Kemilüminesans Yöntemi kullanılarak biyolojik Malzemeleri, Nitrik Oksit Yolu'ndaki nitrit ve nitrat, Metabolitler Ölçme

Bu protokolün amacı, triiyodür ve vanadyum-klorür indirgeyici çözeltiler kullanarak nitrit ve nitrat seviyelerini ölçerek biyolojik numunelerde nitrik oksidin miktarını belirlemek için kemilüminesans kullanmaktır. Bu protokol, çeşitli biyolojik örneklerden hem bölgesel hem de boylamsal olarak nitrik oksit metabolizmasını ve sinyalleşmesini izlemek için güçlü bir araç sağlar. Bu tekniğin temel avantajı basitliği ve yüksek hassasiyetidir.

Bu prosedürü göstermek, IRTA bursiyerimiz Katelyn Cassel olacaktır. Bize nitritin triiyodür çözeltisi ile birleştirilmiş kemilüminesans ile nasıl ölçüleceğini gösterecek. Başlamak için nitrit koruyucu bir çözelti yapın.

Damıtılmış suda bir adet 118 milimolar NEM ve 890 milimolar potasyum-ferrosiyanür içeren bir çözelti hazırlayın. Katıları, çözelti kristal olmadan berrak sarı olana kadar çözün. Daha sonra bu çözeltiyi hacimce 9'a 1 hacim oranında NP 40'a ekleyin.

Köpürmeyi önlemek için çözeltiyi hafifçe karıştırın. Bu karışımı asla girdap haline getirmeyin. Nitrit koruma çözeltisi, 4 santigrat derecede saklanırsa yaklaşık bir hafta kullanılabilir.

Protokol, yeni elde edilen birçok biyolojik örnekte kullanılabilir. Bu durumda, test için bir plazma örneği elde etmek için taze çekilmiş kan santrifüj edildi. Kan veya hemoglobin veya miyoglobin gibi büyük miktarda hem proteini içeren herhangi bir biyolojik numunenin mümkün olan en kısa sürede işlenmesi çok önemlidir, çünkü hem proteinleri nitrit ile reaksiyona girecek ve nitriti yok edecektir.

Şimdi, endojen kan nitritinin çoğunu korumak için, plazmayı hemen hacimce 1 ila 4 hacimce bir nitrit koruyucu çözelti ile karıştırın. Bu hazırlığın herhangi bir aşamasında, numune kuru buz üzerinde dondurulabilir. Numuneyi deproteinize etmek için eşit miktarda soğuk metanol ile karıştırın.

Daha sonra, proteinleri çökeltmek için numuneyi 13000 G'de 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı alın ve nitrit ölçümü için kullanın. Nitritin hassas ölçümü için, bir triiyodür indirgeyici çözeltinin en etkili olduğu kabul edilir.

Hazırlarken tüm kristallerin çözüldüğünden emin olun. Solüsyonu koyu renkli bir şişede saklayın ve hazırlandıktan sonraki bir hafta içinde kullanın. Vanadyum klorür indirgeyici çözelti, nitrat ölçümü için en yüksek hassasiyeti sunar.

Nitrit ve nitrat için standart eğrinin belirlenmesi için 1 mikromolar nitrit çözeltisi kullanılır. Nitrik oksit analizörünü üreticinin talimatına göre kurun. İlk olarak, oksijen tankını açın, cihazı açın ve bir molar sodyum-hidroksit içeren bir asit tuzağına bağlayın.

Ardından, helyum tankını açın, ardından cam reaksiyon odasını helyum tankına bağlayın. Şimdi, nitrit ölçümü için reaksiyon odasını triiyodür çözeltisi ile yükleyin. Köpük önleyici ajan ekleyin.

Köpürmeyi yavaşlatmak için gaz akış hızını ayarlayın. Ve sonra asit tuzağını reaksiyon odasına bağlayın. Deneme yanılma yöntemini kullanarak, helyum akışını cihazın emişine uyacak şekilde doğru şekilde ayarlayın.

Şimdi, görsel programlama tabanlı sıvı yazılımını başlatın. İlk olarak, Veri menüsünden cihaz ile toplama yazılımı arasındaki iletişimi etkinleştirin, ardından ön paneldeki ana menüden analizi başlatın. Fotoçoğaltıcı soğutucunun eksi 12 santigrat derecenin altına soğumasını ve fotoçoğaltıcının stabilize olmasını bekleyin.

Yaklaşık 30 dakika sonra, taban çizgisi 1 veya 2 milivolt içinde stabilize olacaktır. Değerin kendisi değil, değerin istikrarı önemlidir. Analizör stabilize olduktan sonra, çözeltileri enjekte etmek için iyi yıkanmış bir Hamilton şırınga kullanın.

İlk olarak, 1 mikromolar nitrit standardının en az üç farklı hacmini enjekte edin. Solüsyonları septum yoluyla indirgeyici solüsyona enjekte edin. Her standardı veya numuneyi iki kez enjekte edin.

Yüksek nitrit seviyeleri ve numuneler bekleniyorsa, standart eğrinin eğiminin daha iyi belirlenmesi için büyük bir dördüncü hacimde standart nitrit çözeltisi enjekte etmeyi düşünün. Her zaman çıktıyı gözlemleyin ve bir sonraki numuneyi enjekte etmeden önce analizörün taban çizgisine yeniden stabilize olmasını bekleyin. Bu en az bir dakika sürer.

Doğru sonuçlar için 700 milivoltun altında zirve yapan numune hacimlerini kullanın. Çalışmalar arasında, şırıngayı deiyonize su ile iyice yıkayın. Şırıngayı iyice yıkamak çok önemlidir.

Tüm ölçümler yapıldıktan sonra yazılımdaki durdur seçeneğine basın. Veriler otomatik olarak kaydedilecektir. İptal düğmesine basmak, verileri kaydetmeden ölçümü sonlandırır.

Reaksiyon kabının üstündeki durdurma musluğunu kapatın ve asit tutucu ile reaksiyon kabını bağlayan boruyu ayırın. Deneyden sonra analizörü beklemeye alın. Ana paneldeki analize basın ve bekleme moduna girdiğini onaylayın.

Ardından, oksijen kaynağını kapatın. Asit tutucuya giden boruyu O2 tankından ayırın. Ardından triiyodür çözeltisini helyum kullanarak yıkayın.

Ardından, helyum tankını cam reaksiyon kabından kapatın ve bağlantısını kesin. Son olarak, gerektiği kadar etanol ve su kullanarak kabı temizleyin. Plazma numuneleri ile birlikte test standartları, enjeksiyonlarından hemen sonra, fotoçoğaltıcı voltajın arttığını ve tüm nitrit azaldığında taban çizgisine geri döndüğünü gösterir, bu da bir dakika kadar sürebilir.

Sinyali ölçmek için, voltaj atlama tepesinin altındaki alanı kullanarak standartlardan standart bir eğri oluşturuldu. Standart eğri kullanılarak, numunelerin miktar tayini, çift enjeksiyonları arasında çok tekrarlanabilirdi. Kemilüminesans, nitrit konsantrasyonlarını belirlemek için altın standart olarak kabul edilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, nitrit için hassasiyet sınırı yirmi milimolar kadar düşüktür. Kemilüminesans ile çalışmanın en önemli şeyi hassasiyettir. Yöntemin yüksek hassasiyeti nedeniyle, her bir hata nihai sonucu etkileyecektir.

Bu yüzden acele etmeyin ve acele etmeyin. Bu teknik 2000'li yılların başında geliştirildikten sonra, araştırmacıların nitrik oksit metabolik yolaklarını keşfetmelerinin ve nitrik oksit eksikliğinin başta kardiyovasküler hastalıklar olmak üzere birçok hastalığa neden olduğunu öğrenmelerinin yolunu açtı.