Name: Pinewood Nematodu gözlem ve Çiftleşme Davranış miktarının belirlenmesi, Orijinli olanlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Öğrenin Bursaphelenchus xylophilus çiftleşme davranışlarını gözlemleme yöntemini. Bakire yetişkin nematodların elde edilmesi ve cinsiyet ayrımı teknikleriyle davranışsal biyoloji çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Najie Zhu ve Liqun Bai, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu. Bu eser mali Kamu Refah Orman Bilimsel Araştırma Fonu Özel (201204501) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31170604, 31270688 ve 31570638) tarafından desteklenmiştir. Biz İngilizce yazılı onların yararlı öneriler Dr. Holighaus Gerrit ve Dr Danielle Hickford teşekkür ederim.

Virgin Yetişkin Nematodlar 1. kazanılması <ol><li> Pinewood nematod izolatı ve kültür koşulları B. xylophilus&#39;un Nxy61 aslen Çin&#39;de Zhejiang eyaletinin Ningbo alanında hastalıklı Pinus massoniana elde edildi izole: NOT. <ol><li> (PDA Malzemelerin Tablo bakınız) Patates Dekstroz Agar hazırlayın Botrytis cinerea yetiştirmek için plakaları. </li><li> Aşılaması için, B. cinerea mat 10 mm çaplı mantar mat bir parça zımba ve yeni bir PDA plakanın ortasına koydu. Kültür karanlıkta 25 ° C&#39;de 5 gün boyunca B. cinerea. </li><li> Kültür karanlıkta 25 ° C &#39;de B. cinerea içeren hazırlanmış bir petri çam nematodları. </li></ol></li><li> B. xylophilus&#39;un yumurta kazanılması <ol><li> bir huni altında kenetlenmiş kauçuk tüp yerleştirin ve montajı rafa hazırlanan huni tutunBaermann huni cihazı. huni ağzına filtre kağıdı yerine gazlı bez iki kat yerleştirin. </li><li> huni kurulum mantar kültürleri aktarın ve mantar mat batırılır kadar su ekleyin. 2 saat bekleyin ve nematod, mantar kültürü çıkıp filtre kağıdı çapraz ve Baermann huninin en alt kısmında yerleşmek olacaktır. </li><li> 15 ml tüp içine tüpün tabanından su damlaları ilk çift toplamak ve yavaş tüp kelepçe bırakarak nematodları toplar. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 3000 x g&#39;de yukarıda koleksiyonları santrifüjleyin. </li><li> Bir pipet ile suyun üst tabaka uzaklaştırılır ve çift damıtılmış steril (dd), 1 mL H2O ile yeniden süspanse </li><li> Bir pipet ile, yeni bir cam Petri kabı (6 cm çapında) Yukarıdaki tabanda aktarın. Nematod özgürce yüzmek mümkün olduğundan emin olmak için Petri kabı steril dd H2O 3 mL ekleyin. </li><li> glas nematod tutunKaranlıkta 25 ° C &#39;de 10 dakika süre ile Petri kabı s. Yumurta hamile kadın tarafından döşenecek. Çünkü onların glikoprotein yüzeyinin, yumurta cam Petri kabı altına sopa olacak. </li><li> Yumurta bozmadan dikkatlice su ve solucanları temizler. Kurumasını yumurta önlemek için hemen cam Petri kabı steril dd H2O 3 mL ekleyin. </li><li> Adımı tekrarlayın 1.2.8 3x tüm larvaları ve yetişkin kaldırmak ve saf yumurta elde etmek. Petri kabı steril dd, H2O ilave 2 mL (toplam 5 mL) ilave edilir. </li></ol></li><li> Dördüncü aşama gençlerin kazanılması (J4 larva) <ol><li> Hatch 25 ° C&#39;de karanlıkta, 24 saat boyunca toplanan yumurtalar J2 larva elde edildi. </li><li> 2 dakika boyunca 3000 x g&#39;de 15 ml tüp, santrifüj bir pipet ile J2 larvaları transferi ve suyun üst tabakayı kaldırmak. </li><li> Steril dd, H2O 200 uL J2 larvaları yeniden süspanse ve aktarmakB. cinerea içeren PDA plakası. </li><li> Kültür karanlıkta 25 ° C &#39;de 52 saat boyunca J2 larva. Bu zaman noktasında, en J2 larva J4 larvaların erken aşamada haline olacaktır. </li></ol></li><li> Bakire yetişkin nematod kazanılması <ol><li> bir alkol brülör üzerine ısıtıldıktan sonra bir cam kılcal çizerek nematod toplamak için bir iğne hazırlayın. NOT: Bu kılcal iğne ucu, genellikle tek bir nematodu alınması için bir araç olarak kullanılabilir ve böylece, çapı 50 mikron, yetişkin bir nematod kabaca gövde genişliği olmalıdır. </li><li> Bir Baermann hunisi monte ve adımları 1.2.1&#39;de tarif edildiği gibi 2 saat boyunca mantar kültürlerinden nematod çıkarmak - 1.2.3. </li><li> Temiz bir Petri kabı içine su ile J4 aktarın. </li><li> Bir stereomikroskop altında nematod gözlemlemek ve Mamiya ve Kiyohara 8 (Şekil 1 tarafından açıklandığı gibi, genital morfoloji kadınlar ve erkekler arasında ayrım </strong&gt;). Hazırlanan kılcal iğne ile istenilen seks nematod Pick up ve erkeklerde veya kadınlarda uygun fungal kültür plaka transfer. NOT: erkeklerden daha fazla kadın 60 kadın yüzdesi ile vardır -% 70. kadın vulva erkek spicule Açıkçası farklıdır. yetişkin ile karşılaştırıldığında, erken evre J4 içinde spicule veya vulva küçük, ama yine de kolayca görülebilir ve ayırt edilebilir. nematod her zaman, bazen kadın ve erkeklerin ayırt zorluk artar, su, hareket ediyor. </li><li> Kültür karanlıkta 25 ° C &#39;de 24 saat daha J4 larva. NOT: Tüm nematod yetişkinler haline, ama onlar unmated olduğundan, bunlar bakire yetişkin olarak kabul edilmektedir. </li><li> Baermann hunileri iki birleştirin ve adımları 1.2.1 açıklandığı gibi, 2 saat boyunca mantar kültürlerden bakire yetişkin ayıklamak - 1.2.3 ve iki ayrı, temiz Petri kapları içine bakire yetişkin erkek ve kadın aktarın. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Gözlem ve çiftleşme Davranış Video Kayıt <ol><li> Birkaç içbükey slaytlar hazırlamak ve onların kuyuların her steril dd H2O 200 mcL ekleyin. </li><li> Bir kılcal iğne ile hazırlanan bakire yetişkin erkek veya kadın ve Pick up ve her içbükey slayt suya sadece bir nematod koydu. </li><li> onlara yeni sulu ortama uyum sağlamak için 1 saat boyunca hazne içinde bakire yetişkin tutun. </li><li> Bir pipet kullanarak başka iyi birinden bunlardan biri aktararak bakire erkek ve dişi çifti. </li><li> Bir stereomikroskop altında içbükey slayt 1♀ + 1♂ kombinasyonunun çiftleşme davranışları gözlemlemek. </li><li> bakire yetişkinlerin çiftleşme etkinliğini analiz etmek, onların çiftleşme başarı oranını (R) hesaplar ve rastgele seçilen yetişkin çifti ile karşılaştırın. birleşme çalışılan çoğaltır sayısına kıyasla görülmüştür ki çoğaltır yüzdesi olarak R hesaplayın. </li><li&gt; Çiftleşme seçimi ve intrasexual rekabet, grup araştırmak ve iki farklı kombinasyonlar bakire nematod gözlemlemek için: 1♀ + 3♂ ve + 1♂ 3♀. </li><li> kalitatif ve kantitatif analiz için veri toplamak amacıyla, Video mikroskopi kullanılarak çiftleşme davranışı filme. Normal olarak, birleşme sonrası birbirinden ayrıldığı zaman nematod an içbükey sürgünün çukuruna yerleştirilir zaman bütün birleşme işlemi, 2 saat içinde tamamlandı. Bu nedenle, bir tekrar en az 2 saat boyunca sürekli olarak birleşme işlemi kaydedilir. en az 30 Komple her kombinasyon için toplam çoğaltır. Not: kayıt işlemi sırasında buharlaşma için oyuğuna daha steril GG S, her 0.5 H2O (genellikle 50 uL) eklenir. </li></ol> 3. Veri Toplama <ol><li> Bir bilgisayar ekranında dikkatlice videoları görüntülemek ve niteliksel alt davranışları karakterize. </li><li> çiftleşme kullanarak th süresini ölçmekvideo kaydedici, e kare-kare fonksiyonu. El ile bitiş noktası başlayarak zaman çıkarın. </li><li> 1♀ + 1♂ kombinasyonu için, her video kaydını analiz etmek ve aşağıdaki olaylardan süresini ölçmek: <ol><li> Arama süresini ölçmek (yani, kadın ve erkek karşılaştıkları an içbükey slayt kuyuya tanıtıldı ve birbirine temas edildiğinde geçen süre). </li><li> Temas süresini ölçmek (yani, erkek tam ilk çiftleşme için dişinin vulva konumlandırılmış an ilk temas süresi). </li><li> Copulating süresini ölçmek (yani, o boşalma sonra yerde kadın vücudundan kayarak kadar erkek tam dişinin vulva konumlandırılmış tarihten itibaren zaman). Not: Bazı nematod 2 saat içinde birkaç kez copulate edebilirsiniz. Bu gibi durumlarda, LAS sonunda ilk çiftlerin çiftleşme süresinin ölçülmesiarasındaki zaman dahil olmak üzere, t, bir,. </li><li> Kalan süresinin ölçülmesi (yani, birleşme sonrası dönem erkek ve dişi yüzmek birbirinden uzağa daha fazla nematodlar vücut uzunluğundan daha bir mesafe ile ayrılır kadar (genellikle, 1 mm)). </li></ol></li><li> Çiftleşme frekansı ve her birleşme süresi ve farklı kombinasyonlarının her biri için 2 saat tüm çiftleştirerek ortalama süreyi saymak (yani, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ ve 1♀ + 3♂). </li><li> derhal ve hiç ara vermeden yapılan ilk temas, sonra çiftleşme başarı oranı gibi farklı kombinasyonlar için ilk temas (P) çiftleşme başarı oranını hesaplayın. temas aşamasında, çeşitli temas gerçek birleşme öncesi gözlenen olabilir. <ol><li> iki kişi arasındaki mesafe vücut uzunluğundan daha fazla olduğu zaman, bitecek bir kişiyi düşünün. bir tekrarında, kayıt P 100% olarak çiftleşme is ara vermeden, ilk temastan hemen sonra görülen veya 0.00% no çiftleşme gözlendi ya da eğer çiftleşme ancak iki ya da daha fazla temas sonra varsa. NOT: Burada anlatılan her kombinasyon için 30 suret vardı. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jap.+For.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li>
<li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen%27s+mausoleum+in+Nanjing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jiangsu+Fore.+Sci.+Tech.+%28in+Chinese%29%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47(1982).</li>
<li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li>
<li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+%26+Buhrer%2C+1934+%28Nickle%2C+1970%29+in+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner & Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li>
<li>Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pine+wilt+disease%3A+a+threat+to+European+forestry%5BTitle%5D)+AND+%22Euro.+J.+Plant+Path%22%5BJournal%5D)">Pine wilt disease: a threat to European forestry.</a> Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).</li>
<li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+xylophilus%3A+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Path%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li>
<li>Mamiya, Y., Furukawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecundity+and+reproduction+of+Bursaphelenchus+lignicolus%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Nemat%22%5BJournal%5D)">Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus.</a> Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).</li>
<li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Aphelenchoididae%29+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li>
<li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li>
<li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li>
<li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+mating+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22The+C.+elegans+Research+Community+Wormbook%22%5BJournal%5D)">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li>
<li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nematol%22%5BJournal%5D)">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Davranış testleri, kimyasal ekoloji, nörobiyoloji, moleküler biyoloji ve genetik bir temel yönü vardır. Nematodlar, ve özellikle de C. elegans, yoğun bu alanda araştırmalar için kullanılmaktadır. C. elegans &#39;çiftleşme davranışı, daha önce 10-11 araştırılmıştır. Bununla birlikte, B xylophilus&#39;un gonochoristic ve hermafrodit C. elegans farklıdır, ve birleşme işlemi farklı davranış özellikleri 9 sahiptir. Son zamanlarda, Bursaphelenchus okinawaensis,</em...

Çam ağacı nematodu, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner ve Buhrer) Nickle, çam ağaçlarının solmasına ve nihayetinde ölümüne neden olan en yıkıcı istilacı türlerden biridir. Bu patojenik nematodun ABD'ye özgü olduğuna inanılıyor, ancak Çin, Japonya, Güney Kore ve Portekiz dahil olmak üzere birçok ülkeye taşındı. Son zamanlarda, İspanya'da da bildirilmiş, milyonlarca çam ağacını büyük ekonomik kayıplarla öldürdüğü ve orman üretimini ve ekolojik istikrarı tehdit ettiği1-5.
Bir konakçı çam ağacı ağacı nematodları tarafından enfekte edildiğinde, binlerce milyon yavru gövde içinde hızla çoğalır. Bu, ksilem disfonksiyonuna neden olur, solmaya ve sonunda konakçı ağacınölümüne neden olur 6. Bununla birlikte, şu anda bu hastalığı kontrol etmenin etkili bir yolu yoktur. Çiftleşme davranışı, bu nematod7'nin yüksek doğurganlığında önemli bir rol oynayabilir. Bu nedenle, B. xylophilus'un çiftleşme davranışını laboratuvarda araştırdık, çiftleşmesini bozmanın ve doğurganlığını azaltmanın etkili bir yolunu bulmaya çalıştık. 
Bu protokol, B. xylophilus'un bakire yetişkinlerinin nasıl elde edileceğine ve bir video kaydedici ve stereomikroskop kullanılarak çiftleşme davranışının nasıl gözlemleneceğine ve analiz edileceğine dair ayrıntılı yöntemleri tanıtmayı amaçlamaktadır. Bu protokol aynı zamanda diğer nematodların davranışsal çalışmaları için bir referans olarak da kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>B. xylophilus Nxy61</td><td></td><td></td><td>'den izole > Çin'in Ningbo bölgesindeki Pinus massoniana</tr> edildi <tr>Çin <td>Ormancılık Akademisi'nden Elde Edilen</td><td>Gri küf suşu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baermann hunileri</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>şahin tüpleri</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>santrifüj</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipet</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>steril dd H2O</td><td></td><td></td><td>121 ° C'de yüksek buhar basıncı ile sterilize edilmiştir; 30 dakika boyunca C.</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA ortamı</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>kuluçka</td><td>makinesi Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminer akış</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cam kılcal</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>ters stereo mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>içbükey slaytlar</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pinewood nematodu gözlem ve Çiftleşme davranış miktarının belirlenmesi, orijinli olanlar

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Gözlemlemek ve çam nematod, orijinli olanlar çiftleşme davranışı ölçülmesi için bir yöntem olup, bir stereo mikroskop altında kurulmuştur. B. xylophilus&#39;un çiftleşme verimliliğini artırmak ve çiftleşme gözlem şansını artırmak için, bakire yetişkinler kültür ve soruşturma için kullanılır. Yumurta suda nematod tutmak ve dişiler 10 dakika boyunca yumurtalarını bırakmak için izin vererek elde edilmiştir. Ikinci aşama yavru (J2) karanlıkta 25 ° C&#39;de 24 saat boyunca inkübe edilerek yumurta senkronize edildi ve erken J4 bir 52 saat daha, gri küfe, Botrytis cinerea ile J2 kültürlenmesiyle elde edilmiştir. Bu sefer noktada, çoğu J4 nematod genital morfolojisi kullanarak erkek ya da kadın olarak açıkça ayırt olabilir. erkek ve dişi J4 toplandı ve bakir yetişkin nematod için 24 saat boyunca, iki farklı Petri kapları ayrı ayrı kültürlenmiştir. Bir bakire erkek ve bakire kadın wat bir damla eşleştirilmişiçbükey sürgünün oyuk er. çiftleşme davranışı bir stereo mikroskop altında bir video kaydedici ile çekildi. çiftleşme sürecinin tüm dönem 82.8 ± 3.91 dakika (ortalama ± SH) ve 4 farklı aşamalarında bölünmüş olabilir: arama, temas çiftleşen ve kalıcı. süresi ortalama dakika sırasıyla 21.8 ± 2.0, ± 1.9 28.0, 25.8 ± 0.7 ve 7.2 ± 0.5 idi. Onbir alt davranışlar tarif edildi: seyir yaklaşıyor, karşılaşmadan, boğmaca, dokunmadan, yerini, bağlama, ejaculating, sessizliğini ayıran ve dolaşım. bir kadın 3 erkek veya 3 kadın ile bir erkek ile gruplandırılmış zaman İlginçtir, bariz içi cinsel rekabet gözlendi. Bu protokol, B. xylophilus&#39;un çiftleşme davranışı araştırırken, aynı zamanda diğer nematodların etiyolojik çalışmalar için bir referans olarak hareket sadece, kullanışlı ve değerlidir.

Bakire yetişkinlerin çiftleşme başarı oranı (R) rastgele seçilmiş yetişkinlerin önemli ölçüde daha yüksek olduğu, ortalama 86,67% oldu: 13.33 ± 4.65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0.0001) (Şekil 2). Bu bulgu B. xylophilus'un rastgele seçilen yetişkinlere göre daha bakir yetişkinlerle çiftleşme davranışlarını gözlemlemek için daha kolay olduğunu göstermektedir. bir erkek bir kadın ile eşl...

Çam ağacı nematodu Bursaphelenchus xylophilus'un çiftleşme davranışını araştırmak için bir protokol sunulmuştur. B. xylophilus'un davranışsal özellikleri çiftleşme sürecinde açıklanmaktadır.

Pinewood Nematodu gözlem ve Çiftleşme Davranış miktarının belirlenmesi, Orijinli olanlar

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Bu prosedürün genel amacı, çam ağacı nematodu, Bursaphelenchus xylophilus'un çiftleşme davranışını gözlemlemektir. Bu yöntem, nematod ile ilgili psikolojik çalışmaların ilerlemesine yardımcı olabilir. Özellikle çam ağacı nematodunun çiftleşme davranışının gözlemlenmesi ile ilgilenir.Bu tekniğin temel avantajı, bakire yetişkinlerin elde edilebilmesidir, bu da yetişkin çiftleşme davranışını gözlemlemeyi çok daha kolay hale getirir. Bu tekniğin sonuçları, benzer yaşam döngüsü davranışlarına sahip oldukları için nematodların daha geniş çalışmasına doğru uzanır. Bu yöntemin gösterilmesi kritiktir, çünkü bakire yetişkin nematodların edinimi zordur, çünkü gelişimsel nematodların kısıtlamaları pratik gerektirir ve erken birinci evre gençlerde erkekleri dişilerden kesin olarak ayırt etmek kolay değildir.Çam ağacı nematodlarını kültürlemek için önce patates dekstroz agar plakaları hazırlayın. Bir plakayı aşılamak için, bir betritus senaria matından 10 milimetre çapında bir mantar matı parçası delin ve yeni bir PDA plakasının ortasına koyun. Mantar matını karanlıkta 25 santigrat derecede beş gün boyunca kültürleyin.Beş gün sonra, çam ağacı nematodlarını hazırlanan Petri kabına ekleyin ve karanlıkta 25 santigrat derecede üç gün boyunca kültürleyin. Nematodları mantardan izole etmek için önce bir toplama aracı hazırlayın. Bir huninin altına kenetlenmiş bir lastik tüp yerleştirin ve baermann huni aparatını monte etmek için hazırlanan huniyi bir rafta tutun.Ardından, huninin ağzına gazlı bez yerine iki kat filtre kağıdı yerleştirin. Şimdi, mantar kültürlerini huni kurulumuna aktarın ve mantar matı daldırılana kadar su ekleyin. İki saat sonra, nematodlar mantar kültüründen çıkacak, filtre kağıdını geçecek ve baermann hunisinin en alt kısmına yerleşecektir.Huninin altına 15 mililitrelik bir tüp yerleştirerek nematodları toplayın, ardından nematodları içerecek birkaç damla su toplamak için kelepçeyi yavaşça serbest bırakın. Nematod koleksiyonlarını oda sıcaklığında iki dakika boyunca 3.000 G'de santrifüjleyin. Daha sonra üst su seviyesini ayırın ve solucanları bir mililitre suda tekrar süspanse edin.Nematodların süspansiyonunu altı santimetrelik bir cam tabağa aktarın ve nematodların serbestçe yüzmesine yardımcı olmak için üç mililitre su ekleyin. Şimdi, bakire stoklar yapmak için yumurta toplayın. Çanağı karanlık bir kuluçka makinesine aktarın ve hamile kadınların 10 dakika boyunca yumurta bırakmasına izin verin.Glikoprotein yüzeyleri nedeniyle yumurtalar cama yapışacaktır. Daha sonra, yemeğe yapışan yumurtaları rahatsız etmemek için solucanlarla birlikte suyu dikkatlice çıkarın. Ardından, yumurtaların kurumasını önlemek için tabağa hızlıca 3 mililitre su ekleyin.Tüm larvaları ve yetişkinleri çıkarmak ve saf yumurtaları elde etmek için bu yumurta temizleme işlemini en az üç kez tekrarlayın. Yıkanmış saf yumurta koleksiyonuna beş mililitre su ekleyin ve yumurtaları karanlıkta 25 santigrat derecede geliştirmeye devam edin. Yumurta kültürüne başladıktan 24 saat sonra, yumurtadan çıkan J2 larvalarını toplayın.J2 larvalarını dikkatlice 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra koleksiyonu iki dakika boyunca 3.000 G'de santrifüjleyin. Üst su tabakasını ayırın ve 200 mikrolitre su ekleyin.Ardından, J2 larvalarını bir mantar matı ile hazırlanmış bir PDA plakası üzerinde kültürleyin. 52 saat sonra, J2 larvalarının çoğu erken evre J4 larvalarına dönüşmüş olacaktır. Bir baermann hunisi monte edin ve nematodları daha önce tarif edildiği gibi iki saat boyunca mantar kültürlerinden çıkarın.Beklerken solucanları toplamak için bir iğne hazırlayın. Bir alkol brülörü üzerinde ısıtılan bir cam kılcal damardan bir uç çizin. Ucun çapının yaklaşık 50 mikron olması, kabaca yetişkin bir nematodun vücut genişliği kadar olması gerekir.İki saat sonra, J4 larvalarını daha önce tarif edildiği gibi temiz bir Petri kabına aktarın. Şimdi, nematodları stereo mikroskop altında cinsiyetlendirin. Larvaların yaklaşık üçte ikisi genellikle dişidir.Dişinin vulvası açıkça erkeğin anatomisinden farklıdır, ancak solucanlar çok aktif olduğu için cinsel ilişki pratik yapacaktır. Bu protokolün en kritik adımı, erken ilk aşamada erkekleri dişilerden kesin olarak ayırt etmek ve ayırmaktır. Aksi takdirde, yetişkin olduklarında karışık ve kötü olacaklar.Bu da çiftleşmeyi gözlemlemeyi zorlaştırıyor. Yavaş yavaş, solucanları toplayın ve erkekler veya dişiler için bir slaytta bir damla suya aktarın. Başarıyı sağlamak için, iki farklı kişi cinsiyet dağılımını iki kez kontrol etmelidir.Şimdi, cinsiyetlendirilmiş solucanları içeren su damlasını uygun mantar kültürü plakasına aktarın. Ardından, çiftleşme davranışlarını incelemeden önce bakireleri 24 saat daha kültürleyin. Çam ağacı nematodu çiftleşme davranışını gözlemlemek için, önce kuyucuklarının her birine 200 mikrolitre su ekleyerek birkaç içbükey slayt hazırlayın.Ardından, hazırlanmış tek bir bakire yetişkin seçin ve hazırlanmış bir slayta aktarın. Bakire yetişkinleri, yeni sulu ortama adapte olmalarını sağlamak için bir saat boyunca kuyunun içinde tutun. Bir saat sonra, bir pipet kullanarak kuyuya karşı cinsten bekar bir bakire yetişkin ekleyin.Ardından, stereo mikroskop altında eşleşme davranışını gözlemleyin ve kantitatif analiz için davranışı filme alın. Tüm çiftleşme süreci genellikle iki saat içinde biter. Her 30 dakikada bir, buharlaşmayı telafi etmek için 50 mikrolitre su ekleyin.Çiftleşme seçimini ve interseksüel rekabeti araştırmak için, iki farklı kombinasyondaki bakire nematodları gruplandırın ve gözlemleyin. Bakire yetişkinlerin çiftleşme başarı oranı yaklaşık% 87 idi ve bu rastgele seçilen yetişkinlerden çok daha yüksekti. Çiftlerin dört farklı aşama içeren tüm çiftleşme sürecini tamamlaması ortalama 83 dakika sürdü.Aramak, iletişim kurmak, çiftleşmek ve oyalanmak. Bu aşamalar içinde, birçok spesifik davranış kalıbı gözlemlenebilir. Bir dişi birkaç erkekle karşılaştığında, bariz bir çiftleşme seçeneği vardı.Dişi genellikle baş, vücut, kuyruk ve genital bölgedeki bir erkeğe temas etmek için başını kullanır. Dişi daha sonra erkekle çiftleşti ya da onu çabucak terk etti ve başka bir erkeğe yüzdü. Çiftleşme başarı oranları, farklı nematod kombinasyonları için ilk temastan sonra ölçüldü.İnterseksüel rekabet de meydana geldi. Bir bakire dişi üç bakire erkekle karıştırıldığında, erkekler onunla çiftleşme şansı elde etmek için dişiye mümkün olduğunca yaklaşmaya ve onunla iletişim kurmaya çalıştılar. Vulva işgal edildiğinde, diğer erkekler şiddetli vücut salınımları kullanarak veya onları ayırmak için sürükleyerek çiftleşme sürecini bozmaya çalıştılar.Kadın interseksüel rekabetinin, erkek interseksüel rekabetine az ya da çok benzer olduğu görüldü. İnseksüel rekabet nedeniyle, farklı kombinasyonlarla yapılan çiftleşme frekansları önemli ölçüde farklıydı. Geliştirildikten sonra, bu teknik nematodlarda davranışsal ekolojinin araştırılmasının yolunu açtı.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu prosedür düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse 12 gün içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, bakire yetişkinler elde etmek için erkekleri dişilerden, erken dört aşama gençlerden kesin olarak ayırmayı hatırlamak önemlidir.

observation-quantification-mating-behavior-pinewood-nematode

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Entomopatojenik nematodlar böcek geniş bir yelpazede parasitize toprakta yaşayan yuvarlak solucan bulunmaktadır. Sırasıyla toprak örneklerinin ve enfekte olmuş böcek kadavra, nematod geri kazanılması için böcek kızdırma ve modifiye edilmiş beyaz tuzak: iki teknikler kullanılarak topraktan bu nematod izolasyonu için kullanılan örnekleme yöntemlerini göstermektedir.

Toprak Örnekleme ve Entomopatojenik Nematodlar İzolasyonu (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Davranışsal tahliller, nöronal işlevi anlamak için güçlü araçlar sağlar. Burada, model nematod Pristionchus pacificus ve akrabalarında bulunan yırtıcı beslenme davranışını ölçmek için çeşitli protokoller sunuyoruz. Ek olarak, ağız yapıları ve dişler dahil olmak üzere yırtıcı beslenme adaptasyonlarını analiz etmek için yöntemler sunuyoruz.

içinde Yırtıcı Beslenme Davranışları tahlil<em&gt; Pristionchus</em&gt; Ve Diğer Nematodlar

Drosophila melanogaster meyve sinekinde çiftleşme davranışını etkileyen çevresel ve genetik ipuçlarını analiz etmeye yönelik bir analiz yapacağız.

Çevresel İpuçlarının Eklem Davranışı Üzerine Etkisini Test Etmek İçin Bir Yöntem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.

Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı

Dostum koruma davranışı cinsi Tigriopusgelgit kopepodların çoğaltılması içinde önemli bir rol oynar. Ancak, bu davranış eğitim yöntemleri de açıklanan olmamıştır. Burada biz yöntemleri tarif: bakire Tigriopus hayvan ve 2) kantitatif analiz dostum koruyan davranışlarının 1) bireysel kültür.

Bireysel Tigriopus kopepodların ve kantitatif analiz dostum koruyan davranışlarının kültür

Bu protokol için ant Vollenhovia emeryiiçin akraba evliliği haçlar iletken ve bu haçlar başarısını değerlendiren yöntemler açıklanmıştır. Bu protokoller seks belirlenmesi sistemlerinde Hymenoptera genetik temeli anlama amaçlayan deneyler için önemlidir.

İndüksiyon ve karınca, Vollenhovia Emeryi kullanarak akraba evliliği haçlar değerlendirilmesi

Sperm, bir ooksit döllemek için ovidukt üzerinden başarılı bir şekilde gezinmelidir. Burada, C. elegans hermafrodit uterusun içinde sperm göçünü ölçmek için bir tahlil açıklanmaktadır. Bu tahlil çiftleşme sonra rahim içinde sperm dağılımı nicel veri sağlayabilir, yanı sıra hız, yönlü hız, ve ters frekans.

Ölçme sperm rehberlik ve motilite içinde Caenorhabditis elegans hermafrodit üreme yolu

Burada, gen fonksiyonlarının incelenmesini kolaylaştırmak için Bursaphelenchus xylophilus'ta RNA girişiminin ayrıntılı bir ıslatma yöntemini tanıtıyoruz.

RNA Girişiminin Çam Ağacı Nematodunda Uygulanması, Bursaphelenchus xylophilus

Bu protokol, C. elegans'taki uçucu seks feromonuna verilen yanıtların çıkarılması ve ölçülmesi için yöntemler oluşturur ve kimyasal iletişim ve navigasyon yörüngesini incelemek için araçlar sağlar.

Caenorhabditis elegans'ta Uçucu Seks Feromon Ekstraksiyonu ve Kemocazibe Testi

Protokol, Pinus pinaster'ın in vivo ve in vitro çam ağacı nematod enfeksiyonunu ve bunların Gaz Kromatografisi (GC) ve Kütle Spektrometresine (GC-MS) bağlı GC yoluyla uçucu analizini açıklar.

İn Vivo ve İn Vitro Çamların Çam Ağacı Nematodu Bursaphelenchus xylophilus ile Enfeksiyonu ve İndüklenen Uçucuların İzolasyonu

Mevcut protokol, potasyum klorür (KCl) iyonlarının ozmotik regülasyonu yoluyla Bursaphelenchus xylophilus'un üçüncü aşama gençlerinin (pre-dauer juveniles, JIII.) kriptobiyoza dağılmasını indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, B. xylophilus'un stres direnç mekanizmaları üzerine yapılan araştırmalar için teknik destek sağlayabilir.

Bursaphelenchus xylophilus'un Üçüncü Aşama Dağılmış Yavrularının Ozmotik Regülasyon Yoluyla Kriptobiyoza Girişinin İndüklenmesi

Öğrenin Bursaphelenchus xylophilus çiftleşme davranışlarını gözlemleme yöntemini. Bakire yetişkin nematodların elde edilmesi ve cinsiyet ayrımı teknikleriyle davranışsal biyoloji çalışmalarına katkı sağlar.

Pinewood Nematodu gözlem ve Çiftleşme Davranış miktarının belirlenmesi, Orijinli olanlar

Daha fazla video keşfet