ve Cefoperazone-tedavi edilmiş fare modeli klinik olarak ilgili

Bu protokolün genel amacı, klinik hastalık izleme, bakteri sayımı, toksin sitotoksisitesi ve challenge sonrası histopatolojik değişikliklere özel bir vurgu yaparak, Clostridium difficile enfeksiyonu cefoperazon fare modelinin uygulanması için adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Bu ayrıntılı protokol, araştırmacıların, bu bakterinin patogenezini incelemek ve yeni terapötik yöntemlere erişmek için temel teşkil eden Clostridium difficile enfeksiyonu fare modelini doğru bir şekilde uygulamalarına yardımcı olacaktır. Bu fare modelini kullanmanın temel avantajı, beş gün boyunca tek bir antibiyotiğe maruz bırakılmanın, fareleri C.difficile kolonizasyonuna ve insan hastalığı ile eş zamanlı, uzun süreli bir klinik enfeksiyon seyrine karşı duyarlı hale getirmesidir.

Başlamak için, ilgili C.difficile stok suşunu alın ve vorteksleyin. Bir laminar akış kabininde, stoğu vidalı kapaklı bir tüp içinde steril su ile 25 µL başına 10⁵ spor konsantrasyonuna gelecek şekilde seyreltin. Karışımı spor inokülumu olarak etiketleyin ve tüpü 20 dakika boyunca 65 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.

Ardından, laminar akışlı kabinde, ısıtılmış spor inokülümünden 50 µL'yi steril bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve daha sonra kullanmak üzere anaerobik kamaraya aktarın. Kalan spor inokülümünü, steril balon uçlu bir gastrik gavaj iğnesine takılı 1 mL'lik bir şırıngaya doldurun. Laminar akışlı kabinde, denek fareyi alın ve hayvanı boyun ve sırt kısmındaki gevşek deriden nazikçe tutarak başını sabitleyin.

İşaret parmağını kullanarak ve hayvanın ses çıkarmadığından veya stres belirtileri göstermediğinden emin olarak, hayvanın başını daha fazla sabitleyin ve özofagusu uzatın. Fareyi dik, dikey bir pozisyonda tutun ve gavage iğnesini nazikçe ağzın yan tarafına yerleştirin. Gavage iğnesini ağız tavanı boyunca yönlendirin ve yavaşça özofagusa doğru ilerletin.

İğne yemek borusunun yaklaşık ortasına ulaştığında, 25 µL spor inokülumu enjekte edin ve ardından iğneyi nazikçe geri çekin. Hayvanı kafesine geri koyun ve yanlışlıkla trakeal uygulama yapıldığını gösterebilecek öksürük veya solunum sıkıntısı belirtileri olup olmadığını gözlemleyin. Ardından, daha önce anaerobik odada saklanan spor inokulumu alikotunu ve kalan gavage spor inokulumunu alın ve 180 µL 1x PBS içinde bir ila on arası seri dilüsyonlar hazırlayın.

Bu dilüsyonlardan dört veya beş adet gerçekleştirin. Aseptik teknik kullanarak, her bir seri dilüsyondan 100 µL'yi ayrı bir TCCFA plakasına aktarın. Her seferinde yeni ve steril L şeklinde bir yayma çubuğu kullanarak, dilüsyon inokülasyonlarını her plakaya eşit şekilde yayın.

Plakları anaerobik koşullar altında 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Son olarak, her dilüsyon plağındaki C.difficile kolonilerini sayın ve farelere uygulanan enfektif dozu elde etmek için koloni oluşturan birim sayısını hesaplayın. Değerlendirme için farelerden dışkı örnekleri toplamak amacıyla, öncelikle hayvanın stres altına girmediğinden emin olarak, denek fareyi boyun ve sırt bölgesindeki gevşek deriden hafifçe ancak sıkıca tutarak sabitleyin.

Serçe parmağınızı kullanarak hayvanın kuyruğunu nazikçe kaldırın ve anüsü açığa çıkarın. Ağırlığı bilinen steril bir mikro santrifüj tüpünü, tüpün fareye doğrudan temas etmediğinden emin olarak hayvanın anüsünün hemen altına tutun. Hayvan dışkıladığında, dışkı peletini tüpe toplayın.

Tüm gerekli örnekler toplanana kadar tüpü oda sıcaklığında saklayın. Dışkı içeren tüpleri analitik bir teraziyle tartın ve kütleyi virgülden sonra dört basamak olacak şekilde kaydedin. Tüpün ağırlığını çıkararak dışkı peletinin ağırlığını hesaplayın.

Ardından, içeriğin bire on dilüsyonunu hesaplayın ve 1x PBS içinde yeniden süspande edin. Dışkı materyalini çözelti içinde nazikçe dağıtmak için pipet ucunu kullanın. İçeriğin çökmesine izin vererek örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Çözeltileri anaerobik koşullarda muhafaza ederek, her örnek için 1x PBS içerisinde seri dilüsyonlar hazırlayın. Her seri dilüsyondan 100 µL'yi TCCFA plaklarına aktarın. Steril L şeklinde bir yayma çubuğu kullanarak medyumu plakalara eşit şekilde yayın.

Plakaları anaerobik koşullarda 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. Son olarak, C.difficile kolonilerini sayın ve gram dışkı içeriği başına düşen koloni oluşturan birim miktarını hesaplayın. Bu şekil, C.difficile R20291 ile enfekte edildikten sonraki günlerdeki fare ağırlığını göstermektedir.

Sıfırıncı günde, başlangıç ağırlığı 100 olarak belirlenmiştir. Takip eden 14 gün boyunca her gün ortalama fare vücut ağırlığı ölçülmüştür. Challenge uygulanan farelerde, challenge sonrası ikinci ile yedinci günler arasında ağırlıkta anlamlı bir azalma gözlenmiştir.

Farelerin bu noktadan sonra iyileştiği ve kilo aldığı görülmüştür. Burada, challenge sonrası günlerde dışkıdaki C.difficile yükü gösterilmiştir. Challenge sonrası 24. saatte, tüm fareler gram başına 10⁷ CFU dışkı ile kolonize olmuştur.

C.difficile hala mevcut olsa da, bu yük yedinci günden itibaren azalmıştır. Enfeksiyonun seyri boyunca farelerin histopatolojik incelemesi, en belirgin patolojik değişikliklerin sekumda olduğunu göstermiştir. Toplam sekum histolojik skorları, sıfırıncı gün ile challenge sonrası ikinci ve dördüncü günler arasında anlamlı derecede farklılık göstermiştir.

Genel olarak, bu fare modelini ilk kez kullanacak olan kişiler, farelere uygulama yapmak için kullanılan spor inokulumunun hesaplanması ve hazırlanması ile fekal C.difficile bakteri yükünün hesaplanmasında zorluk yaşayabilirler. Bu protokol uygulanırken, farelere uygulanan C.difficile sporlarının dozunun veya suşunun değiştirilmesinin, bu modelin sonucunu etkileyebileceğini unutmamak önemlidir.