Name: Kemilüminesans Yöntemi kullanılarak biyolojik Malzemeleri, Nitrik Oksit Yolundaki nitrit ve nitrat, Metabolitler Ölçme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Öğrenin, kemilüminesans yöntemiyle biyolojik örneklerde nitrik oksit metabolizmasını ve sinyalini izlemeyi. Bu hassas teknik, nitrit ve nitrat düzeylerini ölçerek damar biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar kanda nitrit ölçümleri için nitrit koruyarak çözeltisinin kullanımı gelişmekte olan Dr. A. Dejam ve MM Pelletier kritik katkıları kabul etmek istiyorum.

Hayvanların kullanımını dahil olmak üzere tüm protokoller NIDDK Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kullanılmak üzere onaylanmış ve insan kan sağlıklı donörlerden NIH Kan bankasından elde edilmiştir. 1. Numune Hazırlama <ol><li> Nitrit koruyucu çözeltisinin hazırlanması <ol><li> 890 mM potasyum ferrisiyanür ihtiva eden bir çözelti hazırlayın (K3Fe (CN) 6) ve damıtılmış su içinde 118 mM NEM (N-etilmaleimit). mevcut hiçbir kristalleri ile sarı netleşene kadar iyi çözülür. 9 oranı (h / h, NP-40 / çözelti) bir 1: NP-40 (oktil phenoxylpolyethoxylethanol) ekleyin. ) Yaklaşık bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de köpürme ve mağaza önlemek için yavaşça karıştırın. </li></ol></li><li> Toplama ve kan örneklerinin hazırlanması <ol><li> pıhtılaşmayı (5 U / ml) önlemek için heparin ile hemoliz önlemek için en azından bir 20 G iğne kullanılarak kan toplayın. (4 oranında v: Tam kan örneği için, nitrit 1 hemen çözüm koruyarak ile kan mix/ Hac çözeltisi / kan). </li><li> plazma ve kırmızı kan hücreleri numuneler için, santrifüj, 4 ° C&#39;de 4000 x g&#39;de 5 dakika boyunca alınan kan, kırmızı kan hücrelerinin (RBC) ve plazma ayrılır. Süpernatant (plazma) almak ve plazma nitrit düzeylerinin belirlenmesi için, yukarıda tarif edildiği gibi nitrit çözeltisi korunması ile karıştırın. </li><li> Dikkatli bir kesme pipet kullanarak kan hücrelerinin diğer türlerine göre kirlenmesini önlemek için borunun alt numune ve pipet eritrosit numunesinden plazmanın ve buffy coat kalan kaldırmak ve aynı nitrit koruyucu çözeltisi içeren bir tüp içine transfer yukarıdaki gibi oranı. </li><li> 1 ya da 1: oranında 1 soğuk metanol ile her bir örnek (plazma ve RBC) karıştırın 2 (h / h örneği / metanol) ve proteinleri çökeltmek için 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 13,000 x g&#39;de santrifüj. -80 ° C&#39;de kuru buz ve mağaza, gerekirse, süpernatant atın ve nitrit ölçümü için kullanmak ya da hazırlanmış örnekleri dondurma. Not: Nitrit hızla reakan yapıcı nitrat oksihemoglobin (oxyHb) ile cts. oxyHb her nitrit üzerinde daha büyük miktarda mevcut olduğu için, bu reaksiyon, 10 dakika aralığında bir süre ile ana kan nitrit neredeyse tamamen yok olmasına yol açar. endojen kan nitrit en korumak amacıyla, nitrit koruyucu çözelti hemen kan alımından sonra tam kan numuneleri ilave edilir. Çözelti hızla kimyasal nitrit ile reaksiyona girmeyen hemoglobin etkin olmayan bir biçimi, kırmızı kan hücrelerinin lize edildi ve methemoglobin (metHb) içine oxyHb okside olur. </li></ol></li><li> Diğer türlü vücut sıvısı örneklerinin hazırlanması <ol><li> Uygun bir kap içine numune toplama sonra, nitrit koruyarak çözüm, deproteinate ile iyice karıştırın ve hemen ölçmek veya -80 ° C&#39;de dondurulması ve depolanması. </li></ol></li><li> Toplama ve doku örneklerinin hazırlanması <ol><li> heparinize tuzlu su çözeltisi (10 U HEPA ile perfüze hayvanlardan dokuları toplayınrin / ml). istenen dokuya tüketim 1 g homojen ya elle homojenleştirici veya otomatik homojenleştirici kullanılarak. </li><li> düz Homojenat elde etmek için gerektiği kadar çözelti koruyucu nitrit bilinen miktarda ekleyin. </li><li> 15 dakika boyunca 4 ° C &#39;de yukarıda tarif edildiği gibi (2 oranı hacim / hacim Örnek / metanol: 1 ya da 1: 1), 13000 x g hızında daha sonra santrifüj örnekleri dokusu homojenize sonra soğuk metanol kullanılarak proteinlerin çökeltilmesi. </li><li> süpernatant ve tedbir nitrit seviyelerini toplayın. Gerekirse, -80 ° C&#39;de kuru buz ve mağaza hazırlık herhangi bir aşamasında örnekleri dondurma. </li></ol></li></ol> Çözümler Azaltma 2. Hazırlık <ol><li> Tri-iyodür (I 3) nitrit ve R (x) = NO türlerinin tespiti 1,3,4 çözüm indirgeme <ol><li> Su içinde 138 mM I 2 çözeltisi ile birlikte 301 mM KI bir çözelti hazırlayın. Tüm kadar ~ 30 dakika için bir manyetik karıştırıcı üzerinde 7 oranında (hacim / hacim çözeltisi / asit): 2, buzlu asetik asit ile karıştırınKristaller eritilir. Tercihen iyodür ışığa duyarlı olarak, karanlık şişe tutmak ve hazırlık itibaren bir hafta içinde kullanın. Not: Bu çözüm NO içine Nitrit azaltacak ve aynı zamanda R-SNO, R-nHayır ve Fe-NO fonksiyonel gruplar (R (X) = NO) NO yayınlayacak, ancak nitrat etkilenmeyecektir. Yukarıdaki NO bazlı fonksiyonel grup sinyal asitleştirilmiş sülfanilamid (AS) ve AS-muamele karşılaştırılması ve işlenmemiş sinyal ile numunenin yarısının işlenerek gerçek nitrit sinyalinden ayrılabilir. Geri dönülmez bir şekilde nitrit ile diazonyum katyonu oluşturan ve bu kompleks bir 3 çözeltisi ile indirgenemez. AS tedavisi için, 1 M HCl in sülfanilamid 290 mM&#39;lik çözelti hazırlayın ve 1 oranında örneğinin bir bölümüne ekleyin: 9 (h / h AS / numune). örnek AS-tedavi edilen ve edilmeyen bölgelerinde CL sinyali ölçer. örnek AS-tedavi edilen ve edilmeyen kısmının bir fark olarak, gerçek nitrit sinyali hesaplayın. Nitrit, aynı zamanda, seçici bir NIT kullanılarak ölçülebilirayin indirgeyici parça 2.2 de tarif edildiği gibi, askorbik / asetik asit karışımı çözeltisi. Bununla birlikte, -NO tür mevcut R- (X) genellikle az miktarda AS işlenmemiş numuneler kullanılarak ölçümler toplam nitrit çok iyi bir yaklaşım çoğu durumda bağlı. </li></ol></li><li> Nitrit 2 seçici belirlenmesi için askorbik asit / asetik asit (4A) çözeltisi <ol><li> su içinde 500 mM askorbik asit hazırlayın. Reaksiyon karışımı hazırlamak için 7 (h / h, askorbik asit / asetik asit): bir oranda 1 buzlu asetik asit ile çözelti karıştırın. Not: Bu çözelti, nitrit için spesifik olan, herhangi bir R (x) = NO türlerinin ya da nitrat NO bırakmayacaktır. askorbik asit, kolay bir çözelti içinde okside Ancak, askorbik ve asetik asit solüsyonu, her gün ölçümleri yapılmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır. nitrit azaltma tamamlanması askorbik asit konsantrasyonuna bağlıdır; ve en az 50 mm askorbik asit, tam bir R önerilirPlazma nitrit eduction. Bununla birlikte, önceki son örnek ölçümleri beklenen nitrit konsantrasyon aralığında, askorbik asit ve nitrit standartları farklı konsantrasyonları ile birkaç pilot deneyleri için tavsiye edilir. askorbik asit biraz ölçümler sırasında tüketir unutmayın, cam reaksiyon odasındaki reaksiyon karışımının çok sık değişiklikler tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Nitrat belirlenmesi 9 Vanadyum (III) klorid indirgeme çözeltisi <ol><li> 1 M HCl içinde VCL 3 51 mM çözeltisi hazırlayın. Karanlık bir şişe 200 mikron filtre ve mağaza üzerinden filtre çözümü, iki hafta içinde kullanın. Not: Bu çözüm nitrat, nitrit ve tüm R (X) = NO türleri azaltacaktır, böylece hesaplanacak nitrit veya diğer R- kıyaslanabilir miktarda (X) = NO türlerinin beraberce nitrat ile mevcut, son nitrat içeriği varsa vcl 3 ve I elde edilen CL sinyalleri arasındaki fark olarak3 çözüm azaltır. </li></ol></li></ol> 3. Kemilüminesans (CL) Çözümleyici Kurulumu ve Ölçümler <ol><li> Standart çözüm <ol><li> Sodyum nitrit 1 mcM çözeltisi (NaNO 2) hazırlayın. Aynı çözelti, nitrit ve nitrat belirlemeleri için kullanılabilir. </li></ol></li><li> YOK analizörü kullanarak Not: Şu anda biyolojik araştırma amaçlı yeterince duyarlı iki piyasada mevcut hiçbir analiz vardır - Sievers NOA ve Ecophysics CLD 88Y. Her ikisi de aynı prensiple çalışır; Temel fark, CLD 88Y ozon yapmak için oda havadan oksijen kullanır (O 3), NOA, bu amaç için bir dış oksijen tankı gerektiren ise. Aşağıdaki prosedür Sievers NOA için setini açıklar. <ol><li> enstrüman kurulum <ol><li> üretici tavsiyelerine göre YOK analizör ilk kurulum gerçekleştirinolarak Şekil 1&#39;de görülen. </li><li> Cihaza bağlı Açık O 2 tankı. &quot;Analizi&quot; seçin ve ön paneldeki ana menüden &quot;enter&quot;. Bir sonraki ekranda seçim &quot;start&quot; basın &quot;girin.&quot; Şekil 1 &#39;de görüldüğü gibi, cihaza (1 M NaOH içeren) asit tuzak bağlayın. </li><li> photomultiplier -12 ° C&#39;nin altında sıcaklığa soğur ve reaksiyon haznesi 6 Torr tahliye kadar bekleyin. Istikrarlı bir düz taban çizgisini ulaşmak için yaklaşık 30 dakika sürer. Bazal 1 içinde stabilize ihtiyacı - 2 mV, nominal değeri istikrarı daha az önemlidir. Not: nitrat ölçülür, soğutma (asit ve su buharları gibi soğuk tuzak hizmet veren 4 ° C&#39;de set) su banyosu ve ısıtma suyu banyosu (ana reaksiyon haznesi, 95 ° C) açın. Vcl 3 çözeltide içine nitrat indirgeme oranı sıcaklığa bağlıdır ve bu oda Tempe çok yavaşrature, sıcaklık bu nedenle önemli bir artış reaksiyon gözlemlemek için gereklidir. </li><li> O tankı açın ve Şekil 1&#39;de görüldüğü gibi asit tuzak cam reaksiyon odasına bağlayın. Uygun indirgeme çözeltisi ile reaksiyon haznesine doldurmak minimuma kabarcık oluşumunu azaltmak ve asit yakalamak için, reaksiyon odası bağlayın. deneme ve yanılma yöntemiyle, enstrüman emme oranı (Siever en NOA için genellikle ~ 200 ml / dk) eşleşecek O köpürme oranını ayarlayın. </li><li> Cihazı kontrol Bilgisayarı açın ve Labview tabanlı sıvı yazılımını başlatın. alet ve satın alma yazılımı, basın arasındaki iletişim açmak için ekran okuyana kadar &quot;veri menüsünden&quot; in &quot;çıkış aktif&quot;, o zaman &quot;net&quot; tuşuna veri ekranına geri dönmek için &quot;enter&quot;. </li><li> Ekranda istikrarlı bir temel iz bekleyin ve septum yoluyla çözüm azaltarak içine örnekleri ve nitrit standartlarını enjekte başlar. Her zaman istikrarlı bir temel kıç ulaşmak için sabırsızlanıyorumzirveye er. Bu 2 dakika kadar sürebilir. Sıvı yazılım enjeksiyon bir seçenek için &quot;işareti&quot; kat vardır ve enjeksiyon açıklama ve veri dosyası (filename.data) için yararlı bir tamamlayıcısı olarak ayrı bir dosya (filename.info) içine bu yorumları ihraç edecek. </li><li> Numuneler ve standartlar ölçülür kez, seçim Sıvı yazılım menüsünde &quot;dur&quot; - bu &quot;filename.data&quot; olarak bilinen kalıcı bir dosyaya geçici bir dosyaya veri yazar. Basmak &quot;iptal&quot; seçeneği kalıcı dosyaya edinilen verileri yazmadan ölçüm sonlanacaktır. </li><li> Deney sona reaksiyon kabının üzerine musluğunu kapatarak reaksiyon kabından makine kesin ve asit tutucu ve reaksiyon kabı arasındaki boru bağlantısını kesmek için (Şekil 1 e bakınız). Şimdi NOA analizörü durdurmak - Basın &quot;net&quot;, &quot;bekleme&quot; ve &quot;onayla&quot; bekleme makineyi koymak &quot;analiz&quot;, gidin. Düzenli olarak kullanıldığındaenstrüman birkaç hafta bekleme modunda kalabilir. oksijen kaynağını kapatın. Daha sonra reaksiyon haznesi, kesmek gelen azaltılması çözüm yıkayın ve cam reaksiyon kabından O tankı kapatın ve reaksiyon kabı temizliği bitirmek. </li></ol></li><li> Standartlar ve örnek enjeksiyonları <ol><li> iyi yıkandı, Hamilton şırıngası kullanarak reaksiyon karışımı içerisindeki 1 uM nitrit çözeltisinin 50 ul enjekte edilir. piklerin iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamak için enjeksiyonlar arasında 2 dakika - en az 1 bekleyin. 50 ul enjeksiyon tekrarlayın her bir veri noktasına kopyalarını elde etmek. Her enjeksiyondan sonra, iyonu giderilmiş su ile şırınga yıkayın. </li><li> 1 uM nitrit çözeltisi 100, 150 ul yinelenen enjeksiyonları ile devam standart eğri için veri tam set elde etmek için (nitrit veya nitrat yüksek konsantrasyonlarda bekleniyor, ek 200 ul gerektirir). Her durumda, sinyal başlangıca geri düşene kadar beklemek özen ve sonra 1 kazanmak - 2 milBaşlangıçta n zirvelerinden iyi ayrılmasını sağlamak için. Not: Nitrit standartları deneyler sırasında herhangi bir zamanda ölçülebilir. Ayrıca, gösterge işlevselliği bağımsız bir kontrol olarak hizmet eder Ancak, veri ölçümü önce standart bir eğri elde etmek için tercih edilir. verilerin toplandığı zaman, numune miktarı iyi telaffuz zirveleri gitmelidir enjekte edilir. Ancak photomultiplier, sadece ~ 800 mV kadar doğrusal olduğu akılda tutulmalıdır böylece zirve hiçbiri ~ 700 mV daha yüksek olmalıdır. Bu miktar enjekte numunenin azaltılması ya da deiyonize su ile örnek seyreltilmesi yoluyla elde edilebilir. Her bir nokta iki kez, en azından ölçülmelidir. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Nitrite+in+Blood+Samples+Using+the+Ferricyanide-Based+Hemoglobin+Oxidation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay.</a> Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Nagababu, E., Rifkind, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+nitrite+by+chemiluminescence+without+interference+of+S-%2C+N-nitroso+and+nitrated+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species.</a> Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).</li>
<li>Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPinder%2C+AG+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Redox-Mediated+Signal+Transduction%22">Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction</a>. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).</li>
<li>Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+blood+and+plasma+nitrite+by+chemiluminescence%3A+pitfalls+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions.</a> Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).</li>
<li>Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+circulating+nitrite+and+S-nitrosothiols+by+reductive+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B%22%5BJournal%5D)">Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence.</a> J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).</li>
<li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).</li>
<li>Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+gas-phase+chemiluminescence+and+flow+injection+analysis+for+measurement+of+nitric+oxide+pool+in+biological+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices.</a> Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).</li>
<li>Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+the+sensitive+and+specific+measurement+of+S-nitrosothiols%2C+iron-nitrosyls+and+Nitrite+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples.</a> Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).</li>
<li>Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+serum+nitrate%2C+a+stable+end+product+of+nitric+oxide%2C+in+women+with+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia.</a> Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).</li>
<li>Beckman, J. S., Congert, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Dilute+Nitric+Oxide+in+Solution+with+an+Ozone+Chemiluminescent+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%3A+A+companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector.</a> Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).</li>
<li>Bates, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+measurements+by+chemiluminescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroprotocols%3A+A+companion+to+Methods+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection.</a> Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).</li>
</ol>

Dr Alan Schechter kardiyovasküler hastalıkların tedavisi için nitrit tuzlarının kullanılması Ulusal Sağlık Enstitüleri verilen çeşitli patentler ortak mucidi olarak listelenir. O klinik gelişim ama başka tazminat Bu patentlerin NIH lisans dayalı telif alır.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar orijinal numune hazırlanması, seyreltik ya da tedavi etmek için kullanılabilir (su dahil) çözeltiler alikoları kaydedilmesi gerekir ve olası nitrit ya da (daha çok) nitrat kirlenme kontrol etti. Çoğu kirlenme su gelir ve bir çok kimyasal endojen nitrat belirlenmesine müdahalede bulunan bir çok nitrat kirlilik önemli bir miktarını ihtiva örnek (özellikle ferrisiyanür) tedavisinde kullanılan bulundu. Biz düzenli deneyde kullanmadan önce bu nedenle nitrit ve ni...

Nitrit ve daha az uzatmak nitrat, kandaki düzeyleri vücutta genel devlete YOK metabolizmasını yansıtmaktadır. mikromolar - nitrit kandaki konsantrasyonu ve en çok organ ve dokuların sadece yüksek nanomolar ya da düşük mikromolar, nitrat çok daha yüksek miktarlarda, genellikle mevcut bulunmaktadır. nedeniyle hastalığın ilerlemesi nitrit düzeylerindeki değişiklikler veya diyet alışkanlıklarındaki değişiklikler oldukça küçük ve sadece çok hassas bir yöntem kullanılarak ölçülebilir. Çünkü onların çok farklı düzeylerde ve farklı metabolik süreçlerin, nitrit ve nitrat düzeyleri ayrı belirlenmesi esastır. Nitrit ve nitrat birlikte ölçülen çok az değere sahip olan &quot;NO x belirlenmesi&quot; olarak adlandırılan. Çeşitli biyolojik numunelerde nitrit ölçülmesi için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir - En yaygın başlangıçta bile, modern modificatio ile 1879 yılında açıklanan olmuştu Griess reaksiyonu dayalı, eski bir varlıkNS, Griess &#39;yöntemiyle elde edilebilen nitrit duyarlılık sınırı düşük mikromolar arasındadır. Tri-iyodür çözeltisi azaltılması ile birlikte Kemilüminesans (CL), şu anda nitrit konsantrasyonlarının 1-8,10,11 düşük nanomolar aralığında sayılmasına olanak tanıyan, en hassas yöntem olarak kabul edilir. Vanadyum (III) klorür çözeltisi azaltılması ile birlikte, aynı CL yöntem olup, nanomolar aralıkta 9 hassasiyetle, nitrat, hassas ölçümler için de kullanılabilir. CL ücretsiz gaz NO algılar. Bu nedenle, nitrit, nitrat, R-nitrozo tiyol (R TARGET), R NİTROSOAMİNLERİN (R NNO), ya da metal-NO bileşikleri (daha sonra el yazması olarak anılacaktır &quot;R- (X) = NO&quot;), dönüştürülmelidir CL aracılığıyla kendi özgün miktarlarda ölçmek için NO gazı boşaltın. NO dönüşüm NO metabolitin doğasına bağlı olarak, çeşitli indirgeyici çözüm kullanılarak elde edilir. Dönüştürmeden sonra, kuru NO gazı bir taşıyıcı gaz (O, N, reaksiyon kabından temizlenir2 veya ozon (O 3), azot dioksit oluşturmak üzere NO ile birleştirilir CL analizörünün reaksiyon haznesine, Ar) (NO 2), aktive edilmiş bir halde. Zemin durumuna dönüşü ile, NO 2 * kızılötesi bölgede yayar ve yayılan foton CL aracının photomultiplier (PMT) tarafından tespit edilir. yayılan ışığın yoğunluğu, uygun bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak, orijinal türlerin konsantrasyonunun hesaplanmasını sağlar tepkime haznesi NO konsantrasyonu ile doğrudan orantılıdır. Protokolde, biz en çok kullanılan klinik ortamlarda nitrit ve nitrat ilk bugünkü CL-bazlı tayininin - kan ve plazmada, ve sonra biz doku örneklerinde bu iyonları nasıl belirleneceği tartışmak. Biz de böyle bir kan ve bölmeleri, plazma ve kırmızı kan hücreleri olarak nitrit-reaktif ortamlarda, orijinal fizyolojik nitrit konsantrasyonunu korumak için nasıl ayrıntılı olarak açıklar.

<table><tbody><tr><td>potasyum ferrisiyanür; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-etilmaleimid</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonilfenil-polietilen glikol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sülfanilamid; AŞ&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>asetik asit, buzul</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>askorbik asit ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>potasyum iyodür; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>iyot; I2</td><td>Sigma</td><td>207772</td><td>ışığa duyarlı, toksik</td></tr><tr><td>sodyum nitrit; NaNO2</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>vanadyum(III) klorür; VCl3</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>ligice duyarlı, toksik</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elekler NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&nbsp; Ekofizik&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kemilüminesans yöntemi kullanılarak biyolojik malzemeleri, nitrik oksit yolu&#39;ndaki nitrit ve nitrat, metabolitler Ölçme

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitrik oksit (NO) damar homeostazının ve aynı zamanda bir nörotransmiter ana düzenleyici moleküllerin biridir. Enzimatik olarak üretilen NO çeşitli oksi-heme proteinleri ve diğer hala iyi bilinmemektedir yollar ile etkileşimleri tarafından nitrit ve nitrat içine oksitlenir. Ters işlem, NO içine nitrit ve nitrat indirgeme son on yılda memelilerde keşfedildi ve o önlemek veya düşünülen kardiyovasküler, metabolik ve kas hastalıklarının bir dizi kolaylaştırmak için ya olası yolların biri olarak dikkat kazanıyor NO azalan düzeyleri ile bağlantılı olabilir. kan, vücut sıvıları ve çeşitli dokularda - Farklı vücut bölümlerinde NO ve metabolitlerinin miktarını tahmin etmek önemlidir. Kan, nedeniyle kolay erişilebilirlik, NO metabolitlerinin tahmini için kullanılan tercih edilen bölme olduğunu. Nedeniyle kısa ömrü (birkaç milisaniye) ve düşük alt nanomolar konsantrasyonu NO kan direkt güvenilir ölçümler &lt;em&gt; in vivo mevcut büyük bir teknik zorluklar. Böylece YOK kullanılabilirlik genellikle oksidasyon ürünleri, nitrit ve nitrat miktarına dayalı tahmin edilmektedir. Bu iki metabolitler her zaman ayrı ayrı ölçülür. biyolojik sıvılar ve dokular konsantrasyonlarını belirlemek için çeşitli iyi bilinen yöntem bulunmaktadır. Burada, sırasıyla üç iyodür veya vanadyum (III) klorür çözeltileri, nitrit veya nitrat indirgeme sonrası NO spektrofotometrik tespit göre, kemilüminesans yöntemi (CL) için bir protokol mevcut. nitrit ve nitrat tespiti için duyarlılık YOK metabolik yollarda değişiklikleri belirlemek için şu anda mevcut en hassas yöntem olarak CL setleri düşük nanomolar aralığında yer almaktadır. Biz örneklerinde kendi miktarlarını belirlemek için toplanması ve nasıl sırasında nitrit ve nitrat mevcut orijinal miktarda korumak için biyolojik sıvılarda ve dokulardan örnekler nasıl hazırlanacağını ayrıntılı olarak açıklar. CL tekniğinin sınırlamalar da exp vardırLained.

Şekil 2, standart ve beş farklı numune toplanmıştır Örnek sonuçlarını gösterir. Bu Şekilde gösterildiği gibi, photomultiplier gerilim artar nitrit içeren çözelti (standartları veya numune) çözümü azaltılması enjekte edilir hemen sonra başlangıç ​​değerine ve getiri enjekte kez tüm nitrit mevcut (enjeksiyon kez kırmızı eğrinin altında oklarla gösterilir) çözelti düşürülmüştür. Ayrıca, doğru hacim ölçümü yüksek tekrarlanabilir veriler elde etmek için gerekli olan bu rakam ...

Nitrik oksit (NO) vasküler homeostazda önemli bir sinyal molekülüdür. NO in vivo üretimi, doğrudan ölçüm için çok düşüktür. Kemilüminesans, öncüllerini ve oksidasyon ürünlerini, nitrit ve nitratı ölçerek NO döngüsü hakkında yararlı bilgiler sağlar. Vücut dokularında ve sıvılarında nitrit/nitrat tayini anlatılmaktadır.

Kemilüminesans Yöntemi kullanılarak biyolojik Malzemeleri, Nitrik Oksit Yolu&#39;ndaki nitrit ve nitrat, Metabolitler Ölçme

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Bu protokolün amacı, triiyodür ve vanadyum-klorür indirgeyici çözeltiler kullanarak nitrit ve nitrat seviyelerini ölçerek biyolojik numunelerde nitrik oksidin miktarını belirlemek için kemilüminesans kullanmaktır. Bu protokol, çeşitli biyolojik örneklerden hem bölgesel hem de boylamsal olarak nitrik oksit metabolizmasını ve sinyalleşmesini izlemek için güçlü bir araç sağlar. Bu tekniğin temel avantajı basitliği ve yüksek hassasiyetidir.Bu prosedürü göstermek, IRTA bursiyerimiz Katelyn Cassel olacaktır. Bize nitritin triiyodür çözeltisi ile birleştirilmiş kemilüminesans ile nasıl ölçüleceğini gösterecek. Başlamak için nitrit koruyucu bir çözelti yapın.Damıtılmış suda bir adet 118 milimolar NEM ve 890 milimolar potasyum-ferrosiyanür içeren bir çözelti hazırlayın. Katıları, çözelti kristal olmadan berrak sarı olana kadar çözün. Daha sonra bu çözeltiyi hacimce 9'a 1 hacim oranında NP 40'a ekleyin.Köpürmeyi önlemek için çözeltiyi hafifçe karıştırın. Bu karışımı asla girdap haline getirmeyin. Nitrit koruma çözeltisi, 4 santigrat derecede saklanırsa yaklaşık bir hafta kullanılabilir.Protokol, yeni elde edilen birçok biyolojik örnekte kullanılabilir. Bu durumda, test için bir plazma örneği elde etmek için taze çekilmiş kan santrifüj edildi. Kan veya hemoglobin veya miyoglobin gibi büyük miktarda hem proteini içeren herhangi bir biyolojik numunenin mümkün olan en kısa sürede işlenmesi çok önemlidir, çünkü hem proteinleri nitrit ile reaksiyona girecek ve nitriti yok edecektir.Şimdi, endojen kan nitritinin çoğunu korumak için, plazmayı hemen hacimce 1 ila 4 hacimce bir nitrit koruyucu çözelti ile karıştırın. Bu hazırlığın herhangi bir aşamasında, numune kuru buz üzerinde dondurulabilir. Numuneyi deproteinize etmek için eşit miktarda soğuk metanol ile karıştırın.Daha sonra, proteinleri çökeltmek için numuneyi 13000 G'de 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı alın ve nitrit ölçümü için kullanın. Nitritin hassas ölçümü için, bir triiyodür indirgeyici çözeltinin en etkili olduğu kabul edilir.Hazırlarken tüm kristallerin çözüldüğünden emin olun. Solüsyonu koyu renkli bir şişede saklayın ve hazırlandıktan sonraki bir hafta içinde kullanın. Vanadyum klorür indirgeyici çözelti, nitrat ölçümü için en yüksek hassasiyeti sunar.Nitrit ve nitrat için standart eğrinin belirlenmesi için 1 mikromolar nitrit çözeltisi kullanılır. Nitrik oksit analizörünü üreticinin talimatına göre kurun. İlk olarak, oksijen tankını açın, cihazı açın ve bir molar sodyum-hidroksit içeren bir asit tuzağına bağlayın.Ardından, helyum tankını açın, ardından cam reaksiyon odasını helyum tankına bağlayın. Şimdi, nitrit ölçümü için reaksiyon odasını triiyodür çözeltisi ile yükleyin. Köpük önleyici ajan ekleyin.Köpürmeyi yavaşlatmak için gaz akış hızını ayarlayın. Ve sonra asit tuzağını reaksiyon odasına bağlayın. Deneme yanılma yöntemini kullanarak, helyum akışını cihazın emişine uyacak şekilde doğru şekilde ayarlayın.Şimdi, görsel programlama tabanlı sıvı yazılımını başlatın. İlk olarak, Veri menüsünden cihaz ile toplama yazılımı arasındaki iletişimi etkinleştirin, ardından ön paneldeki ana menüden analizi başlatın. Fotoçoğaltıcı soğutucunun eksi 12 santigrat derecenin altına soğumasını ve fotoçoğaltıcının stabilize olmasını bekleyin.Yaklaşık 30 dakika sonra, taban çizgisi 1 veya 2 milivolt içinde stabilize olacaktır. Değerin kendisi değil, değerin istikrarı önemlidir. Analizör stabilize olduktan sonra, çözeltileri enjekte etmek için iyi yıkanmış bir Hamilton şırınga kullanın.İlk olarak, 1 mikromolar nitrit standardının en az üç farklı hacmini enjekte edin. Solüsyonları septum yoluyla indirgeyici solüsyona enjekte edin. Her standardı veya numuneyi iki kez enjekte edin.Yüksek nitrit seviyeleri ve numuneler bekleniyorsa, standart eğrinin eğiminin daha iyi belirlenmesi için büyük bir dördüncü hacimde standart nitrit çözeltisi enjekte etmeyi düşünün. Her zaman çıktıyı gözlemleyin ve bir sonraki numuneyi enjekte etmeden önce analizörün taban çizgisine yeniden stabilize olmasını bekleyin. Bu en az bir dakika sürer.Doğru sonuçlar için 700 milivoltun altında zirve yapan numune hacimlerini kullanın. Çalışmalar arasında, şırıngayı deiyonize su ile iyice yıkayın. Şırıngayı iyice yıkamak çok önemlidir.Tüm ölçümler yapıldıktan sonra yazılımdaki durdur seçeneğine basın. Veriler otomatik olarak kaydedilecektir. İptal düğmesine basmak, verileri kaydetmeden ölçümü sonlandırır.Reaksiyon kabının üstündeki durdurma musluğunu kapatın ve asit tutucu ile reaksiyon kabını bağlayan boruyu ayırın. Deneyden sonra analizörü beklemeye alın. Ana paneldeki analize basın ve bekleme moduna girdiğini onaylayın.Ardından, oksijen kaynağını kapatın. Asit tutucuya giden boruyu O2 tankından ayırın. Ardından triiyodür çözeltisini helyum kullanarak yıkayın.Ardından, helyum tankını cam reaksiyon kabından kapatın ve bağlantısını kesin. Son olarak, gerektiği kadar etanol ve su kullanarak kabı temizleyin. Plazma numuneleri ile birlikte test standartları, enjeksiyonlarından hemen sonra, fotoçoğaltıcı voltajın arttığını ve tüm nitrit azaldığında taban çizgisine geri döndüğünü gösterir, bu da bir dakika kadar sürebilir.Sinyali ölçmek için, voltaj atlama tepesinin altındaki alanı kullanarak standartlardan standart bir eğri oluşturuldu. Standart eğri kullanılarak, numunelerin miktar tayini, çift enjeksiyonları arasında çok tekrarlanabilirdi. Kemilüminesans, nitrit konsantrasyonlarını belirlemek için altın standart olarak kabul edilir.Bir kez ustalaştıktan sonra, nitrit için hassasiyet sınırı yirmi milimolar kadar düşüktür. Kemilüminesans ile çalışmanın en önemli şeyi hassasiyettir. Yöntemin yüksek hassasiyeti nedeniyle, her bir hata nihai sonucu etkileyecektir.Bu yüzden acele etmeyin ve acele etmeyin. Bu teknik 2000'li yılların başında geliştirildikten sonra, araştırmacıların nitrik oksit metabolik yolaklarını keşfetmelerinin ve nitrik oksit eksikliğinin başta kardiyovasküler hastalıklar olmak üzere birçok hastalığa neden olduğunu öğrenmelerinin yolunu açtı.

measuring-nitrite-nitrate-metabolites-nitric-oxide-pathway-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Nitrik oksit (NO) endojen üretimi biyolojik fonksiyonları çok çeşitli düzenler. Bu NO dayalı sinyal bozulması veya düzensizliği birçok insan hastalıkları dahil olduğu giderek daha açık hale gelmektedir. Yöntem NO metabolitleri insan hastalığı için yeni tanısal veya prognostik biyolojik sağlayabilir ilgili ölçmek için.

Nitrik Oksit Biyoaktivite içlin Analitik Teknikler

İnflamatuar hücre sinyal molekülü nitrik oksit (NO) seviyeleri yaygın olarak Griess reaktifi kullanılarak test edilir. Bu protokolde, NO'nun salgılanmasını basit, ölçülebilir ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir yöntemle tespit etmek için canlı Drosophila beyin dokusu kullanılarak modifiye edilmiş bir Griess testi oluşturduk.

Drosophila Nöroinflamatuar Yanıtında Nitrik Oksit Düzeylerinin Yeni Tüm Doku Kantitatif Testi

Bu yazıda floresan boya tr yüz eşzamanlı algılama ve hücre içi nitrik oksit görselleştirme (NO) ve süperoksit anyon (O 2 diaminofluorescein-2 diasetat (DAF-2DA) ve dihydroethidium (DHE) kullanarak adapte nispeten kolay bir yöntem tarif .- ) sırasıyla, taze bir obezite fare modelinin sağlam aorta izole edilmiştir.

Bozulmamış Arterlerin endotel katmanı Nitrik Oksit ve Süperoksit En Yüz Algılama

Önceki çalışmalar, atmosferik nitrojen oksitlerin nitrojen izotopik bileşiminin, çevredeki farklı kaynakların etkisini ayırt edebileceğini düşündürmektedir. Saatlik bir zaman çözünürlüğünde N izotopik analizi için atmosferik NOx'in yüksek toplama verimliliği için otomatik, mobil, alan tabanlı bir yöntem hakkında rapor veriyoruz.

Yüksek çözünürlüklü Mobil Toplama Sistemi NO Azot İzotop Analizi için, Otomatik<sub&gt; X</sub

Bu kağıt nitrik oksit (NO) Atlası İlaçlama Fumigasyon protokollerde açıklar. Fümigasyon chambers ile Hayır önce ultralow oksijen koşullarını oluşturmak için azot (N2) sifonu çektim enjekte edilir. Sonunda, odaları yok2etkilenmemek için ortam havası ürünlere maruz önce Hayır sulandırmak için N2 ile atılır.

Laboratuvar İlaçlama haşere kontrolü ile nitrik oksit gaz için prosedürleri

Α-prokollajen sitokrom P450s tarafından kanserojen nitrozaminler ve mutasyonlar neden DNA-zarar intermediates üretir kabul edilen metabolik yoludur. Ancak, yeni verileri daha fazla nitrosamides oksidasyon oluşabilir gösterir. Biz genel bir tarif yöntemi nitrosamides tespit için üretilen vitro sitokrom P450 katalize metabolizması nitrozaminler.

Nitrosamide oluşumu nitrozaminler sitokrom P450s tarafından in Vitro metabolizma saptamak için bir genel yöntem

14NH4+/15NH4+ analizlerine dayalı potansiyel DNRA oranını belirlemek için bir dizi yöntem ayrıntılı olarak verilmiştir. NH4+ birkaç adımla N2O'ya dönüştürülür ve quadrupole gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilir.

14NH4+/15NH4+ Sıralı Dönüşüm Yoluyla N2O'ya Göre Amonyuma Nitrat Azaltma Nın Potansiyel Oranlarının Ölçülmesi

Nitrat ve nitrit seviyelerini ölçmek ve karşılaştırmak için sıçan iskelet kası dokusunun dört farklı kas grubunun homojenizasyonu için üç farklı yöntem için protokoller sunuyoruz. Ayrıca, doku numune büyüklüğünün homojenizasyon sonuçlarını etkileyip etkilemediğini araştırmak için farklı numune ağırlıklarını karşılaştırıyoruz.

Nitrat ve Nitrit Ölçümleri için Sıçan İskelet Kas Homojenatlarının Hazırlanması

Burada, nitrik oksit ve biyolojik olarak ilgili türevlerini, yüksek hassasiyete sahip kemilüminesans bazlı testler kullanarak tespit etmek için protokoller sunuyoruz.

Nitrik Oksit ve Türevlerinin Otoksidasyon ve Nitroslu Bileşiklerden Tespiti için Kemilüminesans Bazlı Testler

Bu protokol, hava-sıvı arayüzünde (ALI) farklılaşan hava yolu epitel kültürlerinde nitrit üretimini triyodid bazlı kemimilüminesans testi kullanılarak apikal sekresiyalarda nitrit ölçümünü sağlayan bir yöntemi tanımlar.

Hava sıvı arayüzünde farklılaşmış fare trakeal epitel hücre kültürlerinde nitrik oksit üretiminin ölçümü

Öğrenin, kemilüminesans yöntemiyle biyolojik örneklerde nitrik oksit metabolizmasını ve sinyalini izlemeyi. Bu hassas teknik, nitrit ve nitrat düzeylerini ölçerek damar biyolojisi araştırmalarına katkı sağlar.

Kemilüminesans Yöntemi kullanılarak biyolojik Malzemeleri, Nitrik Oksit Yolu'ndaki nitrit ve nitrat, Metabolitler Ölçme

Daha fazla video keşfet