum topladıktan sonra, bir mikrosantrifüj tüpünde örnek başına 200 µL lizis tamponu ve 1 µL poly(A) hazırlayın. Tüpü 15 saniye boyunca vorteksleyin. Serum örneklerini -80 °C dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında çözün.Ardından, serum örneği hacmini 200 µL'ye tamamlamak için PBS kullanın. 20 µL proteaz ve 200 µL poly(A)mix lizis tamponu ekleyerek örnekleri lize edin. Tüpleri sekiz saniye boyunca vorteksleyin ve örnekleri 56 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, tüpleri maksimum hızda yedi saniye boyunca santrifüjleyin. Örneklerin üzerine 230 µL %100 etanol ekleyerek DNA'yı çöktürün ve tüpleri sekiz saniye boyunca vorteksleyin. Daha sonra, tüpl

measurement-differentially-methylated-ins-dna-species-human-serum

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Hücre-aracılı lenfositotoksisite (KML) deneyleri, in vitro otoreaktif yanıtları ve hücre ölümü çalışma mekanizmaları test etmek için kullanılabilir. Ancak, canlı hücre floresan boyalar, tipi ve hücre ölümü gibi kullanılan yollar kinetiği konfokal mikroskopik görüntüleme teknikleri kullanılarak daha ayrıntılı olarak incelenebilir.

Sitotoksik T Lenfositler Beta Hücre Ölümü aracılığı ile değerlendirin yöntemleri

Bu video, insan serumundaki adacık otoantikorlarının elektrokemilüminesans tespitini göstermektedir. Serumdaki antikorlar, rutenyum konjuge antijeni biyotinile yakalama antijenine köprü kurarak elektrokemilüminesans ölçümleri ile tespit edilen kompleksler oluşturur.

Elektrokemilüminesans Testi Kullanılarak İnsan Adacığı Otoantikorlarının Tespiti

Lazer mikrodisseksiyon parankiminde dakika miktarlarda seçili hücrelerin iyileşme sağlayan bir tekniktir. Burada Transkriptomik çalışmaları için kullanılacak cerrahi yöntemlerle alınan insan pankreas adacık elde etmek için bir protokol açıklar. Tüm protokol böylece toplama kolaylaştırılması insan beta hücrelerinin içsel otofloresansı, geliştirir.

Cerrahi Örnekler kaynaktan İnsan pankreas adacıklarının Lazer Diseksiyon için Geliştirilmiş Protokolü

Burada, biz electrochemiluminescence (ECL) deneyleri kullanarak insan adacık otoantikorlar algılamak için yöntemler sundu. Tip 1 diyabet, tahmin etmek için kullanılan iletişim kuralı, üzerine otoantikorlar diğer otoimmün hastalıklar için algılamak için genişletilebilir.

Electrochemiluminescence deneyleri için insan adacık otoantikorlar

Burada, bir damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisini kullanarak izole insan pankreatik izletden tek hücrelerin yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Insan pankreatik Izletinin tek hücreli RNA sıralaması ve Analizi

Bu çalışma, pankreas adacıklarında sitokin kaynaklı apoptozu ve β hücreye özgü ölümü değerlendirmek için konfokal mikroskopi ile birlikte hücre ölümü ve apoptozun çok boyamalı floresan bazlı belirteçlerini kullanmaktadır. Hücre dışı uyaranlara yanıt olarak hücre ölümü ve apoptozdaki mekansal ve zamansal değişiklikleri ortaya çıkarır.

İzole Pankreas Adacık Tedavisi ve Apoptoz Ölçümü

Burada, paralel sirkadiyen biyolüminesansı ve insan adacık hücrelerinin ve birincil miyotüplerin salgı aktivitesini izlemek için ayarları açıklıyoruz. Bunun için, bir lusiferaz çekirdek saat raportörünün lentiviral gen iletimini, ardından in vitro senkronizasyonu ve sürekli hücre perifüzyonu ile çıkış ortamının toplanmasını kullandık.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Burada, hücre izolasyonundan dizileme sonuçlarının temel analizine kadar, genom çapında memeli replikasyon zamanlamasını haritalamak için nispeten hızlı ve basit bir yaklaşımı açıklıyoruz. Protokolü takiben temsili bir replikasyon programının genomik haritası sağlanacaktır.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

PCR aracılı gen modifikasyonu görselleştirme ve maya hücreleri ve proteinleri kantitatif kolaylaştırır Candida türleri, floresan protein füzyonları oluşturmak için de kullanılabilir. Bu yazıda, Candida parapsilosis bir floresan protein füzyon (Eno1-FP) oluşturmak için bir strateji sunmak.

Floresan protein füzyonları üretilmesi<em&gt; Candida</em&gt; Türler

Burada, RNA örneklerinde genomik DNA (gDNA) kirlilik izleme için bir iletişim kuralı mevcut. Sunulan yöntem astar özel ribozomal DNA (rDNA) gen iç kopya etmek spacer bölge (ITS) için kullanır. Yöntem güvenilir ve hassas algılama DNA kirlenme çoğu Ökaryotlar ve prokaryotlar için uygundur.

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

Öğrenin, dijital PCR kullanarak insan serumunda INS DNA türlerini ölçerek beta hücre ölümünü erken tespit etme yöntemini. Bu teknik tip 1 diyabet araştırmalarında klinik uygulama potansiyeli sunar.

Farklı Olarak metile ölçümü

Daha fazla video keşfet