Nörokimyasal markerleri Biocytin dolu ve İşlenmiş Bölümler immün

Bu protokolün amacı, nörokimyasal kimliği belirlemek için spesifik antikorlarla yeniden boyamadan önce morfolojinin geri kazanılması için biyosit ve immün boyama kullanılarak elektrofizyolojik kayıtlar sırasında yamalanan nöronları tanımlamak için etkili bir yöntem sunmaktır. Dolayısıyla bu yöntem, nöronal yapı ve işlevdeki çeşitliliği incelemek için gereken önemli bir adımı tanımlar. Bu, beyin ağlarındaki rollerini anlamak için çok önemlidir.

Sıralı işleme tekniklerinin kullanılmasının temel avantajı, morfolojinin kurtarılamaması nedeniyle veri kaybını ortadan kaldırmasıdır. Bu, bu hücrelerde test edilecek nörokimyasal belirteçleri de yönlendirmeye yardımcı olur. Bu yöntem, kalın kesitlerdeki hücrelerin morfolojik olarak geri kazanılması için tarif edilse de, ince kesitlere ve daha önce boyanmış ve monte edilmiş numuneler üzerinde de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan nötr maddeler, hücreden ayrılırken soma'yı yeniden mühürlemekte zorluk çekebilir ve başarılı dolgular için yeterli zaman tanıyamayabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü tam morfolojiyi geri kazanmak için hücrelerin etkili biyositin dolumu için spesifik teknikler gereklidir. Bu prosedüre başlamak için, voltaj kelepçesi konfigürasyonunda, hücreye yaklaşırken banyo modunda membran test fonksiyonunu kullanarak küçük kısa voltaj adımları uygulayın.

Emme uygulayarak hücreye yama yapın. Ardından, hücreyi eksi 70 milivoltta tutun. Bir gigaohm contasının geliştirilmesine dikkat edin.

Kapasitif geçişleri telafi edin ve ardından tüm hücre konfigürasyonunu elde etmek için bir şırınga ile veya ağızdan kontrollü emme uygulayın. Tüm hücre kapasitansını ve seri direnci tahmin edin ve membran test darbelerini durdurun. 10 megaohm'dan daha düşük seri direnç optimaldir.

Bu, biyosit dolumuna izin vermek için tüm hücre kayıt koşullarının oluşturulmasını sağlayacaktır. Fizyolojik kayıtların tamamlanmasının ardından, kayıt pipetini küçük adımlarla yavaşça hareket ettirerek, voltaj kelepçesi modunda yukarı ve dışa doğru dönüşümlü olarak yama kelepçesi konfigürasyonunu yeniden oluşturun. Hücrelerin morfolojik olarak geri kazanılmasının en kritik adımı, kayıt pipetini hücreden ayırırken nöronal soma'nın yeniden sızdırmazlığını sağlamaktır.

Membran test fonksiyonunu kullanarak, kapasitif geçici akımların kaybını ve akım tepkilerinin düz bir çizgiye çökmesini görselleştirin, bu da hücrenin yeniden sızdırmazlığını ve pipet ucunda bir dış dış yama oluştuğunu gösterir. Bu arada, hücreyi depolarize bir potansiyelde tutmak, yeniden mühürleme işlemini kolaylaştıracaktır. Pipeti hücreden çıkardıktan sonra, boyanın distal, dendritik ve aksonal işlemlere taşınmasını sağlamak için dilimi kayıt odasında üç ila beş dakika tutun.

Daha sonra dilimi fiksasyon için %4 PFA içeren 24 oyuklu bir plakaya aktarın. PFA fiksasyonundan 24 ila 48 saat sonra, immün boyamadan önce saklamak için tüm sabit dilimleri sıfır nokta bir molar PBS'ye aktarın. Bu prosedürde, dokuları sıfır nokta bir molar PBS'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Daha sonra, dokuları oda sıcaklığında bir saat boyunca yüzde 10 bloke edici serum ile bloke edin. Daha sonra, kanabinoid reseptörü tip 1 ekspresyonunu tanımlamak için birincil antikorlar CB1R'deki bölümleri gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ardından, beyin bölümlerini 0.1 molar PBS'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Streptavidin ve birinci birincil antikorun ikincil antikoru, her ikisi de kuyu plakasına eklenir ve gece boyunca dört santigrat derecede tutulur. Daha sonra, biyositini ortaya çıkarmak için streptavidin kırmızı boya konjugatındaki bölümleri karanlıkta gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, beyin bölümlerini her biri 0.1 molar PBS'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Çiçeklenmeyi korumak ve gelecekte yeniden boyamayı kolaylaştırmak için, bölümleri eşit aralıklı bir montaj ortamına monte edin. Kapak fişlerinin kenarlarını şeffaf oje ile kapatın. Bu adımda, ojeyi bir pamuklu çubukla cam slayttan asetonla çıkarın.

İnce uçlu forseps kullanarak kapak kızağını dikkatlice çıkarın ve bölümlere birkaç damla 0.1 molar PBS koyun. Dokuyu sulu montaj ortamından çıkarırken işlem dokusuna zarar vermemek çok önemlidir. İnce bir boya fırçası kullanarak slayttan bölümleri dikkatlice çıkarın ve bir çalkalayıcıda 24 ila 48 saat boyunca 0.1 molar PBS'de yıkayın ve dört santigrat derecede ışıktan uzak tutun.

Montaj ortamının tamamen çıkarılmasını sağlamak için, bölümleri ertesi gün 0.1 molar PBS'de her seferinde 10 dakika boyunca bir ila iki kez yıkayın. Daha sonra, bölümleri bir gün boyunca ikinci bir primer antikor kolesistokinin ile inkübe edin. Beyin bölümlerini 0.1 molar PBS'de her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Daha sonra, bölümleri bir florofor konjuge ikincil antikor keçi anti-fare ile boyayın. İkincil antikorun uyarma emisyon spektrumlarının streptavidin ve önceki immünofloresan boyalarla örtüşmediğinden emin olmak. Daha sonra, bölümleri sulu montaj ortamına monte edin.

Kapak kaymasının kenarlarını şeffaf oje ile kapatın. Başarılı biyosit dolumu ve ilk immün boyama işlemini takiben, nöronal yapı, 60x büyütmede elde edilen konfokal görüntüde gösterildiği gibi görselleştirilebilir ve görüntülenebilir. Kesit ayrıca biyositin ile birlikte CB1R için immün boyandı ve nöronal soma eksprese eden biyositin içindeki CB1R immün boyaması ok ucu ile gösterildi.

Aynı bölüm, bir hafta sonra CCK immüno-reaktivitesi için işlendi ve görüntü, yıldız işareti ile gösterilen birkaç nöronda CCK immüno-etiketlemesinin başarılı bir şekilde geri kazanıldığını gösteriyor. Ok ucu ile gösterilen biyositin etiketli hücrenin CCK'yı ifade etmediğine dikkat edin. A, B ve C panellerinin birleştirilmiş bir görüntüsü, üç etiketin de sağlam bir şekilde görselleştirildiğini ve biyosit ile CB1R arasındaki kaplamanın belirgin olduğunu göstermektedir.

Görüntü, ikinci immün boyama işleminin, önceki boyama işleminden gelen sinyali tehlikeye atmadığını göstermektedir. Biyosit dolu hücrenin morfolojisi, bu CCK immün boyamadan önce konfokal görüntülerden elde edildi. En önemlisi, soma ve dendrite ek olarak, aksonlar görselleştirilebilir ve CB1R ve biyosit etiketli aksonal süreçlerin birlikte etiketlenmesi gözlenir.

Bu prosedürü denerken, kopmuş süreçlere sahip nöronlardan kaçınmak için dilim yüzeyinin altında bulunan sağlıklı hücreleri hedeflemek önemlidir. Ve bu, morfolojinin geri kazanılmasını tehlikeye atabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, biyosit dolgulu hücrelerin morfolojik geri kazanımı, yama kelepçesi kaydı sırasında güvenilir bir şekilde elde edilebilir.

Seri immün boyama tekniğinin başarılı bir şekilde uygulanması, veri kurtarmanın verimliliğini artıracak ve standart yama klemp kayıtları sırasında nöronal karakterizasyonu kolaylaştıracaktır. Bu videoyu izledikten sonra, nöronal morfolojiyi geri kazanmak ve nörokimyasal belirteçleri belirlemek için biyosit dolu hücrelerin nasıl etkili bir şekilde kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.