Name: Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 35 s
Description: Öğrenin, süspansiyon hücrelerinin transmisyon elektron mikroskobu görüntülemesi için dalma donma ve donma ikamesi yöntemini. Bu düşük maliyetli teknik, hücre yapılarının mükemmel korunmasını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz el yazması üzerine yardım ve yorumlar için M. Bouchecareilh E. Tétaud S. Duvezin-CAUBET, ve A. Devin şükranlarımızı sunuyoruz. Biz görüntüleri alındı ​​Bordo Görüntüleme Merkezi&#39;nin elektronik görüntüleme kutbuna müteşekkiriz. Bu çalışma Centre National de la Recherche Scientifique tarafından desteklendi.

Formvar Izgara Film hazırlanması 1. NOT: Kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuvar önlüğü, gözlük) kullanılarak davlumbaz altında kloroform manipülasyon gerçekleştirin. 400 göz elektron mikroskopisi bakır ızgaralar kullanın. Diğer grid türleri (diğer örgü boyutları, altın, nikel ızgaraları) ile, dondurma işleminin kalitesi kötüdür. <ol><li> kloroform içinde% 0.3 formvar 100 mL&#39;lik bir çözelti hazırlayın. o ajitasyon olmadan gecede çözülmeye bırakın. </li><li> 400 mesh elektron microscopycopper ızgaraları (çap 3.05 mm) bir cam şişede (yüksekliği 3 cm ve çapı 2 cm) aseton içeren (inç kare başına delik sayısı) koyun. elin dairesel bir hareketi ile bir cam şişe karıştırın. Plastik bir transfer pipet yardımıyla aseton çıkarın. Çözücü, 5 dakika için buharlaşmasına izin verin. bir filtre kağıdı üzerine onları dökülerek ızgaraları transferi ve bunları 5 dakika boyunca kurumaya bırakılır. </li><li> Kaygan / parlak kadar tüysüz bir bez ile silerek bir 76 x 26 mm2 bir cam slayt parlatmak.</li><li> Bir kristalleştirici (çap 15 cm, yükseklik: 7 cm kapasitesi 1200 mL) almak ve damıtılmış su ile ağzına kadar doldurun. tozu gidermek için iki kez yüzeyi üzerinde bir cam çubuk geçirerek su yüzeyini temizleyin. </li><li> iki parmak arasındaki cam slayt tutun ve birkaç saniye formvar çözeltide daldırın. o dik 5 dakika boyunca baş aşağı beher altında kurumaya tutun. </li><li> Şerit, kuru bir olduğunda, filmin sınırları slayt yerinden oynamasına tanımlamak için keskin bir tıraş bıçağı ile bir cam slayt kenarlarını skoru. </li><li> Derin bir nefes alın ve üzerine ve biraz opak filmi işlemek ve görünürlüğünü artırmak için filmin altında su buharı bir katman almak için slayt üzerine ağır nefes verin. <ol><li> Hemen yaklaşık 30 ° &#39;lik bir açı ile sürgünün alt dokunarak kristalleştirici su yüzeyi üzerine filmin yüzer. slayt filmin serbest olsun ve kristalleştirici su yüzeyi üzerine soyulabilir. Yavaşça ile filmi çekipcımbız, gerekirse. </li></ol></li><li> Yavaşça ızgaraları uygun kalınlıkta (yaklaşık 10 nm) ve kırışıklık olmadan vardır bölgelerde su yüzeyinde yüzen film üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin. </li><li> Bunlar kristalleştirici su yüzeyinde yüzecek Joseph kağıt ızgaraları kaplayarak filmi al. <ol><li> tek elle Yusuf kağıdı tutarak, filmin bir ucuna Yusuf kağıdın bir ucunu dokunun. Joseph kağıt tamamen ıslak kadar bekleyin. takılıp ızgaraları ile Yusuf kağıdı çıkarın. </li></ol></li><li> son kurutma ve oda sıcaklığında kullanılmadan önce depolama için kapalı bir Petri tabağına 24 saat ızgaraları yerleştirin. </li></ol> Donma-ikame Orta 2. Hazırlık Not: Osmiyum tetroksit (OsO 4) ve uranil asetat tehlikeli kimyasal maddelerdir. Bir laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyerek çeker ocakta bunları işleyin. follkullanım için güvenlik önleminin (OsO 4) ve uranil asetat ow. OSO 4 sızmasını önlemek için O-halkası cryovials kullanın. <ol><li> ultrastrüktürel çalışmalar <ol><li> Bir cam şişeye cam OsO 4 ampul koyun. </li><li> şişeyi sallayarak ampulü kırın. </li><li> % 4 nihai konsantrasyon elde etmek üzere aseton uygun bir hacim,% 100&#39;e ekleyin. </li><li> Karıştırın ve 1.8 mL cryovials içine 1.5 ml alikotları akıtın. </li></ol></li><li> Protein ile immün <ol><li> bir cam şişeye uranil asetat 0.05 g yerleştirin. </li><li> % 100 aseton, 50 ml ilave edilir. </li><li> Manyetik bir karıştırıcı ile çözelti ilave edin. Çözelti berraklaştığında, bir 0.2 mikron filtre kullanılarak filtre. </li><li> 1.8 mL cryovials içine 1.5 ml alikotları koyun. Not: dalma dondurma işleminden önce dondurularak ikame ortamı içeren cryovials hazırlayın ve -84 ° C&#39;de derin dondurucuda muhafaza edin. atmak cam şişeyi ters çevirinTehlikeli atık OsO 4 ampul. </li></ol></li></ol> Hücrelerin 3. hazırlanması NOT: Bu adım yönteminin başarısı için kritik öneme sahiptir. tüm hücre türlerinde, hücrelerin belirtilen sayıda elde etmek için hücreleri büyür. Belirtilen zaman ve hızda belirtilen tüp içinde santrifüje. <ol><li> aşağıdaki gibi farklı hücre tipleri ile ilgili topakların uygun bir kıvam elde etmek için, hücreleri büyütmek: <ol><li> Saccharomyces cerevisiae ve Schizosaccharomyces pombe için, en az ya da tam sıvı ortam 5 ml maya inoküle. 28 ° C, döndürme (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültür, 600 nm&#39;de (OD600) &#39;deki optik yoğunluk ölçülür. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 maya hücrelerinin seyreltin. 1 x 10 9 maya hücreleri 7 elde etmek üzere, döndürme, 28 ° C&#39;de inkübe hücreleri devam edin. </li><li> Leishmania kamçıda için, yaşlılık% 7.5 FCS (inek fetus serumu) ile 5 ml AM ortamında culate parazitleri. 24 ° C&#39;de döner (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültüre göre OD 600 ölçün. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 parazit hücreleri seyreltin. 5 x 10 8 parazit hücreleri 12 elde etmek üzere, döndürme, 24 ° C&#39;de hücreler inkübe devam edin. </li><li> Trypanosoma brucei için,% 10 FCS ve 30 | ig / ml higromisin ile SDM-79 ortamı, 5 mL parazitleri inoküle. 27 ° C, döndürme (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültüre göre OD 600 ölçün. 50 ml taze seçici ortam içinde 0.2&#39;lik bir OD600&#39;e parazit hücreleri seyreltin. 5 x 10 8 parazit hücreleri 13 elde etmek üzere, döndürme, 27 ° C&#39;de hücreler inkübe devam edin. </li><li> Escherichia coli, 100 ug / ml ampisilin ile DYT ortamı 5 ml bakteri inoküle. (Dönen, 37 ° C&#39;de gece boyunca 180 inküberpm). Gece boyunca kültüre göre OD 600 ölçün. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 bakteri hücreleri seyreltin. 5 x 10 10 bakteri hücreleri 14 elde etmek üzere, döndürme, 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri devam edin. Not: bir gece boyunca inkübe edildikten sonra, kültür içindeki hücreler, ya logaritmik veya sabit büyüme fazında olabilir. deney yoluyla belirlenen şekilde çok yavaş büyüyen hücre suşları, bir gece, veya bir hücre, daha fazla sayıda aşılanması daha inkübasyon kat daha gerektirebilir. </li></ol></li><li> Tüm hücre tipleri için 1.500 x g&#39;de 3 dakika boyunca 50 ml&#39;lik bir polipropilen tüpü ve santrifüj hücreleri ihtiva eden kültür ortamı aktarın. </li><li> Süpernatantı ve ilgili hücre kültürü ortamı, 1 ml tüm hücre tipleri pelletini. </li><li> Santrifüj 3,900 x g, 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüj tüpü içinde, tüm hücre tipleri. Tamamen süpernatant kaldırmak. </li><li> hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol> Not: dikkatle sıvı azot tutun. cryogloves ve googles dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanın. Propan potansiyel olarak patlayıcı, yani iyi havalandırılmış bir odada veya davlumbaz altında sıvılaşma gerçekleştirin. Hiçbir açık alevler izin verilir. <ol><li> bir polistiren tepsisine sıvı azot, yaklaşık 150 mL koyun. dondurmadan önce sıvı azot içinde bir pirinç fincan (yükseklik 3.6 cm, çap 2 cm, kalınlığı 1.5 mm) yerleştirin. Sıvı azot pirinç fincan nüfuz etmesine izin vermeyin. </li><li> kabarcıklar pirinç kâse soğuk olduğundan emin olmak için geçene kadar bekleyin. </li><li> pirinç kabı duvarı ile temas halinde propan silindire bağlı hortumu koyun. </li><li> Yavaşça propan silindir valfini açmak. NOT: Bu adımda, propan pirinç fincan sıvılaşır. </li><li> propan silindir valfinin kapatılmasına ve, hızla gaz hortumu kaldırarak sıvılaşma durdurun. </li><li> Sıvı ni polistiren kabınıpirinç fincan üstten 5 mm&#39;ye kadar Trogen. Sıvı azot pirinç fincan nüfuz etmesine izin vermeyin. </li></ol> Örnek 5. Dalma Donma <ol><li> polistiren tepsisine sıvı azot, yaklaşık 200 mL koyun. sıvı nitrojen içinde koyarak çok az pirinç bardak (yükseklik 1.5 cm çapında 2.5 cm; 1 mm kalınlık) dondurun. bir süspansiyon hücre örneği için bir fincan koyun. numuneleri karıştırmak için dikkatli olun. Bu amaçla, vb kap 2, içinde, kap 1 &#39;de örnek 2 örnek 1 koydu. </li><li> sıvı nitrojen içinde kendi uç saplayarak cımbız dondurun. </li><li> 3.5 &#39;de elde edilen pelet bir çift kenar kesme iğne dalma. </li><li> cımbız kullanarak, bölüm 1&#39;de hazırlanan formvar ile kaplanmış bir 400 ağ gözü, bakır mikroskopi ızgara alır. </li><li> diseksiyon iğnesi kullanılarak, ızgara üzerinde 3.5 &#39;de elde edilen pelet bir damla yerleştirin. Farklı damla boyutları (örneğin 2, 5 ve 10 mcL) deneyin. </li><li> Çok hızlı bir şekilde sıvı propan genine cımbız tarafından tutulan kılavuz dalmabölümünde 4 puan ve birkaç saniye süre ile dairesel bir hareket ile kılavuz karıştırın. </li><li> Hızla bölüm 5.1&#39;de dondurulmuş küçük pirinç kabına cımbız ile dondurulmuş ızgara aktarın. NOT: Her numune için, en az 3 ızgara oluşturmak. Her zaman bir bakır ızgara yapmadan önce cımbız dondurun. </li></ol> 6. dondur-ikame Not: Osmiyum tetroksit potansiyel olarak uçucu, yani buhar kartuşları olan bir hava temizleyici solunum cihazı kullanın. Dalma dondurma önce sıvı nitrojen içerisinde fiksatif Donma da bir çözeltidir. <ol><li> ince yapısı çalışmaları için, bölüm 2.1&#39;de hazırlanan dondurma-ikame ortamı içeren 1.8 mL dondurarak saklamaya uygun vialler tüpler açın. immüno çalışmaları için, bölüm 2.2&#39;de hazırlanan dondurma-ikame ortamı içeren 1.8 mL dondurarak saklamaya uygun vialler tüpler açın. cryovials kapağını yerleştirin. </li><li> sıvı nitrojen içinde kendi uç saplayarak cımbız dondurun. </li><li> Hızla kapağı çıkarın ve dondurulmuş ızgaraları i aktarmakcımbız kullanarak cryovials nto. </li><li> geri cryovials başlığını takın. </li><li> Her numunenin her grid için tekrar edin. </li><li> Numuneler dondurularak ikame ortamında sağlamak için el bir dairesel hareket ile cryovials tüm kapaklar kapatın ve karıştırın. </li><li> Dondurarak ikame işlemi sırasında -84 ° C dondurucu içinde 3 gün boyunca hava geçirmez bir kutuya cryovials yerleştirin. </li></ol> 7. Örnek Isınma <ol><li> İnce çalışmaları <ol><li> bir polistiren tepsisine cryovials Taşıma bir -30 ° C dondurucu (ani sıcaklık artışı önlemek için). 1 saat boyunca -30 ° C&#39;de derin dondurucuda yerleştirin. </li><li> 2 saat boyunca -15 ° C dondurucuda cryovials yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile, daha sonra 2 saat boyunca 4 ° C &#39;de numuneler ve. </li><li> Plastik bir transfer pipet yardımıyla donma ikame orta çıkarın. % 100 aseton yaklaşık 500 mcL ekleyin. </li><li> 1.8 mi dondurarak saklamaya uygun vialler karıştırınhızla dairesel el hareketi ile cam bir şişe içinde ızgaraları (yüksekliği 3 cm, çap 2 cm) ihtiva eden aseton (1.5 mL) dökün. </li><li> tüm ızgaraları aktardıktan emin olmak için,% 100 aseton, 1 ml ile aynı cryovial durulayın. elin dairesel bir hareketi ile cryovial ilave edin ve cam şişe içinde dondurarak saklamaya uygun vialler içeriğini dökün. </li><li> 10 dakika% 100 aseton 3 kez 3 mL her bir cam şişe durulayın. </li><li> Referans 15 de tarif edildiği gibi gömme ve dahil prosedürleri takip edin. aseton (% 25,% 50 ve% 75), epoksi reçinesi artan konsantrasyonları ile örnek emprenye ve jelatin kapsüller içinde% 100 epoksi reçinesi ile örnek yerleştirin. </li></ol></li><li> çalışmaları immunolabeling <ol><li> bir polistiren tepsisine 1.8 mL cryovials Taşıma -30 ° C dondurucu (ani sıcaklık artışı önlemek için). </li><li> Bir -30 ° C dondurucu içinde 2 saat boyunca cryovials yerleştirin. </li><li> -30 ° &#39;de<html> Cı dondurucu, elin dairesel bir hareketi ile dondurarak saklamaya uygun vialler karıştırın ve hızlı bir polipropilen şişe (yükseklik 5 cm ve çapı 1.5 cm), dondurularak ikame ortamı dökün. </li><li> Taze dondurularak ikame orta 2 ml dondurma ikame ortamı değiştirin. </li><li> Bir -30 ° C dondurucu içinde 2 saat boyunca polipropilen şişe yerleştirin. </li><li> % 100 aseton ve 2 mL% 100 2 mL etanol ile 1 saat boyunca üç kez 1 saat boyunca polipropilen şişe yıkayın. </li><li> Referans 15 de tarif edildiği gibi gömme ve dahil prosedürleri takip edin. Akrilik reçinenin artan konsantrasyonlarının (% 25,% 50, ve aseton içinde% 75) ile örnek emprenye ve jelatin kapsüller içinde% 100 akrilik reçine ile örnek yerleştirin. </li></ol></li></ol> Numunelerin 8. Görselleştirme <ol><li> gömme sonra, bir ultramikrotom ile numune 80 mil ultra-ince bölümler yapmak. 1 dakika için oda sıcaklığında% 2 kurşun sitrat ile bölümleri Kontrasteşek = &quot;xref&quot;&gt; 15. </li><li> Bölümler 15 gözlemlemek için 80 kV veya 120 kV elektron mikroskobu kullanarak. </li></ol>

<ol><li>Palade, G. E., Porter, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Its+identification+in+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ.</a> J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).</li>
<li>Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artefacts+and+morphological+changes+during+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Artefacts and morphological changes during chemical fixation.</a> J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).</li>
<li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples%3A+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+with+the+old+and+in+with+the+new%3A+rapid+specimen+preparation+procedures+for+electron+microscopy+of+sectioned+biological+material%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material.</a> Protoplasma. 251, 429-448 (2014).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).</li>
<li>Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+counterbalances+endoplasmic+reticulum+expansion+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response.</a> PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).</li>
<li>Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+non-selective+autophagic+degradation+of+mitochondria+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast.</a> Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).</li>
<li>Gilkey, J. C., Staehling, A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060030206/abstract">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).</li>
<li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM%3A+A+Unique+Tool+for+the+Visualization+of+Macromolecular+Complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity.</a> Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li>
<li>Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).</li>
<li>Leunissen, J. L. M., Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-pressurized+rapid+freezing+%28SPRF%29%3A+a+novel+cryofixation+method+for+specimen+preparation+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy.</a> J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).</li>
<li>Lefebvre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LdFlabarin+a+new+BAR+domain+membrane+protein+of+Leishmania+flagellum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum.</a> PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).</li>
<li>Tetaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TbFlabarin%2C+a+flagellar+protein+of+Trypanosoma+brucei%2C+highlights+differences+between+Leishmania+and+Trypanosoma+flagellar-targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Parasitol%22%5BJournal%5D)">TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals.</a> Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).</li>
<li>Wasmer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+spectroscopy+reveals+that+E+coli+inclusion+bodies+of+HET-s%28218-289%29+are+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).</li>
<li>Lefebvre-Legendre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+assemble+the+alpha+3+beta+3+subcomplex+of+the+ATP+synthase+leads+to+accumulation+of+the+alpha+and+beta+subunits+within+inclusion+bodies+and+the+loss+of+mitochondrial+cristae+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).</li>
<li>Paumard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATP+synthase+is+involved+in+generating+mitochondrial+cristae+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology.</a> EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).</li>
<li>Gabriel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fox2-dependent+fatty+acid+%C3%9F-oxidation+pathway+coexists+both+in+peroxisomes+and+mitochondria+of+the+ascomycete+yeast+Candida+lusitaniae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae.</a> PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).</li>
<li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li>
<li>Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+living+cells%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of living cells: principles and practice.</a> Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).</li>
<li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).</li>
<li>Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+high-pressure+freezing+and+quick+freeze+substitution+of+plant+tissues+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51844(2014).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+autophagy+in+the+filamentous+fungus+Podospora+anserina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina.</a> Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).</li>
<li>Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+chemical+fixation+method+suitable+for+immunogold+localization+of+green+fluorescent+protein+in+the+Golgi+apparatus+of+tobacco+Bright+Yellow+%28BY-2%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells.</a> J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).</li>
<li>Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high+pressure+freezing+and+freeze+substitution+method+to+preserve+the+labile+vaccinia+virus+nucleocapsid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid.</a> J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları olduğunu beyan ederim.

TEM organeller, hücreler ve dokuların ultrastrüktürel gözlem için güçlü bir yöntemdir. Cryofixation / dondurularak ikame anda hem ince yapısı ve protein antijenisite korunması için en iyi yöntemdir. Kimyasal fiksatifler nüfuz ve ultrastrüktürün 2 tam istikrarlı önce yapısal yeniden düzenlemeleri sağlayan çok yavaş bir şekilde hareket ederler. Tersine, cryofixation / dondurularak ikamesi anında hücresel yapılar 4 dengeler. Bununla birlikte, cryofixation / dondurma-ikame tek...

Örnek hazırlama herhangi elektron mikroskopisi çalışmanın başarısı için kritik öneme sahiptir. Geleneksel EM sabitleme transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) 1 için doku veya hücrelerin sabitlenmesi için birincil yöntem oldu. İlk olarak, aldehit ve ozmiyum tetroksit kimyasal olarak oda sıcaklığında malzeme sabitlemek için kullanılır. Daha sonra, malzeme, organik çözücüler ile dehidre infiltre ve epoksi reçine içine gömülü olan. Bu yöntem, hücre içine fiksatif nüfuz hızına bağlıdır. Sonuç olarak, hücre içerikleri eserler ve ekstraksiyon, genellikle 2 görülmektedir. Cryofixation açık hücresel yapıların 3 korunması için daha iyi bir alternatif, onları etkilemeden onlara tutuyor. Ince bir reçine bölümlerde TEM görüntüleri 4 yüksek kalitede cryofixation / dondurma ikame yöntem kullanılarak elde edilebilir. Bu tekniğin amacı vitrifiye bi elde etmektirBuz kristallerinin oluşumu ya da hücrelerin ultrastrüktürel zarar vermemek için yeterince küçük içeren buz kristalleri olmadan ological örnekleri. Yüksek basınçlı dondurma (HPF) ve aynı zamanda (PF) dondurma dalma denir ultra hızlı cryofixation, numune cryofix için iki yöntem bulunmaktadır. HPF anlık hücrede molekülleri immobilize eden ve geleneksel EM tespit neden olduğu zarar görmesini engeller. Donma makineleri ve otomatik ikame cihazlarının çeşitli tipleri 5 geliştirilmiştir. Dondurma makinesi ve malzemeler (sıvı azot, vb taşıyıcılar, numune) pahalıdır, ancak yüksek kaliteli bir elektron mikrograflannı 6, 7 üretmek için izin verir. PF 1950&#39;lerin başında kullanılan ve basit ve PF prosedürü sırasında bu şirketin 8 ucuz, hazırlanan numune, buz kristallerinin en az 3 mil 5 için boyutu elde etmek için hızla dondurulur olarak literatürde tarif edilen bir tekniktir. Bu amaçla, örnekörneğin, etan, propan, ya da etan-propan karışımı gibi bir sıvı cryojen daldırıldı. 1950 yılından bu yana, PF iyileştirmeler kullanıcıların daha fazla sayıda bu teknik kullanılabilir hale getirmek için yapılmıştır. PF yaygın (görüntü küçük nesneleri için kullanılır ise yüksek basınç dondurma, şu anda daha kalın 50 5 um (disk şeklindeki numuneler için 200 um bir kalınlığa kadar) Numunelerin büyük bir çeşitlilik dondurmak için tek uygun bir şekilde &lt;100 nm ), şekilsiz bir buz 9&#39;un ince bir film içerisinde süspanse makromoleküler kompleksler gibi. Büyük örnekler, örneğin, ökaryotik hücreler için, PF cryofixed, ancak bu tür kılcal boru veya sandviç sistemleri 8, 10, 11 ya da numune tutucu, gerektirir. Burada, hızlı, kolay kullanımlı ve çeşitli süspansiyon hücre kültürleri için kullanılabilir düşük maliyetli dalma donma / dondurularak ikame teknolojisi sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>Izgaralar Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Formvar Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>Propan N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çift kenarlı diseksiyon iğnesi</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Kriyoviyaller Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Osmiyum tetroksit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişe 8.5 mL</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>Uranil asetat</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Etanol %100</td> <td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>VWR uluslararası</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>Cımbız</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akrilik reçine Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi reçine M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi reçine M sertleştirici</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>Dibutil ftalat ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Epoksi reçine M hızlandırıcı</td><td>Sigma</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>Kristalleştirici</td><td>Fischer scientific</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>Joseph kağıt</td><td>VWR uluslararası</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>Pirinç bardaklar</td><td></td><td></td><td>kendin yap, alışveriş yap veya kendin yap</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shizosacharomyces cerevisiae</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leishmania amazonensis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hava geçirmez kutu</td><td>Fischer scientific</td><td>7135-0001 & nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hava temizleyici solunum cihazı</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solunum cihazı kartuşu</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>Partikül filtresi</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

dalma donma: transmisyon elektron mikroskobu içinde süspansiyon hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için aracı

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

İletim Elektron Mikroskobu (TEM), proteinleri lokalize etmek ve macromoleküler kompleksleri çok yüksek çözünürlükte görselleştirmek için hücre altyapısını incelemek için olağanüstü bir araçtır. Bununla birlikte, doğa devletine olabildiğince yakın olabilmek için, mükemmel örnek muhafaza edilmesi gerekiyor. Örneğin, aldehitlerle konvansiyonel elektron mikroskopisi (EM) fiksasyonu, iyi bir ultrastrüktürel koruma sağlamaz. Sabitleştiricilerin yavaş nüfuz etmesi hücrenin yeniden düzenlenmesini ve çeşitli hücre bileşenlerini kaybetmesini sağlar. Bu nedenle, klasik EM fiksasyonu yapıların anlık statikleşmesini ve korunmasını ve antijenikliğine izin vermez. Hücre içi olayları incelemek için en iyi seçim, hücreleri kendi doğal hallerinde tutan dondurma-ikame sabitleme yönteminin ardından kriyofizasyonu kullanmaktır. Hücresel altyapı bütünlüğünü koruyan yüksek basınçlı dondurma / dondurma ikamesi, en sık kullanılan yöntemdir, ancak maliyeti gerektirirekipmanı ettik. Burada, süspansiyon hücre kültürleri için dondurularak ikamesi ile devam kullanımlı kolay ve düşük maliyetli dondurarak sabitleme yöntemi sunulmuştur.

Bu makalede, ultrastrüktürel (Şekil 1 ve Şekil 2) ve immunolabeling (Şekil 3) çalışmaları için, kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir dalma dondurma yöntemi sunulmuştur. Biz dondurularak değişikliği işlemleri için ve ısınma prosedürü yerine özel bir sistem kullanarak 24 saat 6'dan az saat sürer o özel ekipmanlara sahip olmak gerekli olmadığını göstermektedir. <p class="jove_content" fo:keep-tog...

Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Aşağıdaki deneylerin amacı, transmisyon elektron mikroskobunda görselleştirme için süspansiyon hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyon çalışmaları için bir araç önermektir. Bu tekniğin kullanımı kolaydır, düşük maliyetlidir ve hücresel yapının mükemmel bir şekilde korunmasını sağlar. Bu bir süspansiyon hücresi kültürüdür.İlk olarak, hücreler, bir mikrosantrifüj tüpünde bir pelet elde etmek için farklı santrifüjlerle hasat edilir. İkinci adımda, numune, hücreleri hareketsiz hale getiren ve buz kristallerinin oluşumunu sınırlayan daldırmalı dondurma ile hızlı bir şekilde dondurulur. Daha sonra, hücre yapılarını stabilize etmek için suyun fiksatif olarak osmiyum tetroksit içeren çözücü ile değiştirilmesi için donma ikamesi gerçekleştirilir.Sonuçlar, daldırmalı dondurma ve donma ikamesinin, hücrelerin altyapısını mükemmel bir şekilde koruduğunu göstermektedir. Kimyasal fiksasyon, transmisyon elektron mikroskobu için doku veya hücrelerin sabitlenmesi için birincil yöntemdi, ancak bu yöntemle, hücresel içeriğin artefaktları ve ekstraksiyonu genellikle gözlenir. Kimyasal fiksasyona bir alternatif kriyofiksasyondur.Bu yöntem, ince reçine bölümlerinde en yüksek kalitede morfoloji

plunge-freezing-tool-for-ultrastructural-immunolocalization-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yerli yakın eyalette bakteri hücrelerinin ultrastrüktür çalışma elektron cryotomography (EKT) nasıl kullanılacağı "makromoleküler" (~ 4 nm) çözünürlük, burada göstermektedir.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Temel teknikler ve transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için biyolojik örneklerin ve nanomateryallerin dondurularak kırık işleme iyileştirmeler açıklanmıştır. Bu teknik ultrastrüktürel özellikleri ve biyolojik membranların uzmanlık ifşa ve malzeme bilimleri ve nanoteknoloji ürünleri ultrastrüktürel düzeyde boyutlu ve konumsal verilerin elde edilmesi için tercih edilen bir yöntemdir.

Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Yüksek kaliteli transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri elde etmek, özellikle bol miktarda büyük su dolu vakuollere ve havalandırılmış alanlara sahip bitki hücreleri söz konusu olduğunda zordur. Tandem yüksek basınçlı dondurma ve hızlı dondurma ikamesi, mükemmel ultrastrüktürel korumaya sahip numuneler üretirken TEM için tesis numunelerinin hazırlanma süresini büyük ölçüde azaltır.

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Biz msn zamansal çözünürlüğe sahip membran dinamiklerinin görüntülenmesini sağlayarak elektron mikroskobu, "flaş-and-donması" içinde yeni bir teknik geliştirdi. Bu teknik, yüksek basınçlı dondurma nöron Optogenetic uyarılmasını birleştirir. Burada, prosedürleri göstermek ve ayrıntılı protokolleri açıklar.

Flaş-ve-Freeze: Elektron Mikroskobu ile Membran Dinamikler Yakalama Yeni Bir Tekniği

Burada silikon nitrür membranlar ve dalma-donma bir senkrotron kriyojenik X-ışını nanoprobun ile X-ışını floresan görüntüleme öncesinde hücre kültürü için bir protokoldür. Sadece oda sıcaklığında nano-analiz yapıldığında, dondurulmuş numuneler daha da dondurularak kurutulabilir. Bunlar hücre içi element bileşimi hakkında bilgi edinmek için kritik adımlardır.

Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü

Burada, kriyo yumuşak X-ışını tomografisinde (SXT) kriyo-korunmuş hücrelerin ultrayapısını 25 nm yarım perde çözünürlükte görüntülemek için gerekli numune hazırlama ve veri toplama adımlarını açıklayan bir protokol sunulmaktadır.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Burada bakteri, maya, kültürlü hücreler, izole hücreler, hayvan ve insan dokuları ve virüsler de dahil olmak üzere biyolojik örneklerin hızlı donması için sandviç dondurma cihazının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, hızlı donma işleminden sonra ultra ince kesitler için numunelerin nasıl hazırlanacağını da gösteriyoruz.

Elektron Mikroskopisinde Biyolojik Örneklerin İyi Ultrayapısal Korunması için Sandviç Dondurma Cihazı Kullanılarak Hızlı Dondurma

Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Burada, kriyo-elektron tomografisi için hücresel numunelerin hazırlanmasına rehberlik etmek için 3D bağıntılı odaklanmış iyon ışını frezeleme için bir boru hattı sunuyoruz. İlgilenilen floresan etiketli proteinlerin 3 boyutlu konumu önce kriyo-floresan mikroskobu ile belirlenir ve daha sonra öğütme için hedeflenir. Protokol memeli, maya ve bakteri hücreleri için uygundur.

Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-Elektron Tomografisi için 3D Korbağıntılı Odaklanmış İyon Işını Frezeleme ile Numune Hazırlama

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Öğrenin, süspansiyon hücrelerinin transmisyon elektron mikroskobu görüntülemesi için dalma donma ve donma ikamesi yöntemini. Bu düşük maliyetli teknik, hücre yapılarının mükemmel korunmasını sağlar.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı (Video) | JoVE Journal

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Daha fazla video keşfet