Name: Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Öğrenin SAXS deneylerinde online SEC ve IEC kullanarak yapısal biyoloji verilerinin kalitesini nasıl artırabilirsiniz. Bu yöntemler protein yapısı ve dinamikleri analizinde güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Proje için Fransız hibesi REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014'ten ve Service de Santé des Armées ve Délégation Générale pour l'Armement'ten araştırma hibelerinden mali destek alıyoruz. SAXS ışınlama süresi için ESRF'ye müteşekkiriz. Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister ve Guy Schoehn'e finansal ve bilimsel destekleri için teşekkür ederiz.

<ol><li>Graewert, M. A., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+and+progress+in+small+and+wide+angle+X-ray+scattering+%28SAXS+and+WAXS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Impact and progress in small and wide angle X-ray scattering (SAXS and WAXS).</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 748-754 (2013).</li>
<li>Jacques, D. A., Trewhella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-angle+scattering+for+structural+biology-Expanding+the+frontier+while+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls.</a> Protein Sci. 19, 642-657 (2010).</li>
<li>Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+small+angle+X-ray+scattering+%28SAXS%29+of+flexible+and+intrinsically+disordered+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins.</a> FEBS Lett. 589, 2570-2577 (2015).</li>
<li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+solution+scattering+%28SAXS%29+combined+with+crystallography+and+computation%3A+defining+accurate+macromolecular+structures%2C+conformations+and+assemblies+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Q. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).</li>
<li>Vestergaard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+biostructural+changes%2C+dynamics%2C+and+interactions+-+Small-angle+X-ray+scattering+to+the+rescue%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Analysis of biostructural changes, dynamics, and interactions - Small-angle X-ray scattering to the rescue.</a> Arch. Biochem. Biophys. , (2016).</li>
<li>David, G., Pérez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography%3A+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> J. Appl. Crystallogr. 42, 892-900 (2009).</li>
<li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Pipeline+for+Purification%2C+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Lambright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+techniques+enhance+the+quality+and+scope+of+information+obtained+from+SAXS%5BTitle%5D)+AND+%22ACA+Trans%22%5BJournal%5D)">Complementary techniques enhance the quality and scope of information obtained from SAXS.</a> ACA Trans. , 1-12 (2013).</li>
<li>Mathew, E., Mirza, A., Menhart, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-chromatography-coupled+SAXS+for+accurate+sizing+of+aggregating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Liquid-chromatography-coupled SAXS for accurate sizing of aggregating proteins.</a> J. Synchrotron Radiat. 11, 314-318 (2004).</li>
<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+GH3.+12+protein+conformation+through+HPLC-integrated+SAXS+measurements+combined+with+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Determination of the GH3. 12 protein conformation through HPLC-integrated SAXS measurements combined with X-ray crystallography.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 69, 2072-2080 (2013).</li>
<li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> J. Chromatogr. 1216, 7461-7465 (2009).</li>
<li>Hutin, S., Brennich, M. E., Maillot, B., Round, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+ion-exchange+chromatography+for+small+angle+X-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Online ion-exchange chromatography for small angle X-ray scattering.</a> Acta Cryst. , (2016).</li>
<li>Selkirk, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography.</a> Protein Purification Protocols. , 125-131 (2004).</li>
<li>Yigzaw, Y., Hinckley, P., Hewig, A., Vedantham, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+exchange+chromatography+of+proteins+and+clearance+of+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ion exchange chromatography of proteins and clearance of aggregates.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 10, 421-426 (2009).</li>
<li>Pernot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upgraded+ESRF+BM29+beamline+for+SAXS+on+macromolecules+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Upgraded ESRF BM29 beamline for SAXS on macromolecules in solution.</a> J. Synchrotron Radiat. 20, 660-664 (2013).</li>
<li>Iyer, L. M., Koonin, E. V., Leipe, D. D., Aravind, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolution+of+the+archaeo-eukaryotic+primase+superfamily+and+related+palm-domain+proteins%3A+structural+insights+and+new+members%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members.</a> Nucleic Acids Res. 33, 3875-3896 (2005).</li>
<li>Singleton, M. R., Dillingham, M. S., Wigley, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+helicases+and+nucleic+acid+translocases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of helicases and nucleic acid translocases.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 23-50 (2007).</li>
<li>Hutin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+vaccinia+virus+helicase-primase+D5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Domain organization of vaccinia virus helicase-primase D5.</a> J. Virol. , 4604-4613 (2016).</li>
<li>Round, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioSAXS+Sample+Changer%3A+a+robotic+sample+changer+for+rapid+and+reliable+high-throughput+X-ray+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D.+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">BioSAXS Sample Changer: a robotic sample changer for rapid and reliable high-throughput X-ray solution scattering experiments.</a> Acta Crystallogr. Sect. D. Biol. Crystallogr. 71, 67-75 (2015).</li>
<li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB+for+BioSAXS%2C+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71, 76-85 (2015).</li>
<li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline%2C+BM29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> J. Appl. Crystallogr. 49, (2016).</li>
<li>Petoukhov, M. V., Konarev, P. V., Kikhney, A. G., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATSAS+2.1-towards+automated+and+web-supported+small-angle+scattering+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">ATSAS 2.1-towards automated and web-supported small-angle scattering data analysis.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 223-228 (2007).</li>
<li>Franke, D., Jeffries, C. M., Svergun, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+Map%2C+a+goodness-of-fit+test+for+one-dimensional+X-ray+scattering+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlation Map, a goodness-of-fit test for one-dimensional X-ray scattering spectra.</a> Nat. Methods. 12, 419-422 (2015).</li>
<li>Schrodinger, LLC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+PyMOL+Molecular+Graphics+System%2C+Version+1.8%22">The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8</a>. , (2015).</li>
<li>Jensen, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+SAXS+measurements+facilitated+by+online+HPLC+buffer+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">Time-resolved SAXS measurements facilitated by online HPLC buffer exchange.</a> J. Synchrotron Radiat. 17, 769-773 (2010).</li>
<li>Hynson, R. M., Duff, A. P., Kirby, N., Mudie, S., Lee, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+ultracentrifugation+coupled+to+small-angle+X-ray+scattering+on+macromolecular+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Differential ultracentrifugation coupled to small-angle X-ray scattering on macromolecular complexes.</a> J. Appl. Crystallogr. 48, 769-775 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Birçok makromoleküller için kromatografi kullanılarak, son bir arıtma adımı kaliteli bir veri seti elde etmek için SAXS veri toplama öncesinde gereklidir. Ancak, tüm numuneler sabit kalır; onlar oligomerizasyon devletler karışımına toplama veya yeniden dengeleme eğilimli olabilir. Bu nedenle, ışın-hattı ile ilgili son bir çevrimiçi saflaştırma adımı en kaliteli SAXS verilerini elde etmek üzere saflaştırma ve veri toplama arasındaki süreyi en aza indirmek için kullanılır. ilgili proteinin biyofiziksel özelliklerine bağlı olarak, sek-SAXS veya IEC-SAXS uygun örnek kalitesini elde etmek için seçilebilir. Burada, helikaz / primaz D5 türetilmiş bir protein yapı üzerinde, hem teknik açıklanmış ve tartışılmıştır. SEC-SAXS veri toplama daha standardize hale geliyor ve birçok BioSAXS ışın demetleri üzerinde temin edilebilir. Veri analizi, özellikle arka plan çıkarma, nispeten basit ve kolaydır. Bununla birlikte, sabit bir tampon sinyalininve makromoleküler türlerin yeterli ayrılması esastır kalır. Nedenle, iyice sütun dengelenmesi için yeterli zaman ayırmak önemlidir. Bu yöntemin arıza çıkar, düşük konsantrasyonlarda, ve radyasyon duyarlı tamponların proteine ​​benzer büyüklükte kalıcı kirletici bağlı olabilir. Uygulamada, ilk, sek-SAXS en makromoleküler örnekler için tercih edilen yöntem olarak kullanılması olasıdır. Yine de, birçok saflaştırma protokolleri kirletici ya toplanmasının varlığı nedeniyle, önceki IEC adım gerektirir. Her bir konsantrasyon ve kromatografi aşaması (% 30-50 olduğu tahmin) örnek ve zaman kayıpları ile bağlantılı olduğu göz önüne alındığında, doğrudan IEC SAXS avantajlıdır. SEC tarafından arıtılmış edilemez numuneler için, nedeniyle benzer büyüklükteki &quot;kirletici&quot; varlığı ya da gerekli konsantrasyonlarda ciddi agrega, IEC-SAXS her zaman daha iyi uygundur yaklaşım olurdu çünkü olsun. Ayrıca, daha yüksek akış hızları desteklenenbirçok kişi tarafından IEC sütun saflaştırma ve ölçüm arasındaki geçiş süresini azaltmak için yardımcı olabilir. Burada verilen örnekte, IEC dikkatle tuz konsantrasyonu adımları seçerek kirletici maddelerden D5 323-785 yakın tepe ayrılması için sağlayan bir adım elüsyon ile kullanılmıştır. Prensip olarak, adım sayısı sınırsızdır ama pratikte, tepe başına en az 1 adım gereklidir ve çok az seçilmelidir. Yukarıda tarif edilen arka plan çıkarma yöntemi için, uygun bir bulmak için farklı tampon terkipleri arasında, nispeten yüksek bir sayısını ölçmek için çok önemlidir. Her iki teknik bir ortak dezavantajı kesin protein konsantrasyonu bilgi eksikliğidir. Buna bağlı olarak, ileri saçılma göre hassas kütlesinin belirlenmesi mümkün değildir. Böyle D5 323-785 olarak küresel proteinler için, poród hacmi son derece esnek ve düzensiz proteinlerin ancak, daha az hassas, kitle tahmin olsa bir alternatif sağlarBu yaklaşım geçerli olmaz. Burada sunulan basamaklı gradyan IEC SAXS yöntemin bir varyasyonu yerine bir doğrusal gradyan kullanılmasıdır. Bu adım adım elüsyon kullanılarak alt tepe izole etmek için arzu edildiği gibi doğrusal gradyan yaklaşımda, birçok adımda çalışmak mümkün olsa da, bunun tamamıyla SAXS başlamadan önce tepe ayırmak üzere dikkatlice gradyan koşulları optimize etmek için gerekli olan deney. Bu yaklaşımda arka plan çıkarma çerçeve bilge yapılabilir ve tek tek kare karşılaştırılması tarafından doğrulandı olabilir, ama daha gelişmiş veri işleme gerektirir ve özel bir yazılım henüz mevcut değil. Bu makromoleküler türlerin ayrılmasına belirler gibi uygun bir sütunu, her iki usul için çok önemlidir. iyon-değişim kolonları tür ve yoğunluk değişiklik gösterir boyut dışlama kolonlar, yükleme kapasitesi, ayrılabilir makromoleküllerin boyut aralığı ve çözünürlükte farklılıkonların hareketsiz ücretleri. Burada sunulan protokol basit prensip olarak herhangi bir diğer SAXS beamline da SDBY beamline BM29, adaptasyon, özel olsa. Ana şartlar oluşturma yeteneğine sahip yeterli derecede yüksek olan X-ışını akışı saniye ya da daha az aralığında uygun bir sinyal-ses verileri elde etmek için, uygun bir detektör (ideal olarak tek foton sayımı), ve bir online sıvı kromatografi sistemi vardır geçişlerini. Tam uygulama, tabii ki, yerel beamline çevre bağlı olacaktır. Iki yöntemi kullanarak D5 323-785 üzerinde elde edilen sonuçlar biraz farklıdır. dönme yarıçapı SEC verileri için olana göre IEC verileri için biraz daha küçük olan, ve dağılma eğrisinin lokal minimum biraz daha büyük yayılma vektörleri kaydırılır. Bu IEC SAXS ölçülen D5 323-785 biraz daha kompakt SEC-SAXS ölçülen D5 323-785 fazla olduğu anlamına gelir. Bu b olabilirSEC-saflaştınldı numunede bir kirletici daha az saflaştırma ve ölçüm tarihleri ​​arasında örnek hazırlama farklılıklar, (IEC hızlı) ya da, bağlı ör. Her iki yöntemde tamamen bağımsız olarak elde boncuk modelleri (Şekil 1H) karşılaştırılabilir. D5 323-785 beklenen içi boş, heksamerik yapıyı 18 göstermektedir. Sonuç olarak, çevrimiçi iyon değiştirme ve çevrimiçi boyut dışlama kromatografisi SAXS 6,7,9-12,25,26 doğrudan akuple edilebilir önemli biyokimyasal saflaştırma yöntemleri bulunmaktadır. IEC-SAXS verilerinin arka plan çıkarma biraz SEC-SAXS için daha zor ve belirsiz, ama yine de mümkündür. ilgili proteinin biyofiziksel özelliklerine bağlı olarak, SEC ve IEC SAXS hem doğal avantajlarına sahip türlerin ayrılması optimizasyonu için izin verir. doğrulama adımları (açıklandığı gibi) doğru gözlenir olduğunu, elde edilen verilerin analiz edilebilir zekâ sağlanmasıh güven ve modeller toplum içinde mevcut standart aletler kullanılarak tespit edilebilir. Birlikte, her iki tekniğin standart statik ölçümler üzerinden erişilebilir değil veri verimli, biyolojik makromoleküllerin geniş bir aralığı için çevrimiçi ayrılmasına izin verildi.

BioSAXS nano-boyutlu nesnelerin 1-4 şeklini belirlemek için güçlü bir araçtır. mil aralığı içinde boyut makromoleküller ihtiva eden bir çözelti ile X-ışını saçılması, çok düşük açılarda kaydedilir. Bu açısal aralık küresel parametreler hakkında bilgi içerir: dönme yarıçapı; en büyük intraparticle mesafe; parçacık şekli; ve katlanır, denatürasyon, ya da bozukluğun derecesi. Belirlenmesinde yararlı olabilir tekniği kristaller gerektirmez, ve makromolekül gibi iyonik vb kuvvet, pH, bu faktörlerin bilgisi olarak hücrenin belirli parametrelerin, taklit koşullarda muhafaza edilebilir ve böylece solüsyon içinde kalır ve, örneğin, veya ilgi bir proteinin fizyolojik ilgili oligomerik devlet bir kompleksin bir teklif modeli doğrulamak için. farklı tampon koşullarında protein-protein etkileşimlerinin karakterizasyonu, eksik etki modellerinin oluşturulması, homoloji model arıtma ve deayrık katlanmış ve katlanmamış devletlerin sona ermesi hızlı ve kolay 5 yapılabilir. un-yorumlanabilir verilere yol açabilir toplanan veya denatüre örnekleri, parçacıkların karışımları, heterojen örnekleri, radyasyon hasarı ve tampon uyumsuzlukları: herhangi bir teknik olduğu gibi, BioSAXS içsel zayıflıkları vardır. Birçok analiz yöntemleri için, dolaylı örnek uygulamada elde etmek oldukça zordur bir gereklilik, tek dağılımlı olduğu kabul edilir. Birçok durumda, numunenin bozulması ince olduğunu ve kendi veri tespit edilemez ve verileri yorumlamak için herhangi bir girişimi yanlış, hatta yanıltıcı sonuçlar verir. Bu engelleri aşmak için, boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve SAXS kombinasyonu veri kalitesini sağlamak ve giderek daha zor numuneler 6-11 için bu tekniğin daha erişilebilir hale getirmek için birçok ışın demetleri üzerinde uygulanmıştır. Son zamanlarda, online iyon değişimini geliştirerek repertuarına yeni bir yöntem ekledikromatografi (IEC) SAXS 12 -coupled. Her iki teknik analiz eskiden imkansız biyolojik parçacıkların geniş bir SAXS açıyoruz. kullanılacak yöntem seçimi ilgi partikülerinin biofiziksel özelliklerine bağlıdır. SEC görünür moleküler kütlede en az% 10&#39;luk bir fark ayrılması için gerekli olan, bunun sonucu olarak boyutuna göre makromolekülleri ayırır. kolon ve örneklerin fizyolojik özelliklerinin fiziksel sınırlamalar, hidrofobik yüzeylerin, esneklik ve istikrar eksikliği gibi, aynı zamanda veri toplama, analiz ve yorumlama zorlaştırıyor. IEC kolonuna dolayısıyla bağlanma afinitesine yüklerine göre molekülleri ayıran ve iyon değiştirme kromatografisi, yerine veya SEC ilave olarak kullanılabilir. toplam yük kolayca kontrol el için nispeten basit bir pH değiştirme ya da tampon tuzu konsantrasyonunu değişen sağlayarak manipüle edilebilirIEC sütundan moleküllerin Katkı. yükü kullanarak, aksi takdirde ayrı zor olan benzer türde ve moleküllerin boyutları ayrılması, IEC rutin gerçekleştirilebilir. Buna ek olarak, IEC bir protein denatüre potansiyel riski taşıyan konsantrasyon adımları önlemek için izin seyreltilmiş örnekleri ile başa çıkmak mümkün olma avantajına sahiptir. Yük dağılımı yüksek Örnek bağımlı olduğundan, bu, IEC pH ve tuz konsantrasyonlarında 13,14 ilgili optimizasyon gerektirir. Ifade saflaştırılması, veya her ikisi de zor olan birçok protein için, numunenin sadece düşük miktarlarda çalışma mevcuttur. Etkili olduğu ve bu nedenle, kayıp saflaştırma adımlarının sayısını en aza indirmek ve önemlidir. Bu nedenle, son saflaştırma adımı iyi bir veri seti toplama olasılığını artırmak amacıyla, çevrimiçi SAXS veri toplama doğrudan öncesidir. İşteBiz mevcut ve çevrimiçi SEC-SAXS ve IEC-SAXS karşılaştırın. Her iki teknik Grenoble, Fransa 15 Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi&#39;nde (SDBY) en BioSAXS beamline BM29 üzerinde uygulanmıştır. Bir test case olarak, diğer yöntemleri kullanarak yapısal analiz etmek oldukça zor oldu aşı virüsü proteininin D5, bir D5N ve helikaz domain kullanılır. aşı virüsü Poxviridae ailesinin bir üyesidir ve variola virüsü, küçük çiçeği nedeni% 98 aynıdır. aşı sistemini kullanarak, temel sarmal primaz D5 burada odaklanarak, çoğaltma makineleri çalışma. D5 sistein kümesi bir bölge (Res. 240-345) 16, ardından bir N-terminal Archeo-ökaryotik primaz (AEP) alan 16 ile 95 kDa proteinidir. Bundan başka Cı-terminalinde doğru D5N alanı (Res. 340-460) gelir, her D5 tipi helikazlar ile bağlantılı, ve son olarak bir süper 3 (SF3) helikas tanım olan (S. 460-785) 17 (Figüre 1 A). D5 helikas tanım dar DNA bağlanma için gerekli olan bir heksamerik halka yapısını oluşturur. Teşekkürler son SAXS ve EM çalışmalarına, primazm düşük çözünürlüklü yapıları ve sarmal alanları şimdi 18 bilinmektedir. Burada, D5 (323-785 kalıntısı) C-terminal parçası yapısı içgörü kazanmak için SDBY de BioSAXS beamline BM29 uygulanan çevrimiçi kromatografi teknikleri nasıl kullanacağınızı gösterir.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitol [DTT]</td> <td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>%10 Mini-PROTEAN TGX Prekast Protein Jeli</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>asetik asit buzul</td><td>VWR Kimyasalları (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra -15 Santrifüj filtreler Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonaz</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>bromofenol mavisi&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>Komple proteaz inhibitörü kokteyli&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG Tuzdan Arındırma kolonu</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>VWR Kimyasalları (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Nikel Afinitesi Jel</td><td>Sigma</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td> <td>VWR Kimyasalları (BDH Prolabo)</td> <td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB suyu Miller</td><td>Fluka Analitik</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2 </td> <td>ICN Biyomedikal A.Ş.</td><td></td><td></td>191421</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Kimyasalları (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>Tek Atış BL21 Yıldız (DE3)&nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb vektörü&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>Astarı</td><td>&nbsp; Eurofins mwg operon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kiti</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel ekstraksiyon kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR arıtma çocuğu</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Sağlık</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA jel lekesi</td><td>Invitrogen yaşam teknolojisi</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligaz</td><td>ThermoFisher bilimsel</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>ev yapımı</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Invitrogen yaşam teknolojisi</td><td>C404003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R sütunu&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta; -merkaptoetanol</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beamline kontrol yazılımı BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>yerel geliştirme</td></tr><tr><td>Camserver yazılımı</td><td>Dectris</td><td>n.a.detector</td> <td>kontrol yazılımı</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>ab</td><td>initio modellerini hizalamak için http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html programı&nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio model yeniden yapılandırma programı</td></tr><tr><td>HPLC programı Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC programı LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF De</td><td>Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>Yerel Gelişim</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>deneysel</td><td>SAXS</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td> ile manipülasyon gerçekleştiren <td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html programı https://www.pymol.org/</td> <td>görselleştirme yazılımı</td></tr><tr><td>SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>3D yapıları üst üste bindirmek için</td> <td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td> programı</tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic İkili Akış</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Biofrac Fraksiyon toplayıcı</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC sistemi</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim biyoteknoloji</td><td>BBI8535108</td><td></td></tr></tbody></table>

bir saxs beamline online boyut dışlama ve İyon değişim kromatografi

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biyolojik küçük açı X-ışını saçılması (BioSAXS) çözeltisi yapısı, parçacık boyutu ve şekli, ve makromoleküller yüzey-hacim oranı belirlemek üzere kullanılan moleküler ve yapısal biyoloji güçlü bir tekniktir. Tekniği vb konsantrasyonları, pH değerleri, iyonik güçlü, sıcaklıklar, katkı maddeleri, geniş bir yelpazede uzanan çözelti koşulları çok çeşitli uygulanabilir, ancak örneği, tek dağılımlı olması gerekmektedir. Bu ihtar SAXS ışın demetleri üzerinde sıvı kromatografisi sistemlerinin uygulanmasına yol açtı. Burada, bir ışın-hattı üzerinde boyut dışlama (SEC) ve iyon değişim kromatografisi (IEC) yukarı entegrasyonu tarif uygun geri çıkarma ve veri azaltılması için farklı yöntemler. Bir örnek olarak, bir D5N helikas tanım aşağıdakilerden oluşan, esas aşı virüsü proteini D5 parça üzerindeki sek- ve IEC SAXS kullanımı açıklanmıştır. Biz th heksamerik yapısını gösteren, genel şeklini ve moleküler ağırlığı belirlemekE proteini.

Modelsiz değişmeyen analizinin sonuçları Tablo 1 'de listelenmiştir. D5 323-785 SEC-SAXS verilerin analizi 338 kDa karşı 345 kDa (a poród analizinden) bir moleküler kütle tahmin gösterdi IEC SAXS kullanılarak gözlemlendi. Her ikisi de bir heksamer için 6 kez 53.5 kDa (321 kDa) beklenen kütle ile uyum içindedir. Her iki veri setinin ab initio modelleme hiçbir empoze simetri ile yapılmıştır (SEC-SAXS: χ 2 = 0.88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) ve C6 simetrisi kullanarak (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Her iki rekonstrüksiyon için yayılma verilerine genel uyan iki durumda (Şekil 1D ve E) karşılaştırılabilir olduğu için, C6 simetri varsayılabilir. Bu nedenle, bir model (SEC kısmen engellenmiş görünen bir merkezi kanal, bir altıgen koni benzeri bir yapı ile ilgilidir: Şekil 1F; IEC: Şekil 1H). Ortalamanın önce bireysel modellerin incelenmesi bu tıkanıklık ortalama sürecinin bir dışlayıcı olması muhtemel olduğunu göstermektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg"> Şekil 1: SAXS veri analizi ve karşılaştırma D5 323 -785 (şekil Kaynaklar 12 ve 18 uyarlanmıştır). D5 protein ve D5 323-785 A) şematik alan yapısı. B) Üç zirveleri göstergesi ile Çevrimdışı iyon değişim kromatogram. Turuncu eğrisi: 280 nm (au), mavi eğri de Absorbans: zirveleri tampon B tampon B. Yüzde yüzdesi belirtilir. C) Online iyon değişim kromatogram. B. olarak renk anahtarı Ayrıca, ölçülen yoğunluk, yeşil olarak gösterilir. Deneysel saçılma eğrisind SEC-SAXS D) ve IEC E) D5 323-785 veri analizi ile elde edilen modelin eğrisi hesaplanır. SEC veri ve G) IEC verilerine dayanarak D5 323-785 F) Boncuk modeli. SEC ve IEC modelleri H) Yerleşimi. F paneller) H) bir moleküler görüntüleme yazılımı 24 kullanılarak oluşturulmuştur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Veri toplama parametreleri </td><td></td></tr><tr><td> Enstrüman: </td><td> SDBY BM29 </td></tr><tr><td> Dalga boyu (A) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-aralık (Å -1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Örnek-dedektör mesafesi </td><td> 2,864 m </td></tr><tr><td> Pozlama süresi (sn) </td><td> kare başına 1 </td></tr><tr><td> konsantrasyon aralığı </td><td> na </td></tr><tr><td> Sıcaklık (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> detektör </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Akı (fotonlar / s) </td><td> 1 x 10 ila 12 </td></tr><tr><td> Işın boyutu (mikron 2) </td><td> 700 x 700 </td></tr><tr><td> D5 323-785, SEC için yapısal parametreleri </td><td></td></tr><tr><td> Ben 0 (cm-1) [guinier dan] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (A) [guinier dan] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> R g dk q - Guinier için kullanılan Qmax Rg </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> Dmax (a) [p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> p için kullanılan q-aralık (r) (Å -1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Poród hacmi V (p Å 3) [Scatter dan] </td><td> (570 ± 5) 10 3 × </td></tr><tr><td> Moleküler kütle M r (kDa) [V p itibaren] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> dizisinden monomerik Sn Hesaplanan (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> D5 323-785, IEC için yapısal parametreleri </td><td></td></tr><tr><td> Ben 0 (cm-1) [guinier dan] </td><td> 0.386 </td></tr><tr><td> Rg (A) [guinier dan] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> R g dk q - Guinier için kullanılan Qmax Rg </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> Dmax (a) [p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> p için kullanılan q-aralık (r) (Å -1) </td><td> 0,03-0,18 </td></tr><tr><td> Poród hacmi V (p &amp; #197; 3) [Scatter dan] </td><td> (577 ± 5) 10 3 × </td></tr><tr><td> Moleküler kütle M r (kDa) [V p itibaren] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> dizisinden heksamerik Sn Hesaplanan (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: SAXS veri parametreleri. tablo SAXS veri toplama ve analiz parametrelerini özetlemektedir.

Küçük açılı X-ışını yayma (SAXS) bir protein çözeltisi yapısının belirlenmesi tek dağılımlı örnekleri gerektirir. Burada, örnek hazırlama ile veri kazanımı arasında en az gecikme sağlamak için iki seçenek sunmak: Online boyut dışlama kromatografisi (SEC), çevrimiçi iyon değiştirme kromatografisi (IEC).

Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Küçük açılı x-ışını saçılma huzme hatlarında çevrimiçi boyut dışlama ve iyon değişim kromatografisinin uygulanmasının genel amacı, numune hazırlama ve veri toplama arasında minimum gecikme sağlayarak daha iyi kalitede, düşük çözünürlüklü model verileri elde etmektir. Bu yöntemler, yapısal biyoloji alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Yarıçap işlemi gibi, en büyük belirli içi mesafe, parçacık şekli, katlanma denatürasyonu veya bozukluğunun derecesi.SAXS, molar dağınık numuneler gerektirir. Bu tekniğin temel avantajı, saflaştırma ile ölçüm arasındaki sürenin kısa olması ve numune denatürasyonunu veya advikasyonunu önlemeye yardımcı olmasıdır. Işın hattı tesisine gitmeden önce, daha önce yayınlanmış yöntemleri kullanarak konsantre bir numune hazırlayın ve SEC test çalıştırmaları gerçekleştirin.Işın hattı tesisinde, 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne bir mililitre jel filtrasyon tamponu yerleştirin. Ardından, jel filtrasyon tamponu şişesini, SAXS kurulumunun akış kılcal damarı ile aynı hizada bir HPLC sistemine bağlayın. Akış hızını, maksimum kolon basıncını ve çekim süresini ayarlayın.Sütun olmadan geri basınca dikkat edin. Çizgileri temizleyin ve ardından boyut dışlama kromotografisi sütununu bağlayın ve dengeleyin. Bir mililitrelik tampon numunesini numune değiştiriciye yükleyin.Deney kulübesinden çıkın ve emniyete alın veya içini kilitleyin, ardından numune değiştirici modunda ışın hattı kontrol yazılımında oturum açın. Numune değiştiricideki tampon numunesini doğrudan SAXS akış geçişli kılcal damardan gönderin. Kısa bir SAXS test çalıştırması gerçekleştirin ve ses x-ışını saçılma yoğunluğunun radyasyon hasarı belirtisi göstermediğini kontrol edin.Işın hattı kontrol sistemini HPLC moduna geçirin ve tam HPLC SAXS sistemi aracılığıyla bir SAXS arabellek test çalıştırması gerçekleştirin. Veriler ilk ölçümle eşleşmezse, yeniden dengeleyin ve başka bir test çalıştırması gerçekleştirin. Daha sonra, laboratuvarda, agregaları çıkarmak için protein örneğini 10 dakika boyunca 13.000 kez G'de santrifüjleyin.Süpernatanı HPLC uyumlu bir cam şişeye aktarın. Numune konumuna dikkat ederek şişeyi otomatik numune alma cihazına yükleyin. Kafesi kilitleyin ve ışın hattı kontrol sistemindeki deney verileri için bir klasör oluşturun.Ardından, HPLC yazılımında hızlı toplu işe tıklayın. Dosya yolunu ayarlayın ve UV Vis verilerinin otomatik ascii dönüşümünü etkinleştirin. Otomatik örnekleyiciye enjeksiyon hacmini ve numune konumunu girin.Çalıştırmayı kuyruğa eklemek için başlat'a tıklayın. Dosya adını girin, ancak henüz kaydet'i tıklamayın. Işın hattı kontrol yazılımında, SAXS veri toplama süresi HPLC toplama süresinden biraz daha uzun olacak şekilde veri çerçevelerinin sayısını ayarlayın.Işın hattı deklanşörünü açın ve SAXS veri toplamaya başlayın. HPLC yazılımına geçin ve örneği enjekte etmek için kaydet'e tıklayın. UV Vis veri toplamanın başlangıcındaki kare numarasını not edin ve zaman içinde toplanan yoğunluğu izleyin.Numune hazırlama sırasında, 25 milimolar ila bir molar arasında doğrusal bir sodyum klorür gradyanı ile bir IEC test çalıştırması gerçekleştirin. İlgilenilen her tepe noktası için, mobil fazda karşılık gelen yüksek tuz tamponu B miktarını belirleyin. IEC SAXS deneyine başlamak için, A ve B tamponlarının bir mililitrelik örneklerini bir kenara koyun ve ardından tamponları HPLC sistemine bağlayın.HPLC parametrelerini ayarlayın ve ardından sistemi temizleyin ve hatları düşük tuzlu tampon A. İyon değişim kolonunu tampon ile bağlayın ve dengeleyin A. A ve B tamponlarının bir mililitre örneklerini örnek değiştiriciye yükleyin. Kafesi kilitleyin ve tamponun radyasyon hasarına duyarlılığını kontrol etmek için numune değiştirici modunda her tampon numunesi için kısa bir SAXS test çalıştırması gerçekleştirin. Ardından, HPLC moduna geçin ve arabellek A için başka bir SAXS test çalıştırması gerçekleştirin. Saçılma modellerini örnek değiştirici test çalışmasından elde edilenlerle karşılaştırın.Ardından, deneme verileri için bir klasör oluşturun. Ardından, yüzde sıfır yüksek tuz tamponu B ile başlayan ve yüzde 100 tampon B'ye ulaşmak için iki sütun hacminin aralıklarla yüzde beşini artıran adım adım HPLC gradyanı tasarlayın. Işın hattı deklanşörünü açın, SAXS veri toplamayı başlatın ve HPLC çalışmasını başlatın.UV Vis veri toplama başladığında geçen kare sayısına dikkat edin. Veri toplandıktan sonra, toplanan yoğunluğun en az 100 kare boyunca sabit kaldığını ve A ve B tamponlarının örneklerinden elde edilen değerlerle eşleştiğini kontrol edin.Ardından, yüzde sıfır tampon B'den başlayarak başka bir adım bilge gradyan HPLC yöntemi yapın. Bu değerlerin her birinin yüzde bir puan altına ve 1,5 puan üstüne gradyan adımları ekleyin.Her adım aralığını 2,5 sütun hacmine ve gradyandaki son adımı yüzde 100'e ayarlayın B. Tampon A'nın bileşimini elde etmek için süpernatanı gerektiği gibi seyreltin. HPLC pompalarını durdurun, kolon borusunu dedektörlerden ayırın ve kolon akışını toplamak için hattın ucunu bir kaba yerleştirin. Ardından, tampon A hattını seyreltilmiş numuneye aktarın ve tüpte hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun. Numuneyi kolona çekmek için pompaları çalıştırın.Numune kabı neredeyse boşaldığında, pompaları durdurun ve tampon A şişesini tekrar hatta koyun. Pompaları çalıştırın ve iki kolon hacmi için tampon A'yı kolondan geçirin, ardından pompaları durdurun ve kolonu dedektörlere yeniden bağlayın. Yeni adım adım bilge yöntemi kullanarak, otomatik numune enjeksiyonu olmadan tek bir HPLC çalıştırması ayarlayın.Işın hattı deklanşörünü açın ve SAXS ve UV Vis verilerini alın. Zaman içinde toplanan yoğunluğu izleyin. Ardından, HPLC verilerini bir ascii formatına dönüştürmek için son işleme yazılımını kullanın.Çevrimiçi bir veri yöneticisi kullanarak, numune elüsyon tepe noktasına karşılık gelen SAXS çerçevelerini tanımlayın. Bağlanma yarıçapının tepe boyunca sabit olduğunu doğrulayın. Tepe çerçevelerini bir SAXS veri işleme programına aktarın ve ortalama düzeltilmemiş bir saçılma eğrisi oluşturun.SCC SAXS için, yalnızca düzeltilmemiş saçılma eğrisinin değil, ortalama arabelleğin yüksek Q bölgesinin de olduğunu onaylayın. Otomatik çıkarılan kareleri tepe noktasından yükleyin ve ölçeklendirin ve sistematik farklılıklar olmadığını kontrol edin. Son SAXS eğrisini elde etmek için tüm eğrilerin ortalamasını alın.IEC SAXS için, her gradyan adımından ortalama 50 kare. Bu ortalamaları düzeltilmemiş eğri ile karşılaştırın ve en iyi yüksek Q eşleşmesine sahip gradyan adımını seçin. Son SAXS eğrisini oluşturmak için seçilen ortalamayı düzeltilmemiş eğriden çıkarın.Son olarak, çift mesafe dağılımını belirleyin ve proteinin en temsili modelini belirlemek için ab initio modelleme yapın. D5 proteininin SEC ve IEC SAXS'ından elde edilen yapısal veri parametreleri çok benzerdi. Moleküler kütle tahminlerinin her ikisi de tahmin edilen kütle ile uyumluydu.Ab initio modelleme, empoze edilmiş simetri olmadan ve C6 simetrisi ile gerçekleştirildi. Her iki model de deney verileriyle uyumludur, bu da protein yapısının C6 simetrisine sahip olduğunu gösterir. Moleküler modelleme, kısmen tıkalı bir merkezi kanala sahip hekzogonal piramit benzeri bir yapı verir.Ortalama SEC ve IEC modelleri çok benzerdi. Bireysel modeller incelendiğinde, kanal tıkanıklıklarının ortalama alma işleminin bir eseri olabileceği bulundu. SAXS makul ve daha standart hale geliyor, ancak agregalardan veya kirleticilerden kurtulmak için gereken birçok saflaştırma ve diğer iyon değişimi kromotografi adımları için.Bu protokolde her iki tekniği, çevrimiçi boyut dışlama kromotografisini ve bir bio SAXS ışın hattı üzerinde çevrimiçi iyon değişim kromotografisini sunduk. Her iki tekniğin de bir uyarısı, kesin protein konsantrasyonunun bilinmemesidir, bu nedenle moleküler kütle saçılımını belirleyemeyiz. Bununla birlikte, küresel proteinler için hala kütle hacmini tahmin edebiliriz.Burada iyon değişim kromotografisinde kullandığımız kademeli gradyan yerine doğrusal bir gradyan uygulanabilir, ancak bu, tepe noktalarının optimal bir şekilde ayrılması için tampon koşulunun optimizasyonunu gerektirir. Bu teknikler, karmaşık sistemlerde bile kaliteli SAXS verileri toplamamızı sağlar.

online-size-exclusion-ion-exchange-chromatography-on-saxs

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, böcek hücresi protein lizatından rekombinant proteini izole etmek için katyon değişim kromatografisi tekniğini göstermektedir.

Katyon Değişim Kromatografisi: Net Yüzey Yüküne Dayalı Olarak Böcek Hücresi Lizatından Hedef Rekombinant Proteini İzole Etme Tekniği

Bu videoda, boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve çok açılı ışık saçılımı (MALS) yeteneklerinden yararlanan SEC-MALS açıklanmaktadır. SEC-MALS'de SEC, proteinleri veya protein komplekslerini boyutlarına göre ayırır ve MALS dedektörü, molekül tarafından farklı açılarda saçılan ışığın yoğunluğunu ölçerek ortalama moleküler ağırlığı belirler.

Protein Oligomerleri için Çok Açılı Işık Saçılımlı Boyut Dışlama Kromatografisi

Endojen peptidler insan beyin-omurilik sıvısı (bos) kitle spektrometrik analizi için bir yöntem sunulur. Moleküler ağırlık kesme filtrasyon, Kromatografik ön ayırma, kitle spektrometrik analizi ve peptid kimlik stratejileri sonraki bir arada istihdam ederek, yaklaşık on göre bilinen CSF peptidome genişletmek olası Önceki çalışmalar için.

İnsan serebrospinal sıvı Endopeptidomic analiz için numune hazırlama

Burada, otomatik tarama ve veri toplama seçenekleri kullanılabilir bazı sinkrotron beamlines nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bilim adamları göndermek cryocooled örnekleri sinkrotron için ve kırınım özellikleri ekranlı, veri kümeleri toplanan ve işlenmiş ve, mümkün olan yerlerde, bir yapı çözüm yürütülen — tüm insan müdahalesi olmadan.

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

Bu iletişim kuralı bir doğru molar kütle tespiti için protein, protein kompleksleri ve peptidler türdeş olmayan bir örnek yüksek özgüllük iyon değiştirme Kromatografi çok açılı ışık saçılma ile kullanımını açıklar. Bu yöntem kalite değerlendirmesi için de yerli reaksiyonlar, ücret türevleri ve karışık-protein örnekleri karakterizasyonu gelince değerlidir.

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Biyolojik makromoleküllerin SEC-BioSAXS ölçümleri makromoleküllerin ve komplekslerinin çözelti yapısını belirlemek için standart bir yaklaşımdır. Burada, sec-BioSAXS verilerini, tamamen çözülmüş ve kısmen çözülmüş zirvelere sahip, sık karşılaşılan iki tür SEC izlerinden analiz ediyoruz. Biz dağılım ve BioXTAS RAW kullanarak analiz ve dekonvolution göstermek.

EFA deconvolution ve Scatter ile SEC-SAXS verilerinin analizi

Burada, uzun dalga boyu makromoleküler X-ışını kristalografi deneyleri için Diamond Light Source'daki I23 kiriş hattında kriyojenik numune hazırlama ve kristallerin vakum endstationına aktarılması için bir protokol sunuyoruz.

Diamond Light Source'daki Beamline I23'te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Öğrenin SAXS deneylerinde online SEC ve IEC kullanarak yapısal biyoloji verilerinin kalitesini nasıl artırabilirsiniz. Bu yöntemler protein yapısı ve dinamikleri analizinde güvenilir sonuçlar sağlar.

Bir SAXS beamline Online Boyut dışlama ve İyon değişim Kromatografi

Daha fazla video keşfet