Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Aşağıdaki deneylerin amacı, transmisyon elektron mikroskobunda görselleştirme için süspansiyon hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyon çalışmaları için bir araç önermektir. Bu tekniğin kullanımı kolaydır, düşük maliyetlidir ve hücresel yapının mükemmel bir şekilde korunmasını sağlar. Bu bir süspansiyon hücresi kültürüdür.

İlk olarak, hücreler, bir mikrosantrifüj tüpünde bir pelet elde etmek için farklı santrifüjlerle hasat edilir. İkinci adımda, numune, hücreleri hareketsiz hale getiren ve buz kristallerinin oluşumunu sınırlayan daldırmalı dondurma ile hızlı bir şekilde dondurulur. Daha sonra, hücre yapılarını stabilize etmek için suyun fiksatif olarak osmiyum tetroksit içeren çözücü ile değiştirilmesi için donma ikamesi gerçekleştirilir.

Sonuçlar, daldırmalı dondurma ve donma ikamesinin, hücrelerin altyapısını mükemmel bir şekilde koruduğunu göstermektedir. Kimyasal fiksasyon, transmisyon elektron mikroskobu için doku veya hücrelerin sabitlenmesi için birincil yöntemdi, ancak bu yöntemle, hücresel içeriğin artefaktları ve ekstraksiyonu genellikle gözlenir. Kimyasal fiksasyona bir alternatif kriyofiksasyondur.

Bu yöntem, ince reçine bölümlerinde en yüksek kalitede morfoloji üretmek için en iyi seçimi temsil eder. Daldırmalı dondurma, geleneksel kimyasal fiksasyonun neden olduğu hasarı önlemek için hücredeki molekülleri anında hareketsiz hale getiren bir kriyofiksasyon tekniğidir. Numuneyi daldırarak dondurmadan önce, dondurma için destek olarak kullanılmak üzere Formvar film ile kesilmiş ızgara hazırlanmalıdır.

Cam slaytı tüy bırakmayan bir bezle parlak olana kadar cilalayın ve silerek temizleyin. Cam slaytı birkaç saniye kloroformda% 0.3 Formvar çözeltisine batırın ve bir beherde dik olarak kurumaya bırakın. Manipülasyon, kloroformun varlığından dolayı kişisel koruyucu ekipman kullanılarak bir davlumbaz altında gerçekleştirilmelidir.

Bir kristalizatörü damıtılmış suyla doldurduktan sonra, tozu temizlemek için su yüzeyinin üzerinden bir cam çubuk geçirin. Film kuruduğunda, filmin kalkabilmesi için kenarları keskin bir tıraş bıçağıyla çizin. Film üzerinde bir su buharı tabakası elde etmek için slaytın üzerine yoğun bir şekilde nefes vererek slaytı dondurun.

Su yüzeyine yaklaşık 30 derecelik bir açıyla sürgünün altına dokunarak filmi hemen su yüzeyine yüzdürün. Slaytı yavaşça banyoya indirin ve filmi gerektiği gibi çıkarın. Formvar filmi su yüzeyine yavaşça yerleşir.

Filmi cımbız kullanarak kristalizatörün kenarına yapıştırın. 400 gözenekli bakır ızgaraları, uygun kalınlıkta ve kırışıksız bölgelerde filmin üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde nazikçe yerleştirin. Izgaralı film, su yüzeyinde yüzerken üzerleri Joseph kağıdı ile kaplanarak alınır.

Joseph kağıdının kenarını kaldırın ve ızgaralı film onunla birlikte gelmelidir. Parmaklarınızın su yüzeyine temas etmesine izin vermeyin, aksi takdirde suda bir film bırakma riskiyle karşı karşıya kalırsınız. Izgaraları kullanmadan önce birkaç saat kurumasını bekleyin.

Ultrastrüktürel çalışmalar için, osmiyum tetroksit ampulünü bir cam şişeye koyun. Ampulü kırmak için şişeyi iyice çalkalayın. % 4'lük bir nihai konsantrasyona sahip olmak için% 100 uygun hacimde aseton ekleyin% Donma ikame ortamını içeren şişeyi karıştırın ve 1.5 mililitre alikotları plastik transfer pipeti ile kriyoviyallere dağıtın.

Kullanmadan önce tüm kapakları kapatın ve eksi 84 derecede dondurucuda saklayın. Protein immünoetiketleme çalışmaları için, asetonda uranil asetatın% 0.1'ini hazırlayın. Çözelti berraklaştığında, 0.2 mikrometre filtre kullanarak süzün ve 1.5 mililitre alikotları kriyoviyallere dağıtın.

Kullanmadan önce eksi 84 derecede dondurucuda saklayın. Farklı hücre tiplerinden uygun pelet kıvamına sahip olduğundan emin olmak için, ham maya hücrelerini en az tam sıvı ortamda 10 ila dokuz hücre elde etmek için koyun. Escherichia coli, beş 10 ila 10 bakteri hücresi elde etmek için DTY ortamında.

ortamında Leishmania flagellum ve SDM79 ortamında Trypanosoma brucei, sekiz parazit hücresine beş 10 elde etmek için. Süspansiyon hücreleri içeren kültür ortamını 50 mililitrelik bir propilen tüpe aktarın ve 1.500 g'da üç dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti ilgili hücre kültürü ortamının bir mililitresinde yeniden süspanse edin.

3.900 g'da bir dakika boyunca bir mikrosantrifüj tüpünde santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen çıkarın. Daldırmalı dondurma yöntemi için, propan silindirine bağlı bir tüpe sahip propan şişesi kullanılmalıdır.

Propan potansiyel olarak patlayıcı olduğundan, sıvılaşmayı iyi havalandırılan bir odada veya davlumbazda gerçekleştirin. Açık aleve izin verilmez. Sıvı nitrojen kullanılırken kriyoeldiven de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman her zaman giyilmelidir.

Polistiren tepsiye az miktarda sıvı nitrojen koyun. Pirinç kabı sıvı nitrojen içine yerleştirin. Baloncuklar belirir.

Baloncuklar azalana kadar bekleyin. Pirinç kap daha sonra dondurulur. Propan silindirine bağlı tüpü pirinç kapak duvarı ile temas ettirin.

Propan silindir valfini yavaşça açın. Propan sıvılaşmaya başlamadığı için çok fazla duman oluşur. Propan sıvılaşmaya başladığında duman kaybolur.

Propan silindiri valfini kapatarak ve propan silindirine bağlı tüpü hızla çıkararak sıvılaşmayı durdurun. Polistiren tepsiyi, pirinç kabın üstünden beş milimetreye kadar sıvı nitrojen ile doldurun. Numuneyi dondurduktan sonra değiştireceğimiz küçük pirinç kapları sıvı nitrojen içine koyarak dondurun.

Bir örnek için bir bardak koyun. Numuneleri karıştırmamaya dikkat edin. Peletin uygun kıvamını elde etmek için, daha önce belirtilen kültür koşullarına ve santrifüjleme parametrelerine uymak yeterlidir.

Kullanmadan önce cımbızları dondurun. Formvar ile kesilmiş 400 gözenekli bir bakır mikroskopi ızgarası alın. Peletin içine çift kenarlı bir diseksiyon iğnesi batırın.

Aleti kullanarak ızgaraya bir damla pelet koyun. Izgarayı çok hızlı bir şekilde sıvı propan içine daldırın ve birkaç saniye karıştırın. Donmuş ızgarayı küçük pirinç bardağa hızla aktarın.

Her örnek için en az üç ızgara yapın. Bir ızgara almadan önce cımbızı dondurmayı unutmayın. Kullanmadan önce cımbızları dondurun.

Bardağı hızla çıkarın ve donmuş ızgaraları cımbız kullanarak kriyoviyal içine aktarın. Kapağı kriyoviyalin üzerine geri koyun. Her numunenin her ızgarası için işlemi tekrarlayın.

Kapakları kapatın ve numunelerin donma ikame ortamında olduğundan emin olmak için kriyoviyal karıştırın. Kriyoviyalleri eksi 84 derece dondurucuda üç gün bekletin. Eksi 30 derecelik dondurucuya ani bir sıcaklık artışını önlemek için kriyovialleri polistiren bir tepside taşıyın.

Eksi 30 derecede bir saat bekletin. Kriyoviyalleri iki saat boyunca eksi 15 derecede taşıyın, ardından numuneleri iki saat boyunca dört derecede ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Plastik transfer pipetleri kullanarak dondurma ikame ortamını çıkarın ve açıkça tanımlanmış uygun bir atık şişesine koyun.

Yaklaşık 500 mikrolitre% 100 aseton koyun. Cam şişeyi açın ve kriyoviali karıştırın ve dondurma ikame ortamını hızla bir cam şişeye koyun. Bir kriyoviyal% 100 aseton ile durulayın.

% 100 aseton ile üç kez 10 dakika durulayın. Eksi 30 derecelik dondurucuya ani bir sıcaklık artışını önlemek için kriyovialleri polistiren bir tepside taşıyın. Eksi 30 derecede iki saat bekletin.

Numuneleri bir polipropilen şişeye koyduktan sonra, dondurma ikame ortamını taze dondurma ikame ortamı ile değiştirin ve eksi 30 derecede iki saat bekleyin. % 100 aseton ile bir saat ve % 100 etanol ile üç kez bir saat durulayın. Daldırmalı dondurma/dondurma ikame yöntemi, süspansiyon hücrelerinin hücre içi yapılarının mükemmel bir şekilde korunmasına neden olmuştur.

Saccharomyces cerevisiae'de yapılar küçülmez ve sitoplazma yoğun görünür. Dahası, membranlar pürüzsüzdür, bu da iyi bir korumanın kanıtıdır. Çekirdek, mitokondri ve vakuoller gibi tüm organeller mükemmel bir şekilde tanımlanabilir.

Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei ve Escherichia coli'de de mükemmel koruma gözlenir. Çekirdekte, nükleer zarfı oluşturan çift zar, nükleer gözenek, iğ kutbu gövdesi ve nükleer zarfın dış zarına bağlı ribozomlar belirgin bir şekilde görülebilir. Mitokondride, cristae adı verilen iç zar istilaları açıkça görülebilir.

Kritik organeller vakuollerdir, çünkü büyük buz kristalleri kolayca gelişebilir. Görüntüde, vakuoller buz kristali hasarı olmadan mükemmel bir şekilde korunmuştur. Daldırmalı dondurma/dondurarak ikame yöntemi, protein immünolokalizasyonunu gerçekleştirmek için de kullanılabilir.

Prosedür mükemmel protein antijenisitesini korur ve daha önce de belirtildiği gibi, organeller açıkça tanımlanır. Anti-ATP sentaz ve anti-porin gibi mayadaki farklı proteinleri hedeflemek için farklı antikorlar zaten test edilmiştir. Bu tür bir deney, flabarin proteininin lokalize olduğu Leishmania'da olduğu gibi farklı deney sistemleri için de mümkündür.

Bu videoyu izledikten sonra, transmisyon elektron mikroskobunda görselleştirmek için daldırmalı dondurma/dondurarak ikame yöntemiyle numunelerin nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik hızlı, kullanımı kolay, düşük maliyetlidir ve hücre altyapılarının mükemmel bir şekilde korunmasını sağlar. Sıvı nitrojene, özellikle de osmiyum tetroksit ve uranil asetat ile dikkatli olun.

Laboratuvar önlüğü ve eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyilirken çeker ocakta tutulmalıdırlar.