Maymun bağışıklık eksikliği virüsüne özgü CD8 analizi ⁺ Peptid MHC-I tetramer boyama ile Rhesus macaque maymunlarının T-hücrelerinin

Bu testin genel amacı, aşılama veya primer enfeksiyon ile üretilen Simian İmmün Yetmezlik Virüsüne özgü CD8 pozitif T hücresi popülasyonlarını numaralandırmak ve karakterize etmektir. Bu yöntem, aşılama veya enfeksiyon ile indüklenen antijene özgü CD8 T hücrelerinin sıklığı gibi T hücresi immünolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, in vitro yeniden stimülasyona gerek kalmadan doğrudan ex vivo olarak elde edilen biyolojik örneklerde antijene özgü CD8 T-hücrelerini ölçebilmesidir.

Bu tekniğin etkileri, rhesus makakında insizyona özgü CD8 T hücresinin değerlendirilmesine ve çoklu hastalık ortamlarında CDB T hücresi yanıtlarının incelenmesine kadar uzanır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, rhesus makak MHC genetiği için mevcut olan eksik bilgi ve akış sitometrik boyamanın hassas antikor uygulaması gerektirmesi nedeniyle mücadele edeceklerdir. Rhesus PBMC'yi R10 ortamında yeniden askıya alarak başlayın.

Mililitre konsantrasyon başına yedinci hücrelere 1.6 kez 10 ekleyin. Uygun sayıda akış sitometri tüpüne 50 mikrolitre hücre ekleyin ve her tüpe 50 mikrolitre protein kinaz inhibitörü ekleyin. Her tüpü vorteksleyin ve numuneleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Doğru miktarda titre edilmiş peptit MHC tetramer, tüm deney tüplerini lekelemek için yeterli ana karışım içinde seyreltilmelidir. Bu nedenle, pippetleme hatalarını hesaba katmak için ana karışımın %15'inden fazla bir miktar hazırlamak önemlidir. Hücreler inkübe edilirken, arka plan lekelenmesini en aza indirmek için tetramer çözeltisindeki protein agregatlarını santrifüjleme yoluyla peletleyin.

Daha sonra, tetramerleri yeterli leke tamponunda seyreltin, böylece her bir akış sitometri tüpüne 25 mikrolitre tetramer ana karışımı eklenebilir. Daha sonra numune tüplerini girdaplayın ve PBMC tetramer çözeltilerini karanlıkta, oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, uygun numune tüplerine 50 mikrolitre boyama ana karışımı ekleyin.

Ve girdap için tüpleri karıştırın. Oda sıcaklığında karanlıkta 25 dakika sonra, hücreleri yıkama tamponu ile yıkayın, hücreleri santrifüjleme ile pelet haline getirin ve peletleri rahatsız etmeden süpernatanları dikkatlice boşaltın. Her tüpte kalan tampondaki hücreleri vorteksleyin ve numuneleri tüp başına 250 mikrolitre% 2 paraformaldehit ile sabitleyin.

Tüpleri hemen girdaplayın ve karanlıkta 4 santigrat derecede inkübe edin. 20 dakika sonra, hücreleri taze yıkama tamponunda yıkayın. Hücreleri santrifüjleme ile peletleyin ve peleti bozmadan süpernatanı boşaltın.

Hücreleri 500 mikrolitre geçirgenlik tamponu, girdap içinde tekrar süspanse edin ve karanlıkta 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Sonra hücreleri yıkayın ve peletleyin. Daha sonra süpernatanları daha önce tarif edildiği gibi boşaltın.

Uygun tüplere 50 mikrolitre hücre içi leke ana karışımı eklemeye devam edin. Her numuneyi vorteksleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika inkübe edin. İnkübasyon yapıldıktan sonra, hücreleri yıkayın ve peletleyin.

Numuneler artık bir akış sitometresinde alınmaya hazırdır. Mamu-B017.01 tetramerleri tipik olarak, hücrelerin bir protein kinaz inhibitörü ile ön muamele edilmesiyle önemli ölçüde iyileştirilebilen loş bir boyama verir. Arka plan lekelenmesini önlemek için, ilgilenilen antijene özgü CD8 pozitif T hücresi popülasyonunu içeren veya içermeyen MHC sınıf bir eşleşen hücreler, tetramer pozitif ve negatif CD8 pozitif T hücreleri arasında en iyi ayrımla sonuçlanan optimum miktarı belirlemek için ilgili tetramer ve çoklu seyreltmelerle etiketlenmelidir.

Bu grafiklerde, bir Mamu-A 01 pozitif rhesus makağında aşı kaynaklı Gag CM9 spesifik CD8 pozitif T hücreleri yanıtlarının büyüklüğünü ve hafıza fenotipini analiz etmek için kullanılan geçit stratejisi gösterilmektedir. Tetramer pozitif CD8 pozitif T hücresi popülasyonunun, minimum arka plan boyaması ile iyi bir şekilde ayrıldığına dikkat edin. Ve tetramer kapısı içinde CD28, CCR7 ve Granzyme B ekspresyonları ile açıkça tanımlanan bellek alt kümeleri ile.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa yaklaşık üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, her bir antikor veya tetramer ana karışımına doğru reaktifleri eklemeyi ve her seferinde gösterildiği gibi deney tüpleriyle çalışmayı unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların antijene özgü CD8 T hücrelerinin özgüllüğünü ve fenotipini keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, insan HIV-1 AIDS araştırmasının rhesus makak modelinin tahlilinde bir MHC sınıf bir tetramer boyamanın nasıl kurulacağını iyi anlamış olmalısınız. Rhesus makaklarından elde edilen biyolojik örneklerle çalışmanın, numune işleme sırasında uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi özel önlemler gerektirdiğini unutmayın.