Pinewood Nematodu gözlem ve Çiftleşme Davranış miktarının belirlenmesi, Orijinli olanlar

Bu prosedürün genel amacı, çam ağacı nematodu, Bursaphelenchus xylophilus'un çiftleşme davranışını gözlemlemektir. Bu yöntem, nematod ile ilgili psikolojik çalışmaların ilerlemesine yardımcı olabilir. Özellikle çam ağacı nematodunun çiftleşme davranışının gözlemlenmesi ile ilgilenir.

Bu tekniğin temel avantajı, bakire yetişkinlerin elde edilebilmesidir, bu da yetişkin çiftleşme davranışını gözlemlemeyi çok daha kolay hale getirir. Bu tekniğin sonuçları, benzer yaşam döngüsü davranışlarına sahip oldukları için nematodların daha geniş çalışmasına doğru uzanır. Bu yöntemin gösterilmesi kritiktir, çünkü bakire yetişkin nematodların edinimi zordur, çünkü gelişimsel nematodların kısıtlamaları pratik gerektirir ve erken birinci evre gençlerde erkekleri dişilerden kesin olarak ayırt etmek kolay değildir.

Çam ağacı nematodlarını kültürlemek için önce patates dekstroz agar plakaları hazırlayın. Bir plakayı aşılamak için, bir betritus senaria matından 10 milimetre çapında bir mantar matı parçası delin ve yeni bir PDA plakasının ortasına koyun. Mantar matını karanlıkta 25 santigrat derecede beş gün boyunca kültürleyin.

Beş gün sonra, çam ağacı nematodlarını hazırlanan Petri kabına ekleyin ve karanlıkta 25 santigrat derecede üç gün boyunca kültürleyin. Nematodları mantardan izole etmek için önce bir toplama aracı hazırlayın. Bir huninin altına kenetlenmiş bir lastik tüp yerleştirin ve baermann huni aparatını monte etmek için hazırlanan huniyi bir rafta tutun.

Ardından, huninin ağzına gazlı bez yerine iki kat filtre kağıdı yerleştirin. Şimdi, mantar kültürlerini huni kurulumuna aktarın ve mantar matı daldırılana kadar su ekleyin. İki saat sonra, nematodlar mantar kültüründen çıkacak, filtre kağıdını geçecek ve baermann hunisinin en alt kısmına yerleşecektir.

Huninin altına 15 mililitrelik bir tüp yerleştirerek nematodları toplayın, ardından nematodları içerecek birkaç damla su toplamak için kelepçeyi yavaşça serbest bırakın. Nematod koleksiyonlarını oda sıcaklığında iki dakika boyunca 3.000 G'de santrifüjleyin. Daha sonra üst su seviyesini ayırın ve solucanları bir mililitre suda tekrar süspanse edin.

Nematodların süspansiyonunu altı santimetrelik bir cam tabağa aktarın ve nematodların serbestçe yüzmesine yardımcı olmak için üç mililitre su ekleyin. Şimdi, bakire stoklar yapmak için yumurta toplayın. Çanağı karanlık bir kuluçka makinesine aktarın ve hamile kadınların 10 dakika boyunca yumurta bırakmasına izin verin.

Glikoprotein yüzeyleri nedeniyle yumurtalar cama yapışacaktır. Daha sonra, yemeğe yapışan yumurtaları rahatsız etmemek için solucanlarla birlikte suyu dikkatlice çıkarın. Ardından, yumurtaların kurumasını önlemek için tabağa hızlıca 3 mililitre su ekleyin.

Tüm larvaları ve yetişkinleri çıkarmak ve saf yumurtaları elde etmek için bu yumurta temizleme işlemini en az üç kez tekrarlayın. Yıkanmış saf yumurta koleksiyonuna beş mililitre su ekleyin ve yumurtaları karanlıkta 25 santigrat derecede geliştirmeye devam edin. Yumurta kültürüne başladıktan 24 saat sonra, yumurtadan çıkan J2 larvalarını toplayın.

J2 larvalarını dikkatlice 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra koleksiyonu iki dakika boyunca 3.000 G'de santrifüjleyin. Üst su tabakasını ayırın ve 200 mikrolitre su ekleyin.

Ardından, J2 larvalarını bir mantar matı ile hazırlanmış bir PDA plakası üzerinde kültürleyin. 52 saat sonra, J2 larvalarının çoğu erken evre J4 larvalarına dönüşmüş olacaktır. Bir baermann hunisi monte edin ve nematodları daha önce tarif edildiği gibi iki saat boyunca mantar kültürlerinden çıkarın.

Beklerken solucanları toplamak için bir iğne hazırlayın. Bir alkol brülörü üzerinde ısıtılan bir cam kılcal damardan bir uç çizin. Ucun çapının yaklaşık 50 mikron olması, kabaca yetişkin bir nematodun vücut genişliği kadar olması gerekir.

İki saat sonra, J4 larvalarını daha önce tarif edildiği gibi temiz bir Petri kabına aktarın. Şimdi, nematodları stereo mikroskop altında cinsiyetlendirin. Larvaların yaklaşık üçte ikisi genellikle dişidir.

Dişinin vulvası açıkça erkeğin anatomisinden farklıdır, ancak solucanlar çok aktif olduğu için cinsel ilişki pratik yapacaktır. Bu protokolün en kritik adımı, erken ilk aşamada erkekleri dişilerden kesin olarak ayırt etmek ve ayırmaktır. Aksi takdirde, yetişkin olduklarında karışık ve kötü olacaklar.

Bu da çiftleşmeyi gözlemlemeyi zorlaştırıyor. Yavaş yavaş, solucanları toplayın ve erkekler veya dişiler için bir slaytta bir damla suya aktarın. Başarıyı sağlamak için, iki farklı kişi cinsiyet dağılımını iki kez kontrol etmelidir.

Şimdi, cinsiyetlendirilmiş solucanları içeren su damlasını uygun mantar kültürü plakasına aktarın. Ardından, çiftleşme davranışlarını incelemeden önce bakireleri 24 saat daha kültürleyin. Çam ağacı nematodu çiftleşme davranışını gözlemlemek için, önce kuyucuklarının her birine 200 mikrolitre su ekleyerek birkaç içbükey slayt hazırlayın.

Ardından, hazırlanmış tek bir bakire yetişkin seçin ve hazırlanmış bir slayta aktarın. Bakire yetişkinleri, yeni sulu ortama adapte olmalarını sağlamak için bir saat boyunca kuyunun içinde tutun. Bir saat sonra, bir pipet kullanarak kuyuya karşı cinsten bekar bir bakire yetişkin ekleyin.

Ardından, stereo mikroskop altında eşleşme davranışını gözlemleyin ve kantitatif analiz için davranışı filme alın. Tüm çiftleşme süreci genellikle iki saat içinde biter. Her 30 dakikada bir, buharlaşmayı telafi etmek için 50 mikrolitre su ekleyin.

Çiftleşme seçimini ve interseksüel rekabeti araştırmak için, iki farklı kombinasyondaki bakire nematodları gruplandırın ve gözlemleyin. Bakire yetişkinlerin çiftleşme başarı oranı yaklaşık% 87 idi ve bu rastgele seçilen yetişkinlerden çok daha yüksekti. Çiftlerin dört farklı aşama içeren tüm çiftleşme sürecini tamamlaması ortalama 83 dakika sürdü.

Aramak, iletişim kurmak, çiftleşmek ve oyalanmak. Bu aşamalar içinde, birçok spesifik davranış kalıbı gözlemlenebilir. Bir dişi birkaç erkekle karşılaştığında, bariz bir çiftleşme seçeneği vardı.

Dişi genellikle baş, vücut, kuyruk ve genital bölgedeki bir erkeğe temas etmek için başını kullanır. Dişi daha sonra erkekle çiftleşti ya da onu çabucak terk etti ve başka bir erkeğe yüzdü. Çiftleşme başarı oranları, farklı nematod kombinasyonları için ilk temastan sonra ölçüldü.

İnterseksüel rekabet de meydana geldi. Bir bakire dişi üç bakire erkekle karıştırıldığında, erkekler onunla çiftleşme şansı elde etmek için dişiye mümkün olduğunca yaklaşmaya ve onunla iletişim kurmaya çalıştılar. Vulva işgal edildiğinde, diğer erkekler şiddetli vücut salınımları kullanarak veya onları ayırmak için sürükleyerek çiftleşme sürecini bozmaya çalıştılar.

Kadın interseksüel rekabetinin, erkek interseksüel rekabetine az ya da çok benzer olduğu görüldü. İnseksüel rekabet nedeniyle, farklı kombinasyonlarla yapılan çiftleşme frekansları önemli ölçüde farklıydı. Geliştirildikten sonra, bu teknik nematodlarda davranışsal ekolojinin araştırılmasının yolunu açtı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse 12 gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, bakire yetişkinler elde etmek için erkekleri dişilerden, erken dört aşama gençlerden kesin olarak ayırmayı hatırlamak önemlidir.