ve Cefoperazone-tedavi edilmiş fare modeli klinik olarak ilgili Clostridium difficile Gerilme R20291

Bu protokolün genel amacı, Clostridium difficile enfeksiyonunun sefoperazon fare modelini uygulamak için adım adım bir kılavuz sağlamak, klinik hastalık izleme, bakteri sayımı, toksin sitotoksisitesi ve meydan okuma sonrası histopatolojik değişikliklere özel önem vermektir. Bu ayrıntılı protokol, araştırmacıların, bu bakterinin patogenezini incelemek ve yeni terapötiklere erişmek için gerekli olan Clostridium difficile enfeksiyonunun bir fare modelini doğru bir şekilde yürütmelerine yardımcı olacaktır. Bu fare modelini kullanmanın temel avantajı, beş gün boyunca bir antibiyotiğe maruz kalmanın, fareleri C. difficile'nin kolonizasyonuna ve insan hastalığı ile eşzamanlı olarak uzun süreli bir klinik enfeksiyon seyrine duyarlı hale getirmesidir.

Başlamak için, C.difficile hisse senedi ilgi türünü ve girdabını alın. Laminer akış başlığında, stoğu vidalı kapaklı bir tüpte steril su içinde 25 mikrolitre başına on ila beşinci spor konsantrasyonuna kadar seyreltin. Karışımı spor aşısı olarak etiketleyin ve tüpü 20 dakika boyunca 65 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.

Daha sonra, laminer akış başlığında, ısıtılmış spor aşısının 50 mikrolitresini steril bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin ve daha fazla kullanılana kadar anaerobik odaya geçirin. Kalan spor aşısını, steril ampul uçlu bir mide gavaj iğnesine bağlı bir mililitrelik şırıngaya yükleyin. Laminer akış başlığında, bir denek faresi alın ve hayvanı boynun ve sırtın gevşek derisi ile nazikçe kısıtlayarak başını hareketsiz hale getirin.

İşaret parmağını kullanarak ve hayvanın ses çıkarmamasını veya sıkıntı belirtisi göstermemesini sağlamak, hayvanın kafasını daha da hareketsiz hale getirin ve yemek borusunu uzatın. Fareyi dik, dikey konumda tutun ve gavaj iğnesini nazikçe ağzın yan tarafına geçirin. Gavaj iğnesini ağzın çatısı boyunca yönlendirin ve yavaşça yemek borusuna doğru ilerletin.

İğne yemek borusunun yaklaşık yarısına geldiğinde, 25 mikrolitre spor aşısı enjekte edin ve ardından iğneyi yavaşça geri çekin. Hayvanı kafesine geri koyun ve yanlışlıkla trakeal uygulamayı gösterebilecek herhangi bir öksürük veya solunum sıkıntısı belirtisi olup olmadığını gözlemleyin. Daha sonra, daha önce anaerobik odada saklanan spor inokulum alikotunu ve kalan herhangi bir gavaj spor inokulunu alın ve 180 mikrolitre 1x PBS'de bir ila on seri seyreltme yapın.

Bu seyreltmelerden dört ila beşini gerçekleştirin. Aseptik teknik kullanarak, her seri seyreltmenin 100 mikrolitresini ayrı bir TCCFA plakasına aktarın. Her seferinde yeni bir steril L şeklinde yayıcı alarak, seyreltme inokulamasını her plakaya eşit olarak dağıtın.

Plakaları anaerobik koşullar altında 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Son olarak, her bir seyreltme plakasındaki C. difficile kolonilerini sayın ve farelere uygulanan enfektif dozu elde etmek için koloni oluşturan birimleri hesaplayın. Değerlendirme için farelerden dışkı örnekleri toplamak için, önce denek fareyi boynundaki ve sırtındaki gevşek deri ile hafifçe ama sıkıca tutun ve hayvanın sıkıntı içinde olmadığından emin olun.

Serçe parmağınızı kullanarak, hayvanın kuyruğunu nazikçe kaldırın ve anüsü açığa çıkarın. Ağırlığı bilinen steril bir mikrosantrifüj tüpünü doğrudan hayvanın anüsünün altında tutun ve tüpün fareye doğrudan temas etmediğinden emin olun. Hayvan dışkı yaptığında, dışkı peletini tüpte toplayın.

Gerekli tüm numuneler toplanana kadar tüpü oda sıcaklığında saklayın. Dışkı içeren tüpleri analitik bir ölçekte tartın ve kütleyi dört ondalık basamağa kaydedin. Tüpün ağırlığını çıkararak dışkı peletinin ağırlığını hesaplayın.

Ardından, içeriğin bir ila on seyreltmesini hesaplayın ve 1x PBS'ye yeniden süspanse edin. Dışkı maddesini nazikçe çözelti haline getirmek için pipetin ucunu kullanın. Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve içeriğin çökmesine izin verin.

Çözeltileri anaerobik olarak koruyarak, 1x PBS'de her numune için seri seyreltmeler yapın. Her seri seyreltmenin 100 mikrolitresini TCCFA plakalarına aktarın. Steril L şeklinde bir yayıcı kullanın ve ortamı plakalara eşit şekilde uygulayın.

Plakaları anaerobik koşullarda 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Son olarak, C.difficile kolonilerini numaralandırın ve dışkı içeriğinin gramı başına koloni oluşturan birimi hesaplayın. Bu şekil, C.difficile R20291 ile mücadeleyi takip eden günlerdeki fare ağırlığını göstermektedir.

Sıfırıncı günde, temel ağırlık 100 olarak ayarlanır. Ortalama fare vücut ağırlığı, 14 gün boyunca her gün ölçüldü. Meydan okunan farelerde, meydan okumadan sonraki iki ila yedinci günlerde ağırlıkta önemli bir azalma gözlendi.

Farelerin bu noktadan sonra iyileştiği ve kilo aldığı ortaya çıktı. Burada, meydan okumadan sonraki günlerde dışkıdaki C.difficile yükü gösterilmektedir. Meydan okumadan 24 saat sonra, tüm fareler dışkı gramı başına 10 ila yedinci CFU ile kolonize edildi.

Bu yük yedinci günden itibaren azalmıştı, ancak C. difficile hala mevcuttu. Enfeksiyonun seyri boyunca farelerin histopatolojik incelemesi, çekumdaki en önemli patolojik değişiklikleri gösterdi. Toplam çekal histolojik skorlar, sıfırıncı gün ile meydan okumadan sonraki ikinci ve dördüncü günler arasında anlamlı olarak farklıydı.

Genel olarak, bu fare modelinde yeni olan bireyler, farelere meydan okumak için kullanılan spor aşısının hesaplanması ve hazırlanması ve dışkı C. difficile bakteri yükünün hesaplanması ile mücadele edebilir. Bu protokolü denerken, farelere uygulanan C. difficile sporlarının dozunda veya suşunda yapılan değişikliklerin bu modelin sonucunu değiştirebileceğini hatırlamak önemlidir.