Name: Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Keşfedin serebral vasküler endotelyal hücrelerde mitokondriyal fonksiyon değerlendirmesi için ekstraselüler flüks analizörü kullanımını. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri bütünlüğünü incelemek ve nörolojik bozukluklarda hücre ölümünü en aza indirmek için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: AHA 16SDG31170008'den X.R.'ye ve NIH P20 GM109098, P01 AG027956 ve U54 GM104942 JWS'ye.

Not: protokol şeması prosedürleri, bir zaman çizgisi de dahil olmak üzere, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. CVE 1. Hücre Kültürü ve Pasaj <ol><li> Tam büyüme ortamı içinde kültür CVE hücreleri (bEnd.3 hücreleri) (yüksek glukoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı, DMEM) T75 cm2&#39;lik doku kültür şişesi içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. % 5 CO2 inkübatörde 37 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> Çıkarın ve hücre kültür ortamı atılır. % 0.25 tripsin-% 0.03 EDTA çözeltisi ile hücre tabakasını durulayın, ve daha sonra 1 ekleyin - şişeye Tripsin-EDTA solüsyonu 2 mL, 3 37 ° C &#39;de balon devam - 5 dak. Hücre tabakası ayrılmış kadar bir ters mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır. tam büyüme ortamı 10 ml ekleyin ve hafifçe pipetleme hücreleri aspire. </li><li> 5 dakika, selüler artığın ayrılması için 700 x g&#39;de 15 ml santrifüj tüpüne ve spin içerisine sıvı ve hücre süzün. </li&gt; <li> santrifüj tüpten atın. tam büyüme ortamında 10 ml ekleyin ve hücre topağı yeniden askıya. 5 dakika boyunca 700 xg&#39;de hücreleri dönerler. </li><li> santrifüj tüpten atın. Yeniden askıya 2.0 x 10 5 hücre / ml bir konsantrasyonda tam büyüme ortamında hücre pelletini (hemasitometre kullanarak saymak suretiyle belirlendi, tripan-mavisi boyama ile ölü hücreleri hariç). Not: Taze çözülmüş hücreler deneyler için en az 3 geçişleri için alt kültürlenir. </li></ol> Hücre Kültürü Tabaklar 2. Tohum ve tedavi Hücreler <ol><li> 96 oyuklu bir hücre dışı akı hücre kültürü plakasının Tohum hücreleri: de 80 uL /. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C&#39;de hücre kültürü plakası yerleştirin. Not: kuyu başına 16 × 10 3 hücreleri 60 ulaşacak - 24 saat içinde% 80 confluency. </li><li> hücreler, bir kimyasala maruz kaldığı takdirde, hücreler plaka tabanına takılmaktadırlar, sonra, tedaviler ekleyin (8-24 saat izleyenlereding). Not: Transfeksiyon deneyleri için, tam büyüme ortamında antibiyotik ilave değildir. </li></ol> Bioanalyzer kullanarak Mitokondriyal Fonksiyon 3. Değerlendirme <ol><li> Deneyin başlamasından önce, plakaya hücre dışı akı kalibrant çözeltisi 150 uL ilave edilmesi ve CO2 olmadan 37 ° C &#39;de O / N inkübe edilerek kalibratörü ile hücre dışı bir akış sensörü kartuşu hidrat. </li><li> plaka yıkayıcı istasyonunu kullanarak, pH 7.0 dışı akı deney ortamı içine hücre kültür ortamı değiştirin. 60 dakika - 30 CO 2 olmadan 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri. </li><li> 8 mcM oligomycin, 4.5 uM FCCP, 10 uM rotenone ve DMEM 10 uM antimisin çalışma çözümleri hazırlayın. Yük 25 uL kartuş enjeksiyon portlarına stok çözümleri: Port A, oligomycin; Liman B, FCCP; Liman C, hücre dışı akı deney ortamı ile rotenone ve antimisin. Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi analiz protokolü uygulamak. </li><li> Bioanalyzer içine sulandırılmış kartuşu yükleyin ve &quot;Başlat&quot; düğmesine tıklayarak kalibrasyonu yapın. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, kartuş alt plaka kaldırmak ve &quot;Unload Kartuşu&quot; istemini tıklayarak hücre plaka yükleyin. Tüm ölçümlerin sonuna kadar tahlil devam edin. </li><li> veri dosyasını açın ve Bioanalyzer gelen oran değerlerini elde. Bir tablo dosyasına veri verir. </li></ol> 4. Veri Analizi NOT: Veri analizler için hesaplamalar aşağıda formüle edilmiştir. OCR Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi değerler Bioanalyzer alet elde edilir. <ol><li> Bazal değerden (ölçüm 3) - Bazal solunum hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçümleri 10) çıkarın. NOT: Bazal solunum = Bazal - olmayan mitokondriyal solunum = Oranı ③ - Oranı ⑩ ~ ⑫. </li><li> ATP verimlilik hesaplamak içinbazal değerden (ölçüm 3) - on ATP bağlı solunum (6 ölçümleri 4) çıkarın. NOT: ATP üretimi = Bazal - ATP bağlı solunum = Oranı ③ - Oranı ④ ~ ⑥. </li><li> Maksimum solunum dan (ölçümler 7-9) - Maksimum solunum hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçümleri 10) çıkarın. NOT: Maksimal solunum = Maksimum solunum - olmayan mitokondriyal solunum = Oranı ⑦ ~ ⑨ - Oranı ⑩ ~ ⑫. </li><li> Yedek kapasitesini hesaplamak için, maksimum solunum bazal değer (ölçüm 3) (- 9 ölçümler 7) çıkarın. NOT: Yedek kapasite = Maksimum solunum - Bazal = Oranı ⑦ ~ ⑨ - Oranı ③. </li><li> ATP bağlı solunum (ölçüm 4) den - Proton sızıntı hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçüm 10) çıkarın. NOT: Proton kaçak = ATP bağlı solunum - olmayan mitokondril solunum = Oranı ④ - Oranı ⑩ ~ ⑫. </li></ol>

<ol><li>Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+as+signaling+organelles+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cytoskeletal+elements+are+critical+for+flow-mediated+dilation+in+human+coronary+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles.</a> Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).</li>
<li>Al-Mehdi, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+mitochondrial+clustering+creates+an+oxidant-rich+nuclear+domain+required+for+hypoxia-induced+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription.</a> Sci Signal. 5, ra47(2012).</li>
<li>Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BCa2%2B%5Di+signaling+between+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum+in+neurons+is+regulated+by+microtubules.+From+mitochondrial+permeability+transition+pore+to+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">[Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release.</a> J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).</li>
<li>Sutendra, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Nogo+and+the+mitochondria-endoplasmic+reticulum+unit+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 3, 88ra55(2011).</li>
<li>Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperfused+mitochondrial+state+achieved+at+G1-S+regulates+cyclin+E+buildup+and+entry+into+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).</li>
<li>Doll, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+crisis+in+cerebrovascular+endothelial+cells+opens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier.</a> Stroke. 46, 1681-1689 (2015).</li>
<li>Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+Blood-Brain+Barrier+Damage+in+Stroke%3A+Mitochondrial+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinfect+Dis%22%5BJournal%5D)">Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism.</a> J Neuroinfect Dis. S2, e002(2015).</li>
<li>Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+ROS+in+BBB+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of ROS in BBB dysfunction.</a> Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).</li>
<li>Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tert-butylhydroquinone+compromises+survival+in+murine+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol+Teratol%22%5BJournal%5D)">Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke.</a> Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).</li>
<li>Modis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bioenergetics+is+regulated+by+PARP1+under+resting+conditions+and+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress.</a> Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).</li>
<li>Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+protein+expression+and+barrier+properties+of+immortalized+mouse+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells.</a> Brain Res. 1130, 17-30 (2007).</li>
<li>Bukeirat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+regulates+blood-brain+barrier+permeability+and+mitochondrial+function+by+targeting+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Impairment+in+Cerebrovascular+Endothelial+Cells+is+Involved+in+the+Correlation+between+Body+Temperature+and+Stroke+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity.</a> Aging Dis. 7, 14-27 (2016).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+large+apparent+work+capability+of+the+blood-brain+barrier%3A+a+study+of+the+mitochondrial+content+of+capillary+endothelial+cells+in+brain+and+other+tissues+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat.</a> Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).</li>
<li>Oldendorf, W. H., Brown, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greater+number+of+capillary+endothelial+cell+mitochondria+in+brain+than+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Soc+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle.</a> Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).</li>
<li>Kaczara, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+released+by+CORM-401+uncouples+mitochondrial+respiration+and+inhibits+glycolysis+in+endothelial+cells%3A+A+role+for+mitoBKCa+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels.</a> Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).</li>
<li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> J Vis Exp. (96), e52350(2015).</li>
</ol>

Yazarlar, bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayınlanması ile ilgili herhangi bir potansiyel çıkar çatışması beyan etmezler. Bu makalenin Açık Erişim ücretleri Agilent Technologies tarafından sağlanmıştır.

Bu protokol, serebral vasküler endotel hücrelerinde biyoenerjik fenotipinin değerlendirilmesi için bir yöntemi temsil eder. Bu endotel hücre mitokondriyal değerlendirme için temel bir tahlil olarak hizmet eder ve bu CVE hücrelerde mitokondriyal sinyal yolağı etkileyebilir uyaranlara mekanizmalarının incelenmesi amacıyla tasarlanan deneylerde için en uygunudur. Ayrıca, BBB bozulması ile ilişkili hastalıklar için potansiyel terapötik test etmek için bir yöntem sağlar. Protokol çerçevesinde kritik adımlar Hücre dışı akı bioanalyzers gerçek zamanlı olarak OCR ölçme yeteneğine sahiptir. Bu tahlilde, uygun hücre yoğunluğu tespit önemlidir. Hücre yoğunluğu oyuk başına 8 x 10 3 hücre altında ise, taban OCR (Şekil 2 ve Şekil 3) analiz edilecek olan çok düşük olduğu; Hücre yoğunluğu oyuk başına 32 x 10 3 hücre üzerinde ise, hücreler oligomycin ya FCCP işlemesi yanıt yokNTS (Şekil 2 ve Şekil 3). Bizim deneysel modelinde bu hücre hattı için en uygun hücre yoğunluğu 7 ve tedavileri 10,14 uyaranlara tekrarlanabilir sonuçlar ve hassasiyet gösteren kuyu başına 16 × 10 3 hücredir. 24 oyuklu Bioanalyzer kullanılırsa, hücre yoğunluğu, yeni titrasyonları tahlili için gerekli olacaktır. CVEs diğer endotel hücreleri ya da doku tipleri 15,16 ile karşılaştırıldığında mitokondri büyük bir hacme sahip olduğunu daha fazla enerji üretimi ve biyoenerjetik metabolizmayı ölçmek için daha az hücre ihtiyacını öne belgelenmiştir. Biz primer beyin endotel hücreleri çeşitli test ve fare serebrovasküler endotel hücrelerini 7 ölümsüzleştirdi ve insan serebrovasküler endotel hücrelerini (yayınlanmamış veri) ölümsüzleştirilmiş var. 160 pmol / dak - Bu hücreler 40 içinde olarak kabul edilebilir bir OCR (bazal solunum OCR ulaşmak için benzer bir hücre yoğunlukları gerekli96 oyuklu plakalar, ve 50-24 oyuklu plakalar 400 pmol / dakika) biyoenerji deney yapıldı. Kaczara ve ark., Daha yüksek bir hücre yoğunluğuna 17 kullanılan insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC), içinde bioenergetic metabolizma ölçüm bildirmiştir. Grubumuz, diğer doku veya organlardan damar hücrelerini değerlendirmek vermedi. Teorik olarak, Bioanalyzer potansiyel olarak herhangi bir hücre tipi kullanılabilir ancak, hücre yoğunluğu, hücre kültür ortamı ve kültür koşulları (bazı özel hücrelerin de büyüme plakaları kaplanmış gerektirebilir) için tahlil optimize etmeyi gerektirir. Deneyler OCR oranını kabul edilebilir aralık içinde olduğundan emin olmak için tamamlanmış olması gereklidir. diğer organlarda endotel hücrelerinde OCR hücre yoğunluğu artan, beyinlerinden CVEs daha düşük ise, kabul edilebilir bir OCR aralığında almak için yardımcı olabilir. Hücreler enerji ana kaynağı olarak oksidatif fosforilasyon kullanmıyorsanız Alternatif olarak, Bioanalyzer bir optima olmazl deneyi. Bioanalyzer reaktifler uygulandığı sırasına göre, elektron taşıma zinciri sıralı bozulması için izin verir. İlk olarak, oligomycin mitokondriyal kompleks V (ATP sintaz) inhibe eden, uygulanır. İkinci olarak, FCCP, bir elektron uncoupler proton gradyanı bozulmasına yol açar, uygulanır. Son olarak, mitokondriyal Kompleksi I ve III inhibe rotenon ve antimisin, sırasıyla elektron akışının toplam inhibisyonuna yol uygulanır. ilaca maruz kalma sırası ilaçların spesifik elektron taşıma zincir reaksiyonu engellemek için gereklidir ve ardışık değişiklikler mitokondriyal fonksiyon yansıtacak şekilde ölçülebilir. Değişiklikler ve Sorun Giderme CVE hücrelerinde uyaranlara mitokondriyal yanıtı değerlendirmek için, hücrelerin hücre kültürü plakası altına yapıştırılır sonra uyaranlar (zaman çizelgesi bkz hücrelere uygulanır tavsiye edilirŞekil 1 &#39;de gösterilen; Genellikle) en az 6 saat sürer. tedaviler ile tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, tutarlı hücre yoğunluğunu tutmak için son derece önemlidir. ön işlemler hücre tohumlama önce tasarlanmış, her ön-tedavisi için hücre yoğunluğu dikkatle tohumlama için ölü hücreleri hariç, ölçülmelidir. transfeksiyon deney tasarımı dahil edilirse, üreticinin transfeksiyon protokolü bakın. Şekil 4&#39;de sunulan veriler göstermiştir miR-34A miR-34a aşırı ekspresyonu ile metabolik fonksiyonu değişiklikleri değerlendirmek için antibiyotik içermeyen hücre kültür ortamı ve Mito-stres testi gerektiren bir lipofektamin transfeksiyon kiti kullanılarak CVE hücrelerine transfekte edilmiştir . Daha önce 13 yayınlanan plazmid dozları da, optimize edilebilir. protokole yapılabilir bir diğer değişiklik reaktifler konsantrasyonları değişiyor. oligomycin, FCCP ve / veya rotenone ve antimisin bir titrasyon eğrisi komple olabilirTed. Yüksek performans için kullanılan bu deney, çeşitli ilaçların analiz Buna ek olarak, hücre canlılığı ve önceki yayınlarda 7,13 tanımlanmıştır hücre çoğalmasını ölçmek için bir paralel tahlil içerir önerilmektedir. OCR değerleri anlamlı hücre sayısı (Şekil 2 ve 3) etkilenen ve hücre çoğalması ve canlılığı deneyleri veri normalleşme fayda vardır. Ancak, bu testlerin tamamlanması her laboratuvar takdirine kalmıştır. Tekniğin Sınırlamalar Bu protokolün en önemli kısıtlılığı, biz sadece çalışmada in vitro hücre kültürü modeli kullanılmış olmasıdır. Şu anda, endotel hücre mitokondrial fonksiyon hitap edebilir hiçbir kullanılabilir ex vivo modeller ya da hayvan modelleri vardır. Yeni modeller in vivo biyoenerjetik fonksiyonunun değerlendirilmesi için geliştirilmiş olması bekleniyor ve <em&gt; ex vivo gelecekteki çalışmalarda. Başka bir sınırlama biyoenerjetiğin tedbirler aşağıdaki bariyer değerlendirmelerinin uzantısıdır. İlk olarak, biyoenerjitik ölçümler tamamlandıktan sonra, hücre canlılığı, elektron taşıma zincirinin tam parçalanmadan sonra azalır, çünkü deneyler gerçekleştirilemez; İkinci, özel hücre kültürü plakaları ve ekler biyoenerjetik değerlerini tespit etmek için gerekli olan ve bariyer değerlendirmeler için ekler uymaz. Bu nedenle, biyoenerji tahlil sonra tamamlanabilir pek çok işlevsel tahliller değildir. Bununla birlikte, özel cihazlar biyoenerji deneyi öncesinde fonksiyonel tahliller yapmak için geliştirilebilir beklenmektedir. Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi Mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için önceki teknikler hücrelerden 18 den mitokondri izolasyonu gerektirmiştir. bu neBioanalyzer kullanılarak W tekniği izole mitokondri değerlendirilmesi daha selüler ortamın fazla muhafaza sağlam hücrelerde mitokondriyal aktivite ölçümü sağlar. Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi Bu protokol, tasarlanmış ve bEnd.3 hücre hattı için geliştirilmiş, ancak aynı zamanda primer serebral vasküler endotelyal (pCVE) hücreleri 7 ya da endotel ile uyumlu olduğunu ve pCVE hücreleri 7 kullanarak önceki yayında bu göstermiştir edilir. endotel diğer türleri kullanıldığında, kültür plakasının kaplama ve büyüme faktörleri kullanımı gerekebilir. Bununla birlikte, titrasyon testi gibi diğer hücre tipleri için tavsiye edilir. Bu protokol, CVE hücre Biyoenerjetiğin değerlendirilmesinde kabul edilmesi genel bir yöntem sunmaktadır ve bu daha da mekanizma çalışmaları da bu şekilde tedavi yanıtları tatbik edilebilir.

Yaygın serebral vasküler endotelyal (CVE) hücreleri tarafından oluşturulan kan-beyin bariyeri (KBB) vasküler biyoloji için her şeyden çok farklı ve benzersiz işlevlere sahiptir olduğu kabul edilmektedir. Bu endotel hücreleri, kimyasal enerji kaynağı olarak adenosin trifosfat hücre kaynağı (ATP) en oluşturmak için mitokondri kullanımı. CVE hücreleri için ATP sağlamanın yanı sıra, mitokondri 1-4 sinyal hücresel vasküler endotel hücreleri, çeşitli hücresel işlemleri, apoptoz 5 ve hücre döngüsü kontrol edilmesi ve hücre büyümesini 6. CVE hücrelerde mitokondriyal biyoenerjik fonksiyonunun bozulması düzenleyen bozulmuş vasküler endotel aktivitesine yol açan, mitokondriyal biogenezi etkiler ve serebrovasküler hastalıklar ve nörodejeneratif bozukluklar, örneğin, felç 7,8 ve Alzheimer hastalığı (AD) 9 şiddetlendirebilir. Bu CVE hücrelere hakaretler lipopolysac maruz kaldıktan sonra göstermiştirsakarit (LPS) CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonunu bozabilir ve inme 7 sonuçlarını kötüleştirebilir. Bütilhidrokuinon (TBHQ) CVE hücrelerinde 10 oksidatif fosforilasyon ile müdahale ederek inme mortaliteyi artırmaktadır. Bu nedenle, CVE hücreleri sadece pilot merkezi sinir sistemi için bir mekanizma ile ilgili bir dizi çalışma (CNS) hastalıkları biyoenerjik fonksiyonunun niceliksel model, aynı zamanda, vasküler biyoloji mitokondriyal fonksiyonu hedefleme terapötik ilaç taramasında bir buluş sağlar. İzole mitokondri biyoenerjitik fonksiyonu ölçmek için kullanılmıştır. Biz 7 ve diğerleri 11 ekstraselüler akı Bioanalyzer kullanarak sağlam CVE hücrelerinde hücresel Biyoenerjetiğin değerlendirmelerini bildirdi. analizör endojen hücresel biyoenerjetik değerlendirme avantajı sağlar. Bu, hassas ve tutarlı deney CVE hücrelerin mitokondrial metabolizmanın büyüklüğüne ve Şti bioenergetic bozukluğu değerlendirmek için kullanılabilirMuli, CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonunu etkileyen mitokondriyal sinyal yollarının mekanizmalarını ve ekran ilaçlar ya da tedaviler araştırmak. Bu protokolde, rotenone ve antimycin A. oligomycin, karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazonun (FCCP): Oksijen Tüketim Hızı (OCR) dört mitokondriyal bozucuların kullanımını birleştirerek bir farmakolojik profil yaklaşımı kullanılarak Bioanalyzer tarafından kaydedilir biz detay tek bir deneyde, ölçme ve bazal mitokondriyal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesi dahil olmak üzere CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonel parametrelerin hesaplanması için izin veren bir optimize edilmiş bir yaklaşım.

<table><tbody><tr><td>bEnd.3 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>25 - 30 pasaj</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)</td> <td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>%10 nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Penisilin / Steptomisin</td><td>Klon</td><td>SV30010</td><td>1 kez; 100 stok%</td></tr><tr><td>0.25 tripsin,% 0.03 EDTA çözeltisi</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td>1.0 ve mikro; M nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma</td><td>CAS 50-99-7</td><td>25 mM nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>1.0 ve mikro; M nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Karbonisiyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP)</td> <td>Sigma</td><td>C2920</td><td>0.5 ve mikro; M nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>1.0 ve mikro; M nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma</td><td>CAS 1397-94-0</td><td>1.0 ve mikro; M son konsantrasyon</td></tr><tr><td>Plaka yıkama istasyonu</td><td>Denizatı Biyobilim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücre dışı akı biyoanalizörü ve nbsp; &nbsp;</td><td>Denizatı</td><td>Biyobilim XFe96</td><td></td></tr><tr><td>Hücre dışı akı hücre kültürü plakası</td><td>Denizatı Biyobilim</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Hücre dışı akı sensörü kartuşu</td><td>Denizatı Biyobilim</td><td>102416-100</td><td></td></tr><tr><td>Hücre dışı akı kalibrant çözeltisi</td><td>Denizatı Biyobilim</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Hücre dışı akı tahlil ortamı</td><td>Denizatı Biyobilimi</td><td>102365-100</td><td>PH testten önce tamponlanmış</td></tr></tbody></table>

serebral vasküler endotelyal hücrelerinde bioenerjetik fonksiyonun değerlendirilmesi

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Kan-beyin bariyer (KBB) bütünlüğü beyin hasarını önlemek için kritik öneme sahiptir. Serebral vasküler endotelyal (CVE) hücreleri BBB oluşturan hücre tiplerinden biri olan; Bu hücreler optimum mitokondriyal fonksiyonunu gerektiren çok yüksek-enerji talebinin var. hastalık veya kaza durumunda, bu hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu hastalık veya BBB açılması ile sonuçlanır, değişmiş olabilir. Bu yazıda, bütün, sağlam hücreleri ve bir Bioanalyzer kullanarak CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için bir yöntem tanıtmak. Bir mito-stres tahlil ya fiziksel ya da kimyasal, bozulmuş olan hücreler meydan ve onların biyoenerjitik fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda mitokondriyal fonksiyon üzerinde doğrudan etkiye sahip yeni tedavi ajanlarının ekrana kullanışlı bir yol sağlar. Mitokondriyal para çeşitli hesaplanmasına imkan oksijen tüketim oranları elde etmek için gerekli olan hücre yoğunluğuna optimizeATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite de dahil olmak üzere metre. Ayrıca mıkroRNA, miR-34a giriş, mitokondriyal aktivite belirgin bir ve saptanabilir bir azalmaya sebep olduğunu göstererek tahlilin hassasiyetini göstermektedir. Bu çalışmada gösterilen veriler bEnd.3 hücre hattı için optimize edilmiş olsa da, biz de daha ileri preklinik ve klinik modellerde programı düşündüren, birincil CVE hücreleri için protokol optimize ettik.

Oksidatif strese yanıt olarak CVE hücrelerinin bioenergetic fonksiyonunu değerlendirmek için, biz primer beyin mikrovasküler endotel hücreleri 12 ile aynı karşılaştırmalı bariyer özellikleri gösteren fare beyin mikrovasküler endotelin hücre çizgisi bEnd.3 seçti. kinetik ve yanıtın nispi yoğunluk çeşitli hücre tipleri arasında farklılık olduğu göz önüne alındığında, deney birinci seriye ait metabolik profil deneyinde kullanılacak bEnd.3 hücrelerinin uygun tanımlanmasıyla ölçülebilir OCR seviyelerini elde etmek için dizayn edilmiştir, gösterilen değerlendirmenin ardından Şekil 2. veri miktarı ve Şekil 3&#39;te. Bazal solunum, maksimal solunum sunulan ve yedek solunum kapasitesi hücre yoğunluğu ile orantılı tepki gösterdi edilir. Bununla birlikte, ATP üretimi aşırı birleşik hücre kültürü olduğunu düşündüren oyuk başına 64 x 10 3 hücreleri seçildi düşerkenBu deney için uygun değildir. Mitokondriyal bozucuların yanıt göre oyuk başına 3 ila 10 x 32 hücreler, - Optimal hücre yoğunlukları 8 arasında gerçekleşir. Takip eden deneyler için, oyuk başına 16 x 10 3 hücre tohum yoğunluğu OCR değişikliklerin uygun tespiti için izin vermek için kullanılmıştır. Oyuk başına 16 x 10 3 hücreleri kullanılarak, OCR beklenen yanıtları gözlendi ve mikroRNA miR-34A CVE hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu (Şekil 4) azalttığını göstermiştir. Biz daha önce miR-34a bu hücrelerin 13 oksidatif fosforilasyon azalttığını bildirdi. Tekrarlanan deneyler de maksimal solunum ve yedek kapasite önemli ölçüde anlamlı bir değişiklik olsa bile bazal solunum, ATP üretimi ve proton sızıntısı olsa, 24 saat sonrası transfeksiyon de CVEs içinde miR-34a aşın azalarak olduğunu gösterdi (Şekil 4) . Bu veriler,CVEs mitokondriyal fonksiyon değişiklikleri tespit etmek için Bioanalyzer hassasiyetini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig1.jpg" /> Hücre, plaka için. Denemeye zaman çizelgesi 1. Stratejik Planlama Şekil ve kartuş hazırlık gösterilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54847/54847fig2.jpg" /> Şekil çeşitli hücre yoğunlukları olan CVE hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun 2. Örnek ham veriler. Oksijen tüketimi oranları farklı hücre yoğunlukları olan CVE hücrelerinde ölçüldü. Veriler ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı; FCCP: karbonil siyanit-4- (trifluorometoksi) fenilhidrazon;<html> Rot / Anti-A: rotenone ve antimycin A. ①, ② ve ③ bazal solunum gösterir; ④, ⑤ ve ⑥ ATP solunum bağlantılı olduğunu gösterir; ⑦, ⑧ ve ⑨ fazla solunum gösterir; ⑩, ⑪ ve ⑫ olmayan mitokondriyal solunum gösteriyor. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54847/54847fig3.jpg" /> Çeşitli Hücre Yoğunlukları ile CVE Hücreleri Bioenerjetik Fonksiyon Şekil 3. Temsilcisi Sonuçlar. Bazal solunum, ATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite Biyoenerjetiğin tarafından oluşturulan ham verilerden hesaplanan Şekil formülleri kullanarak 2 fonksiyonel tahlil Bölüm 4&#39;te belirtilen . Veri ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı.<html> f = &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54847/54847fig4.jpg" /> Şekil 4: miR-34a tarafından Azalmış Bioenerjetik Fonksiyonun Temsilcisi Sonuçlar (A) Mitokondriyal Fonksiyon Ham veri 24 saat sonrası transfeksiyon de miR-34a aşın şu.. (B) Bazal solunum, ATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite Bioenerji Şekil 4A fonksiyonel tahlil tarafından oluşturulan ham verilerden hesaplanır; parametreleri miR-34a Bölüm 4 aşırı ifadesinin belirtilen formüller hesaplanmıştır 24 saat sonra, transfeksiyon olan CVE hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu azaltır. Veriler ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı. ****, P &lt;0.0001.dosyaları / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/54847/54847table1.jpg" /> Tablo 1. Enstrüman çalıştırın Protokolü.

Endotel hücre mitokondri, kan-beyin bariyeri bütünlüğünü korumak açısından kritik önem taşımaktadır. Bu serebral vasküler endotel hücrelerinde bioenergetic fonksiyonu ölçmek için bir protokolü getirmektedir.

Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Bu prosedürün genel amaçları, mitokondriyal fonksiyon değişikliklerinin nörolojik bozuklukların gelişimini nasıl etkilediğini değerlendirmek ve kan-beyin bariyeri açıklıkları üzerinde doğrudan etkisi olan terapötikler tasarlamaktır. Bu yöntem, nörolojik bozukluklar alanındaki; örneğin, bir inme sonrası nöronal hücre ölümü nasıl minimize edilebilir? gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tam ve sağlam hücrelerde mitokondriyal fonksiyonun gerçek zamanlı değerlendirmesini sağlamasıdır.Serebral vasküler endotel hücrelerini, T75 santimetrekarelik bir doku kültürü flaskında, 37 °C ve %5 karbondioksit içeren komple medyumda %80 konfluense ulaşana kadar büyüttükten sonra, hücre kültürü medyumunu dökün ve hücreleri tripsin EDTA ile durulayın. Ardından, flaska 1 ila 2 mL taze tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri 37 °C'de üç ila beş dakika boyunca ayırın. Hücrelerin kalktığı bir ters mikroskop altında doğrulandıktan sonra, 10 mL taze komple hücre medyumunun nazikçe eklenmesiyle reaksiyonu durdurun ve hücreleri santrifüj için 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.Süpernatantı uzaklaştırın ve peleti başka bir santrifüj işlemi için 10 mililitre taze komple büyüme ortamı ile yıkayın. Ardından, alt kültür için peleti mililitre başına 2 × 10⁵ hücre konsantrasyonunda komple büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Uygun sayıda alt kültürden sonra, 96 kuyucuklu bir hücre dışı akış hücre kültürü plakasına her kuyucuğa 80 mikrolitre komple ortam içerisinde 1,6 × 10⁴ hücre ekleyin ve plakayı %5 karbondioksit içeren 37 derece Celsius sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin.Hücreler plakaya yapıştıktan sonra, ilgili kuyucuklara hedeflenen işlemi ekleyin ve hücreleri inkübatöre geri yerleştirin. Mitokondriyal fonksiyonel değerlendirme analizinden bir gün önce, bir ekstraselüler fluks sensör kartuşunu 150 µL ekstraselüler fluks kalibrasyon solüsyonu ile nemlendirin ve plağı karbondioksitsiz olarak 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, hücre kültürü ortamını pH 7.0 ekstraselüler fluks analiz ortamı ile değiştirmek için plaka yıkama istasyonunu kullanın.Ardından, hücreleri karbondioksit olmadan, 37 °C'de 30 ila 60 dakika boyunca inkübe edin. Hücreler dengelendiğinde, hidrate edilmiş kartuşu Bioanalyzer'a yerleştirin ve kalibrasyonu başlatmak için Start düğmesine tıklayın. Kalibrasyonun sonunda, kartuş taban plakasını çıkarmak ve hücre plakasını yüklemek için Unlock Cartridge istemine tıklayın.Ardından, Bioanalyzer'dan elde edilen hız değerlerini hesap çizelgesi dosyasına aktarmak için veri dosyasını açın. Yanıtların kinetiği ve bağıl yoğunluğu farklı serebral vasküler endotel hücre tipleri arasında değişkenlik gösterdiğinden, bu deneylerde, bir metabolik profilleme analizinde oksijen tüketim hızı seviyelerini ölçmek için optimal hücre sayısını belirlemek amacıyla bir dizi bEnd. 3 hücresi konsantrasyonu kullanılmıştır.Gözlemlendiği üzere, bazal ve maksimal solunum ile yedek solunum kapasitesi, hücre yoğunluğuna orantılı bir yanıt göstermektedir. Bununla birlikte, kuyuk başına en yüksek hücre konsantrasyonu kullanıldığında ATP üretimi azalmaktadır; bu durum, aşırı konflüent bir hücre kültürünün deney için uygun olmadığını göstermektedir. Optimal hücre yoğunluklarının, kuyuk başına hücre sayısının orta aralığında olduğu görülmektedir.Bu nedenle, orta düzeyde bir hücre konsantrasyonu kullanılarak gerçekleştirilen bu temsili deneyde beklenen oksijen tüketim hızı seviyeleri değerlendirilmiş ve kodlamayan öncül mRNA moleküllerinin serebral vasküler endotel hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu azalttığı gösterilmiştir. Bu deneyler ayrıca, bazal respirasyon, ATP üretimi ve proton sızıntısında anlamlı bir değişiklik görülmemesine rağmen, transfeksiyondan 24 saat sonra bu moleküllerin serebral vasküler endotel hücrelerinde aşırı ekspresyonunun maksimal respirasyonu ve yedek kapasiteyi önemli ölçüde azalttığını kanıtlamaktadır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik iki gün içinde tamamlanabilir.Hücrelerin ekilmesinden mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesine kadar tüm süreç, doğru şekilde uygulandığında sonuç verir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, diğer tüm işlemlere başlamadan önce optimal hücre yoğunluğunun belirlenmesinin son derece önemli olduğunu unutmamak gerekir. Bu prosedürün ardından, azalmış hücre canlılığı veya diğer metabolik yolaklardaki değişiklikler nedeniyle mitokondriyal fonksiyonda meydana gelen değişimlere ilişkin ek soruları yanıtlamak için hücre canlılığı veya glikolitik analizler gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Geliştirilmesinin ardından bu teknik, mitokondriyal fonksiyon alanındaki araştırmacıların, izole mitokondrilerin yanı sıra sağlam hücreleri kullanmalarının ve nörolojik hastalıklar, kanser veya metabolik bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, serebral vasküler endotel hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonlara nasıl erişileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

evaluation-bioenergetic-function-cerebral-vascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Bu video, hücre dışı akı testi kullanılarak serebral vasküler endotelyal (CVE) hücrelerin mitokondriyal işlevinin değerlendirmesini göstermektedir. CVE hücreleri, hücre dışı bir akı hücre kültürü plakasında kaplanır. Hücre dışı akı sensörleri, biyoanalizöre yüklenmeden ve kalibrasyondan önce hidratlanır. Hücreleri içeren plaka daha sonra analiz için yüklenir.

Serebral vasküler endotel hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi

Endotel disfonksiyonu sayısız hastalık durumları ile ilişkili olan ve insanlarda olumsuz kardiyovasküler olaylar için bir öngörü olduğunu. Akış-aracılı vazodilatasyon (FMD) endotel fonksiyonunu değerlendirmek için bir non-invaziv ultrason yöntemidir. Metodolojik seçimler ve operatör deneyimi sonuçlarını etkileyebilir. Insan çalışmalarında FMD için sistematik bir yaklaşım burada ele alınmıştır.

Klinik Araştırmalarda Brakial Arter Ultrason değerlendirilmesi Endotel Bağımlı Akış Dolayımlı Vazodilatasyon

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC), kan-beyin bariyeri (BBB) olarak adlandırılan, kanı ve merkezi sinir sistemini (CNS) ayıran yüksek düzeyde düzenlenmiş bir bariyer oluşturan spesifik bağlantı proteinleri ile birbirine bağlanır. Bu protokolde tartışıldığı gibi primer murin beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin izolasyonu, BBB'nin ayrıntılı in vitro çalışmalarını mümkün kılar.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Bu makale, aterosklerozun farklı aşamalarını değerlendirmek için tıbbi araştırmalarda yaygın olarak kullanılan vasküler fonksiyon ve morfolojinin çeşitli invaziv olmayan değerlendirmeleri için metodolojik hususları açıklamaktadır.

Vasküler Fonksiyon ve Morfoloji Non-invaziv Değerlendirmelerine Bir Metodolojik Yaklaşım

Biz, tespit miktarının ve ligandların vasküler endotelyal büyüme faktörü ailesinin üyelerinin aktivitesini izlemek için basit bir hücre bazlı biyolojik tayini açıklamaktadır. Deney ligand ile reseptör ve çapraz bağlama bir yarı-nicel veya kantitatif bir değerlendirmesini sağlamak için bir faktör bağımlı hücre hattı içinde ilave kimerik reseptörler kullanır.

Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörlerinin Değerlendirilmesi için Basit Biyoassay

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Biz üç basit in vitro tahliller-uzun mesafe göç tahlil, co-kültür göç tahlil ve kemo-attraction tahlil-topluca insan kök hücre perisiyitli endotel hücreleri ve bunların işlevlerini değerlendirmek GABAerjik internöronlar ile etkileşim.

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Serebral parankimal arteriollerden sağlam fare serebral endotelyal "tüplerinin" yoğun bir şekilde hazırlanması, serebral kan akışı regülasyonunu incelemek için gösterilmiştir. Ayrıca, bu endotel çalışma modelinin floresan görüntüleme ve anahtar hücresel sinyal yollarının elektrofizyoloji ölçümü için, hücre içi [Ca2+] ve membran potansiyelindeki değişiklikler de dahil olmak üzere deneysel güçlerini gösteriyoruz.

Fare Beyin Parankiminin Arteriyolar Endotelinin İzolasyonu ve Fonksiyonel Analizi

Bu protokol, beyin kan bariyerinin güvenilir ve verimli bir in vitro modelini tanımlar. Yöntem, fare serebral vasküler endotel hücreleri bEnd.3'ü kullanır ve transmembran elektrik direncini ölçer.

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

Burada empedans tabanlı biyosensörleri kullanma tekniğini gösteriyoruz: beyin endotel bariyer gücünü ölçmek için ECIS ve cellZscope. Beyin endotelinin in vitro modeline çeşitli uyaranlar eklemenin hazırlanmasını ve tekniğini detaylandırıyoruz. Bulguları ölçüyor, kaydediyor ve temsili bir analiz yapıyoruz.

Kanser Hücreleri ve Sitokinlere Yanıt Olarak İki Empedans Tabanlı Biyosensör ile Beyin Endotel Bariyer Bütünlüğündeki Değişikliklerin Ölçülmesi

Keşfedin serebral vasküler endotelyal hücrelerde mitokondriyal fonksiyon değerlendirmesi için ekstraselüler flüks analizörü kullanımını. Bu yöntem, kan-beyin bariyeri bütünlüğünü incelemek ve nörolojik bozukluklarda hücre ölümünü en aza indirmek için kritik öneme sahiptir.

Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet