Name: Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Öğrenin büyük spiral-coil proteinlerin kristalleşmesi için hesaplamalı ve deneysel yöntemleri entegre eden bu çerçeveyi. Alan sınırlarını hızlıca belirleyerek kristalleşme başarısını artırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH R01 GM097204 (APV ve JDH) hibesi ile desteklenmiştir. JHM için finansman, bir HHMI Lisans Araştırma Yaz Bursu tarafından sağlandı.

NOT: kavramsal çerçeve ya da iş akışı şeması başvuru için Şekil 1&#39;de açıklanmıştır. hesaplamalı veya sıra tabanlı tahminler, protein ekspresyonu ve saflaştırılması, biyokimyasal karakterizasyonu ve kristalleşme: protokol dört aşamaya bölünebilir. gösterilen örnekler Shroom SD2 etki ve / veya Shroom-kaya kompleksleri analizi, ancak herhangi bir protein ile kullanılabilir. 1. Kullanım Coiled-bobin Alan Sınırları Hesaplamalı Tahminleri oluşturmak için Web tabanlı Araçlar kurulan <ol><li> Dizi homologları bir Evrimsel Farklı Set toplayın. <ol><li> www.uniprot.org gidin ve üst arama çubuğuna Shroom yazın. </li><li> Seç dizileri yanında onların katılım numarasına kutuyu işaretleyerek indirmek için. yıldızla Diziler UniProt tarafından gözden dizileri gösterir ve genellikle daha güvenilirdir. tüm diziler tam ve doğru olmasını sağlamak için özen gösterin. </li><li> Seçilen s kaydetYükle düğmesini tıklayarak equences. </li><li> Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) kullanarak Shroom dizilerinin koleksiyonu aynı hizaya getirin. Gönder itme sonra Shroom dizileri ile dosyayı seçmek için &quot;Browse&quot; düğmesini tıklayın ve. </li><li> Hizalama işlemi tamamlandıktan sonra, &quot;Hizalama İndir Dosya&quot; düğmesini tıklayın. </li><li> (Dosyadan | | Giriş Hizalama Dosyası) Jalview kullanarak 1.1.5 oluşturulan çoklu dizi hizalama açın. (| Yüzde Kimlik Color) kimliği ile yeni hizalama penceresinin, renk içinde. </li></ol></li><li> İkincil yapının tahminler, esnek veya düzensiz dizinin tahminler hesaplayın ve ilgi protein (ler) içinde sarmal-bobin bölgelerini öngördü. <ol><li> Spiral-Coil tahminler hesaplamak için, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj gidin. Kopyala ve Dizi Kutusuna dizisi yapıştırın ve Gönder&#39;i tıklayın. NOT: Bu analiz kompozisyonu birkaç saat sürebilirlete. Shroom sekansları oldukça büyük olduğundan, sekanslar, web sunucusu boyutu kısıtlama uyacak şekilde en az 1000 amino asit bloklar halinde bölünmüş gerekebilir. Shrm2 analiz ederken, bu bölüm, sargılı-sargı bölgesi içerdiği bilinmektedir SHRM SD2 alanını ihtiva 1.000 C-terminal amino asitler kullanılır önerilir. Diğer proteinler ile bu analizi tekrar, mümkün tam boyda bir protein dizilerini kullanmak tavsiye edilir. Bu bir seçenek değilse, bilinen biyokimyasal veya fonksiyonel verilere dayalı diziyi mümkün olan en büyük parçasını kullanabilir veya teşrih. </li><li> Spiral-Coil tahminler hesaplamak için, http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi~~pobj gidin. Kopyala ve Dizi Kutusuna dizisi yapıştırın ve Gönder&#39;i tıklayın. </li></ol></li><li> Shroom dizisinin tek bir kapsamlı açıklama içine 1.2.2 adımlar 1.1 sonuçlarını birleştirin. NOT: son derece de her türlü ilgili i içerecek şekilde teşvik edilmektedirbelirtilen bilgi Literatürde da bu aşamada, protein işlevi veya saflaştırma ile ilgili diğer kaynaklardan çıkarılabilir. </li><li> Bu kapsamlı açıklamalı dizisi kullanarak, koruma maksimize etmek için çalışıyoruz, protein alan sınırları (ya da olası sınırları bir dizi) tahmin ve düzensiz veya esnek dizisinin miktarını en aza indirerek yapısal özelliklerini öngördü. Eğer biliniyorsa, oluşan protein ilgi fonksiyonel özelliklerini muhafaza edilmelidir. </li></ol> Bölüm 1&#39;de Tanımlanan Alan Sınırları 2. Express ve Arındırmak Proteinler NOT: Bu bölümün amacı, Bölüm 1&#39;de oluşturulan hipotetik etki sınırlarını ekrana hızlı ve kolay bir şekilde ölçülebilir deneyleri bir dizi kullanmaktır. <ol><li> Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, His 10 -mRuby2-XH2 plazmid olan çerçeve istenen kodlama dizisinin bir sentezleme plazmidi üretmek (vektör haritası, için Şekil 3&#39;e bakınıznd ek ayrıntılar). </li><li> 18-24 saat boyunca oda sıcaklığında autoinduction ortam 1 BL21 (DE3), E. coli ya da başka uygun bir ifade suşu kullanılarak her bir ifade plazmidi için test ekspresyon seviyeleri. <ol><li> örneğin burada bir (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial gibi hücreler ile birlikte ya da sağlam bir transformasyon protokolü kullanılarak talimatlar aşağıdaki sentezleme plasmidleri ve BL21 (DE3) içine boş plazmid kontrol Dönüşümü -Dönüşüm /). </li><li> Taze dönüştürülmüş plaktan, tek bir koloni almak ve 34 ug / ml kanamisin ile gece boyunca lizojeni Broth&#39;ta 37 ° C (LB) ortamı bir 5 mi Başlangıç ​​kültürünün yetiştirilmesi. </li><li> Ertesi gün, kültür pelet ve taze LB ile pelet yıkayın </li><li> 34 ug / ml kanamisin ile autoinduction ortam, 50 ml başlatıcı kültürün ekleyin. Kültür oda sıcaklığında ya da 37 ° C&#39;de, ya da doygunluk büyümeye olanak sağlar. Tipik olarak, 18-24 saat ~ için büyür. </li><li> Pelet hücresis ve saflaştırmaya süresiz önce -80 ° C &#39;de elde edilen hücre pelletleri dondurma. </li><li> en verimli istenen füzyon proteinini üreten soy belirlemek için her sentezleme gerilme ve SDS-PAGE ile, boş vektör kontrol alınmış bütün hücre özütleri karşılaştır. Onun 10 -mRuby2-Shroom SD2 füzyon proteinleri için, 50 dakika ~ ya da boya cephesinin, jel 22 alt ulaşıncaya kadar 180 V,% 10 SDS-PAGE jellerinin çalıştırın. </li><li> Coomassie Mavisi ile Leke jel her bir suş 23 içinde toplam hücresel protein görselleştirmek için. </li></ol></li><li> başarılı bir şekilde mRuby2-füzyon proteinini ifade her bir suş ile ilgili bir ilk afinite kromatografi aşamasında gerçekleştirin. Tipik haliyle, protein, 4 ° C de saflaştırma gibi değişen koşullara yararlanacaktır sürece saflaştırma, oda sıcaklığında 2.3.2-2.3.7 adımları gerçekleştirmek. <ol><li> Aşama 2.2.5 gelen çözülme hücre topakları. </li><li> liziz tamponu (% 10 gliserol, 500 mM NaCI, 40, 1.5 ml, her hücre pelletinimM imidazol, 20 mM Tris pH 8.0, 1 mM p-merkaptoetanol). uygun protez önleyicileri ile liziz tamponu Ek. </li><li> 10 mg / ml lizozim, 30 ul ilave edin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. enstrüman için yönergeleri izleyerek sonikasyon kullanılır. </li><li> çözünmeyen materyal ya da çözünen hücreler pelet 14,000 x g&#39;de 30 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içinde 1.5 ml tüp ve santrifüj içine aktarın. SDS-PAGE yoluyla sonraki analiz için supernatant ve pelet hem kaydedin. </li><li> Ni-NTA boncuk 100 uL eriyebilir kısma kuluçkalanması, nikel afinite saflaştırma gerçekleştirmek. boncuk karıştırmak için birkaç kez ters yüz, 5-10 dakika boyunca Çözünür lizat boncuk inkübe edin. </li><li> boncuk pelet bir masaüstü santrifüj 30 saniye boyunca 800 x g&#39;de santrifüjleyin. non-spesifik kirleticiler temizlemek için lizis tamponu ile pelet 3-5 kez yıkayarak bu izleyin. </li><li> liziz tamponu ile boncuk elute Ruby füzyon proteini 1 ile desteklenmişM imidazol. </li><li> Yukarıda &quot;hızlı ve kirli&quot; saflaştırma His-mRuby2-Shroom proteinlerinin davranışını karşılaştırmak için SDS-PAGE kullanın. </li></ol></li></ol> 3. karakterize Protein Numune Avantajlı özellikleri olanlar tanımak <ol><li> Yakut füzyon proteini konsantrasyonunu ölçmek ve sonra da ana PAGE jeli 24 üzerinde füzyon proteininin 1-5 ug yükleme numunenin homojenliğini değerlendirmek için 280 nm&#39;de bir spektrofotometre seti kullanın. 175 V 140 dakika boyunca, 4 ° C&#39;de,% 10 yerel PAGE jel üzerinde çalıştırıldı <ol><li> Görüntü mruby-etiketli füzyon bu testte göç nerede gözlemleyerek, floresan görselleştirmek için donanımlı bir görüntüleyici kullanarak yerel SAYFA. NOT: Bu proteinin muhtemelen toplandığında sıra kalmış füzyon proteini gözlemlemek için dikkatli olun. Bir floresan görüntüleme mevcut değilse, bir çoğu görselleştirmek ve Ruby görüntü konsantre örnekleri siyah ışık altında ya da bir UV ışık kutusu ile protein etiketledi. </li></ol></li><li> stabil katlanmış etki tespit etmek sınırlı proteoliz gerçekleştirin. % 0.025 subtilisin A. 5 ul / ~ 1 mg ml Ruby-SHRM SD2 füzyon 95 ul inkübe <ol><li> zaman noktalarında reaksiyonu Örnek 0, 0.5, 2, 5, 15, 60 ve 120 dakika sonra, her bir zaman noktası için reaksiyonundan 10 ul çıkarılması ve% 15 akrilamid jel kullanılarak, SDS-PAGE yoluyla tepkimenin ilerleyişinin görüntülenmesi . </li><li> Adım 2.2.7 olarak Coomassie Mavisi ile leke ve bir proteaz dirençli türler tespit edilebilir olup olmadığını değerlendirir. </li></ol></li><li> çözelti, bu proteinlerin genel davranışı hakkında kapsamlı bir değerlendirme olarak, kısmen saflaştırılmış mRuby2-Shroom füzyon proteinlerinin üzerinde saflaştırma verimi, davranış yerel PAGE ve sınırlı proteoliz veri entegre. <ol><li> Uygun fonksiyonel tahlil varsa (İsteğe bağlı), bu noktada etkinlik için kontrol edin. </li></ol></li></ol> 4. Coiled-coil SD2 Yüksek Kalite Kristaller ÜretenShroom Etki Alanı Not: Protein, genellikle farklı sıcaklıkta saflaştırma 4 ° C yararlanacak sürece bölüm 4.1 içinde Bütün aşamalar oda sıcaklığında gerçekleştirilir. <ol><li> İfade ve saflaştırma potansiyeli kaba bir tahmin olarak 50 mi büyümeleri kullanarak, tamamen saflaştırılmış örnek 5-20 mg elde etme amacı ile mRuby2-Shroom SD2 büyük ölçekli ifadeleri gerçekleştirin. Tipik olarak kültür 2L yeterli başlangıç ​​malzemesi sağlar. 10 dakika için 8000 x g&#39;de santrifüjleme ile büyüme pelet sonra hücreler. <ol><li> liziz için lizozim kullanılarak donmuş hücre peleti gramı başına liziz ~ 2 ml kullanılarak, daha önce parçalama tamponu içinde 2 L büyüme pelletini. Alternatif olarak, ~ 8 ml / g pelet de tekrar süspansiyon bir homojenleştirici veya Fransızca basın kullanarak eğer. 30 dakika süre ile 30,000 x g&#39;de santrifüj ile hücre yıkıntıları pelet haline. </li><li> Toplu Ni-NTA reçinesi 10 ml kullanılarak 4.1.1 çözünür fraksiyonu bağlanır. Uygun yerçekimi sütunu içine dökünve ilişkisiz proteinler boşalmasını sağlayın. </li><li> Yıkama, 1 M NaCl ilave lizis tamponu ile yıkama, ardından liziz tamponu, 40 ml ile 3-5 kez reçine. </li><li> 80 mM imidazol ile takviye liziz tamponu, 40 ml ile yıkayın reçinesi. </li><li> 1 M imidazol ilave lizis tamponu 40 ml Ruby Shroom füzyon proteinini ayrıştırmak. El 4-10 ml&#39;lik kısımlar halinde elüt protein fraksiyonlanması. </li><li> % 10 SDS-PAGE kullanılarak Ruby-Shroom füzyon proteinini ihtiva eden fraksiyonlar teyit edin. </li><li> % 8 gliserol, 250 mM NaCI, 15 mM imidazol, 20 mM Tris pH 8.0 içinde (tipik olarak 2-4 kısım), uygun fraksiyonlar Dialyze, 1 mM β-ME 6-8 kDa&#39;lık bir MWCO diyaliz tüpü kullanılarak. Füzyon proteininin her 25-50 mg TEV proteaz 1 mg ekleyin. Yavaş karıştırma ile gece boyunca oda sıcaklığında dialyze. </li><li> Tekrarlama nikel yakınlık arıtma 4.1.2 adımları. 4.1.6 için. Onun 10 -mRuby2 bağlı kalır iken Shroom SD2 alanı artık ilişkisiz fraksiyon kalmalıdırReçine ve elüsyon fraksiyonlarında bulunur. Coomassie Mavisi ile bu kullanarak% 12 SDS-PAGE boyama onaylayın. </li><li> % 8 gliserol, 100 mM NaCl, 5 mM p-merkaptoetanol tamponu, gece boyunca 20 mM Tris, pH 8.0 içine Shroom SD2 domenini ihtiva eden fraksiyonlar dialyze. </li><li> Bir FPLC kullanılması ile anyon değişim kromatografisi 25 gerçekleştirin ve 0.1-1.0 M NaCI bir NaCI gradyanı ile elüt edilerek kromatograflanmıştır. % 12 SDS-PAGE kullanılarak kesirler analiz edin. </li><li> Bir spin konsantratör (10. kDa&#39;lık bir MWCO veya daha proteini çalışılan bağlı olarak),% 12 SDS-PAGE ile zirve fraksiyonları analiz ~ 0 mg / ml, ve daha sonra, boyut dışlama kromatografisi 26 gerçekleştirmek için pik fraksiyonlar konsantre edilir. </li><li> Havuz tepe fraksiyonları ve 20 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCI,% 2 gliserol içine diyaliz 1 mM β-ME ve / ml kristalleştirmeden önce 10 mg konsantre edilir. İsteğe bağlı: Bu adımda, bir konsantrasyonda 5 ul numune kaldırma 1, 2, 5, ve 10 mg / ml lik bir numuneyi konsantre sırasında.Bu adım sırasında, örneğin davranış bakmak her numunenin bir nativ PAGE yükleme 2-5 ul çalıştırın. </li></ol></li><li> kristallendirme çalışmalarında için en uygun protein konsantrasyonunun tespit etmek 12 koşulları küçük dizisi taramasında. Bu koşulların bileşim olup, Şekil 7&#39;de tarif edilmektedir. <ol><li> Buhar difüzyon yönteminde, pipetleme ile kristalizasyon denemeler gerçekleştirmek 24-çukurlu, kuluçka süresi, damla kristalleştirme tepsileri, ilk başta çözelti 1 ul lamelleri protein örneğinin 1 ul içeren damlalar, ardından ayrı bir kuyu içine 12 koşullarının her birinin 500 ul . Bu teknikle ilgili ek bilgi için 27 bakınız. </li><li> Hızla şeffaf bir bantla tepsiyi mühür ve titreşimsiz bir uygun sıcaklık kontrollü bir ortamda kaseti taşıyın. değişebilir kullanılan sıcaklık, ancak 4 ° C, 16 ° C ve 20 ° C oldukça yaygındır. </li><li> Sonraki 3 gün boyunca tepsilere damla incelemek100X büyütme kadar bir mikroskop kullanılarak ays. 3 günlük dönemin sonunda, hiçbir yağış (net), hafif yağış, ağır yağış (kahverengi), ya da kristaller içeren her damla puan. Uygun bir protein konsantrasyonu en fazla 6, ağır çökeltilerin içermelidir. </li><li> 4.2 tanımlanan protein konsantrasyonu, ticari olarak temin edilebilir kristalizasyon ekranlar geniş bir ekran. Ayrıca damla hatayı en aza indirerek bir sıvı taşıma veya kristalleşme robotun kullanımı büyük ölçüde bu süreci hızlandırır. Bu kullanıcı tek bir örnek ile daha fazla koşul ekrana izin, hem de çok daha az protein gerektirir. </li><li> sistematik olarak daha önce 24-iyi tarama tepsileri kullanarak kristalleşme damla içinde değişkenlerin her değiştirerek geniş ekranlarından tespit başlangıç ​​koşullarını iyileştirmek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
<li>Studier, F. W., Moffatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+RNA+polymerase+to+direct+selective+high-level+expression+of+cloned+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.</a> J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).</li>
<li>Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification%3A+pure+but+not+simple%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein purification: pure but not simple.</a> Nature. 434 (7034), 795-798 (2005).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+coiled+coils+from+protein+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Predicting coiled coils from protein sequences.</a> Science. 252 (5009), 1162-1164 (1991).</li>
<li>Offer, G., Hicks, M. R., Woolfson, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+Crick+equations+for+modeling+noncanonical+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Generalized Crick equations for modeling noncanonical coiled coils.</a> J Struct Biol. 137 (1-2), 41-53 (2002).</li>
<li>Lupas, A. N., Gruber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+alpha-helical+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">The structure of alpha-helical coiled coils.</a> Adv Protein Chem. 70, 37-78 (2005).</li>
<li>Hernandez Alvarez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+expression+system+for+protein+crystallization+using+trimeric+coiled-coil+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Des+Sel%22%5BJournal%5D)">A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors.</a> Protein Eng Des Sel. 21 (1), 11-18 (2008).</li>
<li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+protein+structure+determination--lessons+from+structural+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The challenge of protein structure determination--lessons from structural genomics.</a> Protein Sci. 16 (11), 2472-2482 (2007).</li>
<li>Slabinski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XtalPred%3A+a+web+server+for+prediction+of+protein+crystallizability%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">XtalPred: a web server for prediction of protein crystallizability.</a> Bioinformatics. 23 (24), 3403-3405 (2007).</li>
<li>Haigo, S. L., Hildebrand, J. D., Harland, R. M., Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom+induces+apical+constriction+and+is+required+for+hingepoint+formation+during+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shroom induces apical constriction and is required for hingepoint formation during neural tube closure.</a> Curr Biol. 13 (24), 2125-2137 (2003).</li>
<li>Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom+regulates+epithelial+cell+shape+via+the+apical+positioning+of+an+actomyosin+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Shroom regulates epithelial cell shape via the apical positioning of an actomyosin network.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 22), 5191-5203 (2005).</li>
<li>Dietz, M. L., Bernaciak, T. M., Vendetti, F., Kielec, J. M., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+actin-dependent+localization+modulates+the+evolutionarily+conserved+activity+of+Shroom+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential actin-dependent localization modulates the evolutionarily conserved activity of Shroom family proteins.</a> J Biol Chem. 281 (29), 20542-20554 (2006).</li>
<li>Bolinger, C., Zasadil, L., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+isoforms+of+drosophila+shroom+define+spatial+requirements+for+the+induction+of+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Specific isoforms of drosophila shroom define spatial requirements for the induction of apical constriction.</a> Dev Dyn. 239 (7), 2078-2093 (2010).</li>
<li>Farber, M. J., Rizaldy, R., Hildebrand, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shroom2+regulates+contractility+to+control+endothelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Shroom2 regulates contractility to control endothelial morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 22 (6), 795-805 (2011).</li>
<li>Das, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+Shroom3+and+Rho-kinase+is+required+for+neural+tube+morphogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">The interaction between Shroom3 and Rho-kinase is required for neural tube morphogenesis in mice.</a> Biol Open. 3 (9), 850-860 (2014).</li>
<li>Dvorsky, R., Blumenstein, L., Vetter, I. R., Ahmadian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+interaction+of+ROCKI+with+the+switch+regions+of+RhoA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the interaction of ROCKI with the switch regions of RhoA.</a> J Biol Chem. 279 (8), 7098-7104 (2004).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+highly+conserved+domain+of+Rock1+required+for+Shroom-mediated+regulation+of+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structure of a highly conserved domain of Rock1 required for Shroom-mediated regulation of cell morphology.</a> PLoS One. 8 (12), e81075(2013).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+Shroom+domain+2+reveals+a+three-segmented+coiled-coil+required+for+dimerization%2C+Rock+binding%2C+and+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of Shroom domain 2 reveals a three-segmented coiled-coil required for dimerization, Rock binding, and apical constriction.</a> Mol Biol Cell. 23 (11), 2131-2142 (2012).</li>
<li>Tu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+coiled-coil+domain+from+human+ROCK+I%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a coiled-coil domain from human ROCK I.</a> PLoS One. 6 (3), e18080(2011).</li>
<li>Sievers, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Mol Syst Biol. 7, 539(2011).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Diezel, W., Kopperschlager, G., Hofmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+protein+staining+in+polyacrylamide+gels+with+a+new+type+of+Coomassie+Brilliant+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for protein staining in polyacrylamide gels with a new type of Coomassie Brilliant Blue.</a> Anal Biochem. 48 (2), 617-620 (1972).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li>
<li>Jungbauer, A., Hahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-exchange+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Ion-exchange chromatography.</a> Methods Enzymol. 463, 349-371 (2009).</li>
<li>Yu, C. M., Mun, S., Wang, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+the+effects+of+reversible+dimerization+in+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of the effects of reversible dimerization in size exclusion chromatography.</a> J Chromatogr A. 1132 (1-2), 98-108 (2006).</li>
<li>Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+historical+perspective+on+protein+crystallization+from+1840+to+the+present+day%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A historical perspective on protein crystallization from 1840 to the present day.</a> FEBS J. 280 (24), 6456-6497 (2013).</li>
<li>Lobley, A., Sadowski, M. I., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGenTHREADER+and+pDomTHREADER%3A+new+methods+for+improved+protein+fold+recognition+and+superfamily+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">pGenTHREADER and pDomTHREADER: new methods for improved protein fold recognition and superfamily discrimination.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1761-1767 (2009).</li>
<li>Marsden, R. L., McGuffin, L. J., Jones, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+protein+domain+assignment+from+amino+acid+sequence+using+predicted+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid protein domain assignment from amino acid sequence using predicted secondary structure.</a> Protein Sci. 11 (12), 2814-2824 (2002).</li>
<li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling%2C+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).</li>
<li>Elsliger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JCSG+high-throughput+structural+biology+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">The JCSG high-throughput structural biology pipeline.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 66 (Pt 10), 1137-1142 (2010).</li>
<li>Bach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+maltose-binding+protein+as+a+molecular+chaperone+for+recombinant+intracellular+cytoplasmic+single-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single-chain antibodies.</a> J Mol Biol. 312 (1), 79-93 (2001).</li>
<li>Strong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+structural+genomics+of+complexes%3A+crystal+structure+of+a+PE%2FPPE+protein+complex+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8060-8065 (2006).</li>
<li>Heras, B., Martin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-crystallization+treatments+for+improving+diffraction+quality+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Post-crystallization treatments for improving diffraction quality of protein crystals.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 9), 1173-1180 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada açıklanan protokol kullanıcı kristalleşme kolaylaştırmak için büyük sarmal-coil proteinler içinde etki alanı sınırları belirlemeye yardımcı olmak için tasarlanmıştır. protokol potansiyel etki alanı sınırları bir dizi oluşturmak için hesaplamalı tahminler ve diğer kaynaklardan gelen verilerin çeşitli bütünsel dahil dayanır. Bu hızlı ve ucuz ve daha bu ilk hipotezleri geliştirmek için kullanılan biyokimyasal deneyler bir dizi tarafından takip edilmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, kullanıcının hızlı istenmeyen pota...

X-ışını kristalografisi yoluyla yapı tayini modern biyolojinin her alanda temel katkılarda bulunmuştur; yaşamı destekleyen ve çeşitli bağlamlarda birbirleriyle nasıl etkileşimde makromoleküllerin bir atom bir görünüm sağlayan; Hastalık ve sağlayan fırsatlar rasyonel hastalığı tedavi etmek için ilaçlar tasarlamaya neden mekanizmaları anlamak için bize izin. Kristalografi uzun makromoleküler yapısını belirlemek için baskın deneysel teknik olmuştur ve şu anda yapısal veritabanı (www.rcsb.org) içinde% 89.3 hesapları vardır. Bu teknik çok yüksek çözünürlükte potansiyeli dahil olmak üzere birçok avantajı vardır, bir boyutlarda geniş, nispeten kolay veri toplama ve makromolekül çözücü yanı sıra ligandlar nasıl etkileşimde görselleştirmek için fırsat makromolekülleri görselleştirmek için yeteneği. Rekombinant protein ifadesi 1,2, pur sayısız teknolojik gelişmelere rağmenification 3 ve bu sistemleri 4, kristalografik süreçte tek en büyük engel oluşturmak için kullanılan moleküler biyoloji kırınım kaliteli kristaller büyümeye yeteneği kalır. Bu büyük sarmal-coil etki içermeyen protein için özellikle doğrudur olmuştur. Tüm amino asitler kadar 5%, bu çok ortak yapısal özelliği 7 hale sarılmış bobinler 5,6 içinde bulunan olduğu tahmin, ancak bu proteinler çoğu zaman arındırmak ve küresel proteinlerin 8-10 den kristalize etmek daha zordur edilmiştir . Bu ayrıca sarılmış bobin etki genellikle bu nedenle doğru sık kristalleşme için zararlı olduğunu yapılandırılmamış veya esnek dizisinin oluşumunu önlemek için önemlidir bu alanların sınırlarını tahmin, daha büyük bir proteinin kapsamında bulunduğu gerçeğine ile birleşir. Burada birleştiren kavramsal bir çerçeve sunmak web tabanlı hesaplama experimenta analizleryapısal çalışmalar ve nasıl hazırlamak ve kristalleşme girişimleri öncesinde protein örneklerinin karakterize etmek için protein parçası (ler) nasıl seçileceğini: tezgah l veri kristalografik sürecinin ilk aşamalarında dahil yoluyla kılavuz kullanıcılara yardımcı olmak için. Biz büyük sarmal-coil alanlarını içeren iki protein üzerinde analizimizi odaklanmak, Shroom (SHRM) ve Rho-kinaz (Rock). Her ikisi de halkalaştırılmış halka alanları içerir ve biyolojik olarak alakalı kompleks 11-16 oluşturulması için bilinen bu proteinleri seçilmiştir. Shroom ve Rho-kinaz (Rock), sırasıyla sarılmış-bobinin ~ 200 ve 680 artıkları tahmin edilen, çok sayıda kısımları, yapısal olarak 17-20 karakterize edilmiştir. Burada tarif edilen yöntem, hızlı bir şekilde kristalleşme için müsait olacak halkalı-halka ihtiva eden protein parçalarını tanımlamak için bir iş akışı sağlanmakta, ancak tarif edilen teknikler kolayca en protein veya protein-kompleksleri için uyarlanmış veya yüksek verimli arayışlara dahil etmek üzere modifiye edilebilirches olarak kullanılabilir. Son olarak, bu yöntemler, pahalı olmayan ve hemen hemen tüm seviyeden kullanıcılar tarafından gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>BL21 (DE3) Rosetta</td><td>Emd Millipore</td><td>70954-3</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Yıldız</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Codon Plus</td><td>Agilent Teknolojileri</td><td>230245</td><td></td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Spektrum Kimyasal Mfg Corp</td><td>L3008-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA reçine</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25216</td><td></td></tr><tr><td>SubtilisinA</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>S1211-10ML</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu Cryschem Plate</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR3-160</td><td></td></tr><tr><td>INTELLI-PLATE &nbsp; 96:</td> <td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR2-515</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton araştırması</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Yoca-mRuby2</td><td>Addgene</td><td>49089</td><td></td></tr><tr><td>Gecelik Ekspres Otoindüksiyon Sistemi 1</td><td>Emd Millipore</td><td>71300</td><td></td></tr><tr><td>Lizojen Et Suyu tozu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12795027&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

islak ve kuru lab teknikleri birleştiren büyük spiral-coil İçeren proteinler kristalleşmesini kılavuzu

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Yapı tayini için kristaller elde etmek, herhangi bir protein için zor ve zaman alıcı bir öneri olabilir. Sarmal bobin proteinleri ve alanları doğada bulunur, ancak fiziksel özellikleri ve toplanma eğilimleri nedeniyle, geleneksel olarak kristalleşmelerinin özellikle zor olduğu görülür. Burada, belirli bir sarmal bobin proteini için bir dizi olası alan sınırını tanımlamak için tasarlanmış çeşitli hızlı ve basit teknikler kullanıyoruz ve daha sonra bu proteinlerin çözelti içindeki davranışını hızlı bir şekilde karakterize ediyoruz. Güçlü bir floresan etiketinin (mRuby2) eklenmesiyle, protein karakterizasyonu basit ve anlaşılırdır. Hedef protein, normal aydınlatma altında kolayca görselleştirilebilir ve uygun bir görüntüleyici kullanılarak ölçülebilir. Amaç, başarılı olma olasılıkları düşük olduğu için kristalizasyon hattından çıkarılabilecek adayları hızlı bir şekilde belirlemek, en iyi adaylar için daha fazla zaman sağlamak ve kristal üretmeyen proteinlere daha az fon harcanmasını sağlamaktır. Bu proses, ilk tarama çabalarından elde edilen bilgileri içerecek şekilde yinelenebilir, yüksek verimli ekspresyon ve saflaştırma prosedürleri için uyarlanabilir ve kristalizasyon için robotik tarama ile artırılabilir.

Bu sistemde kullanılan iş akışı gösteren bir diyagram Şekil 1'de gösterildiği ve üç ana aşamadan içerir. dizinin Hesaplamalı analiz ilgi sarmal-bobin proteinin etki alanı sınırları konusunda hipotezler geliştirmek için kullanılmaktadır. Shrm2 SD2 alanının açıklamalı bir analizinin bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu diyagramda, hedef Shroom SD2 adı sitoskeletal regülatör C-terminusunda korunmuş bir alan için olası etki sınırlarını tespit etmek olmu...

Büyük sarmal bobin alanlarının karakterizasyonuna ve kristalizasyonuna rehberlik etmek için basit biyokimyasal ve hesaplamalı analizi içeren bir çerçeve tanımlıyoruz. Bu çerçeve, küresel proteinler için uyarlanabilir veya çeşitli yüksek verimli teknikleri içerecek şekilde genişletilebilir.

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Bu prosedürün genel amacı, kristalleşecek içsel bir parça bulma olasılığını artırmak için büyük sarmal bobin proteinleri içindeki olası alan sınırlarını hızlı bir şekilde belirlemek ve test etmektir. Bu yöntem, araştırmacıların, kristalleşmesi çok zor olabilen büyük sarmal bobin proteinleri için kristalleşme sürecini kolaylaştırmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, kristalleşme için olası adayları hızlı bir şekilde belirlemek ve taramak için hem deneysel hem de hesaplama yöntemlerini entegre etmesi ve böylece başarı şanslarını artırmasıdır.Bu tekniği göstermek, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Jenna Zalewski ve laboratuvarımda lisans araştırmacısı olan Keith O'Conor olacak. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi olası sarmal bobin etki alanı sınırlarının tahminlerini oluşturmak için yerleşik web tabanlı araçlardan elde edilen çıktıları birleştirin. İfade plazmitleri oluşturduktan ve metinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ifade seviyelerini test ettikten sonra, Ruby etiketli proteini başarıyla ifade eden her bir suşun saflaştırılmasına başlayın.Hücreleri parçalamak için, önce çözülmüş her hücre peletini proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş 1.5 mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda 30 mikrolitre lizozim ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin, ardından kullanılan aletin talimatlarını izleyerek sonikasyon yapın. Numuneyi, çözünmeyen materyali veya parçalanmamış hücreleri peletlemek için 14.000 kez G'de 30 dakika boyunca bir masa üstü santrifüjde santrifüjleyin.SDS-PAGE aracılığıyla sonraki analizler için hem süpernatanı hem de peleti saklayın. Nikel afinite saflaştırmasını gerçekleştirmek için, önce 100 mikrolitre nikel NTA boncuklarını inkübe edin, lizis tamponunda çözünebilir lizat ile beş ila 10 dakika önceden yıkanın. Boncukları karıştırmak için süspansiyonu birkaç kez ters çevirin.Boncukları peletlemek için numuneyi bir masa üstü santrifüjde 30 saniye boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin. Bunu, spesifik olmayan kirleticileri temizlemek için peleti lizis tamponu ile üç ila beş kez yıkayarak takip edin. Son olarak, bir molar imidazol ile desteklenmiş lizis tamponu ile boncuklardan Ruby füzyon proteinini çıkarın.Ruby füzyon proteininin konsantrasyonunu ölçmek için 280 nanometreye ayarlanmış bir spektrofotometre kullanın, ardından doğal bir PAGE jeline bir ila beş mikrogram füzyon proteini yükleyerek numunenin homojenliğini değerlendirin. %10 doğal PAGE jelini dört santigrat derecede 140 voltta 175 dakika çalıştırın. Floresanı görselleştirmek için donatılmış bir görüntüleyici kullanarak yerel SAYFAYI görüntüleyin ve Ruby etiketli füzyonun bu tahlilde nereye göç ettiğini gözlemleyin.Önce 95 mikrolitre Ruby-Shroom SD2 füzyonunu beş mikrolitre 0.025 Subtilisin A ile inkübe ederek stabil şekilde katlanmış alanları tanımlamak için sınırlı proteoliz gerçekleştirin. Reaksiyonu sıfır, 0.5, iki, beş, 15, 60 ve 120 dakikalık zaman noktalarında örnekleyin, her zaman noktası için reaksiyondan 10 mikrolitre çıkarın ve reaksiyonun ilerlemesini %15 akrilamid jel kullanarak SDS-PAGE aracılığıyla görselleştirin. Proteaza dirençli bir türün tanımlanıp tanımlanamayacağını değerlendirmek için jeli Coomassie mavisi ile boyayın. Saflaştırma verimliliğinden, doğal PAGE'deki davranıştan ve kısmen saflaştırılmış mRuby2-Shroom füzyon proteinleri üzerindeki sınırlı proteolizden elde edilen verileri, bu proteinlerin çözeltideki genel davranışının kapsamlı bir değerlendirmesine entegre edin.Beş ila 20 miligram tamamen saflaştırılmış numune elde etmek amacıyla iki litrelik mRuby2-Shroom SD2 kültürleri ile büyük ölçekli ifadeler gerçekleştirin. Hücre büyümesini takiben, hücreleri 10 dakika boyunca 8.000 kez G'de santrifüjleme ile peletleyin. Elde edilen hücre peleti, ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir.Daha sonra, peleti, donmuş hücre peletinin gramı başına yaklaşık sekiz mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Bir homojenizatör kullanarak yeniden süspanse edilmiş hücreleri parçalayın. Hücre lizizini takiben, hücresel kalıntıları 30 dakika boyunca 30.000 kez G'de santrifüjleme yoluyla peletleyin.Daha sonra, 10 mililitre önceden yıkanmış nikel NTA reçinesi kullanarak çözünür fraksiyonu toplu olarak bağlayın. Boncuk süspansiyonunu uygun bir yerçekimi kolonuna dökün ve bağlanmamış proteinlerin boşalmasına izin verin, ardından reçineyi 40 mililitre lizis tamponu ile üç ila beş kez yıkayın, ardından bir molar sodyum klorür ile takviye edilmiş lizis tamponu ile yıkayın. Reçinenin, 80 milimolar imidazol ile desteklenmiş 40 mililitre lizis tamponu ile son bir yıkamasını gerçekleştirin.Ruby-Shroom füzyon proteinini, bir molar imidazol içeren 40 mililitre lizis tamponu ile elute edin. Ayrıştırılmış proteini manuel olarak dört ila 10 mililitrelik fraksiyonlara ayırın. %10 SDS-PAGE jeli kullanarak Ruby-Shroom füzyon proteini içeren fraksiyonları onaylayın.Ruby etiketini çıkarmak için her 25 ila 50 miligram füzyon proteini için bir miligram TEV proteaz ekleyin. Daha sonra, altı ila sekiz kilodalton moleküler ağırlıklı kesme diyaliz tüpü kullanarak uygun fraksiyonları TEV bölünme tamponuna diyaliz edin. Proteini gece boyunca oda sıcaklığında yavaş karıştırarak diyalize edin.Diyalizden sonra, nikel afinite saflaştırma adımlarını tekrarlayın. Shroom-SD2 alanı, Ruby etiketi reçineye bağlı kalırken bağlanmamış fraksiyona akmalıdır. Bir spin yoğunlaştırıcı kullanarak, tepe fraksiyonlarını mililitre başına yaklaşık 10 miligrama konsantre edin, ardından %12'lik bir SDS-PAGE jeli ile tepe fraksiyonlarını analiz eden boyut dışlama kromatografisi gerçekleştirin.Tepe fraksiyonlarını bir araya getirdikten sonra, çözeltiyi kristalizasyon tamponuna diyalize edin, ardından diyaliz proteinini kristalizasyondan önce mililitre başına 10 miligrama konsantre edin. Kristalizasyon denemeleri için en uygun protein konsantrasyonunu belirlemek için 24 iyi oturan damla kristalizasyon tepsisi kullanarak 12 koşuldan oluşan küçük bir diziyi tarayın. Buhar difüzyon yöntemini kullanarak kristalizasyon denemeleri yapın.İlk olarak, 12 koşulun her birinden 500 mikrolitreyi ayrı kuyucuklara pipetleyin. Her kaide üzerinde, bir mikrolitre kuyu çözeltisi ve bir mikrolitre protein örneği içeren damlalar yapın. Tepsiyi şeffaf bantla hızlı bir şekilde kapatın, ardından tepsiyi titreşimsiz, sıcaklık kontrollü uygun bir ortama taşıyın.Önümüzdeki üç gün boyunca tepsilerdeki damlaları 100X'e kadar büyütmede bir mikroskop kullanarak inceleyin. Üç günlük sürenin sonunda, her damlayı yağış, hafif yağış, yoğun yağış veya kristal içermeyecek şekilde puanlayın. Uygun bir protein konsantrasyonu altıdan fazla ağır yağış içermemelidir.Belirlenen protein konsantrasyonunu kullanarak, ticari olarak temin edilebilen çok çeşitli kristalizasyon eleklerini eleyin. Bir sıvı işleme veya kristalizasyon robotunun kullanılması, bu işlemi büyük ölçüde hızlandırırken aynı zamanda damlalardaki hatayı en aza indirir. Çok daha az protein gerektirir ve kullanıcının tek bir örnekle daha fazla koşulu taramasına olanak tanır.Daha önce olduğu gibi 24 kuyulu elek tepsisi kullanarak kristalleşme damlası içindeki değişkenlerin her birini sistematik olarak değiştirerek geniş ekranlardan tanımlanan başlangıç koşullarını iyileştirin. Sınırlı proteoliz, proteinin esnek olabilecek veya proteaz için daha erişilebilir olabilecek bölgelerini tanımlamak için kullanılır. Burada, proteolitik olarak hassas olan bir SD2 alanı ve oldukça kararlı olan bir başka alan için bir bozunma modeli gösterilmektedir.Ruby füzyon proteinleri bağlamında sınırlı proteoliz gerçekleştirildi. Bu durumda, Ruby ve SD2 alanı arasındaki bağlayıcı dizisi beklendiği gibi hızlı bir şekilde bölündü, ancak ortaya çıkan Ruby ve SD2 parçaları büyük ölçüde sabit kaldı. Yerel PAGE ile yapılan analizler, kristalleşme için iyi adayları hızlı bir şekilde ortaya çıkarabilir.Farklı protein pillerine sahip dört Shroom-Rock kompleksi, yerel PAGE jelleri üzerinde çalıştırıldı. Kaya 834 ila 913'ü içeren kompleks en iyi davranışa sahipti ve kolayca kristalleşti, diğerleri ise sadece bozunma sırasında kristalleşti veya tamamen kristalleşemedi. Bu videoyu izledikten sonra, büyük sarmal bobin proteininiz için bir dizi potansiyel alan sınırının nasıl geliştirileceğini ve kristalleşme için en iyi adayları hızlı ve hızlı bir şekilde belirlemek için Ruby sistemini nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.Kristalografi zaman alıcı bir çaba olmaya devam etse de, bu tekniği kullanmak, zayıf adayları elemek için basit tahliller kullanarak kristalleşecek proteinleri aramaya odaklanacak ve başarı şansı daha yüksek olan adaylar üzerinde daha fazla zaman harcamanıza olanak tanıyacaktır. Bu yordamı denerken, olası etki alanı sınırlarınızı seçerken mümkün olduğunca fazla bilgi eklemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü kullanırken seçmeyi seçtiğiniz bilgiler her protein için değişecektir.Mümkünse, söz konusu protein parçalarının hala biyolojik ilgi işlevini içerdiğinden emin olmak için hücre bazlı veya biyokimyasal tahliller gibi diğer yöntemler uygulanmalıdır. Bu yöntem sarmal bobin proteinlerine odaklanmış olsa da, genel çerçeve hemen hemen her protein için kolayca uyarlanabilir. Belirli enstrümantasyon ve biyolojik reaktiflerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven kullanmak veya koruyucu gözlük takmak gibi önlemlere her zaman uyulması gerektiğini unutmayın.

combining-wet-dry-lab-techniques-to-guide-crystallization-large

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

3-D bir molekül yapısı molekül fonksiyonları nasıl eşsiz bir anlayış sağlar. Yakın atomik çözünürlükte yapı tespiti için temel yöntem, X-ışını kristalografisi. Burada, X-ışını kristalografisi yapı tayini için uygun olan herhangi bir makromolekül üç boyutlu kristaller elde etmek için mevcut yöntemler göstermektedir.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Protokolleri LCP kristalizasyon denemeler ve hasat kristalleri kurma, LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testlerin başlangıç ​​koşulları bulma lipidik kübik bir fazlı (LCP) protein, sulandırıldıktan itibaren bir membran proteini kırınım kaliteli kristaller elde etmek için gerekli adımları açıklar .

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Bicelles, bir çift katlı lipid içinde membran proteinleri (MP) korumak değil, kristalizasyon, robotlar tarafından yüksek verimlilik tarama kolaylaştıran benzersiz faz davranışları lipid / amphiphile karışımları. Bu teknik hem prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan başarıyla yüksek çözünürlüklü yapıların bir dizi üretti. Bu video lipidik bicelle karışımı üretmek için orta crystallizations çalışmalar (manuel olarak robot gibi) ve hasat kristalleri kurma, bicelle karışımı içine milletvekilleri...

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Yapı-esaslı ecza tasarımı ilaç gelişmesinde önemli bir rol oynar. Paralel olarak birden çok hedef edinerek büyük ölçüde kurşun keşfi için başarı şansını artırır. Aşağıdaki makale Enfeksiyon Hastalıkları için Seattle Yapısal Genomik Merkezi PB2 influenza A alt birimi gen-için-yapı tayini için bir çoklu hedef yaklaşım kullanır nasıl vurgulamaktadır.

Grip Polimeraz Gen-to-yapı belirlenmesi PB2 alt birimi için çoklu hedef Paralel İşleme Yaklaşımı

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

Bu, salgılanan, glikosile edilmiş memeli proteinlerinin üretimi ve ardından X-ışını kristalografisi ve diğer biyofiziksel çalışmalar için yeterli homojen protein verimi ile tek aşamalı saflaştırma için hızlı, uygun maliyetli bir protokoldür.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Otomatik sistemler ve ekranlar çok sayıda rutin hazırlanması için protokoller ve nanoliter kristalizasyon damlacıkları buharı difüzyon deneyler için açıklanan ve tartışıldı.

MRC Laboratuvarı moleküler biyolojinin makromoleküllerin kristalizasyon için protokolleri otomatik

Burada bir iletişim kuralı protein microcrystals kontrollü üretim için mevcut. Süreç kontrollü kristalizasyon parametreleri çeşitli manipülasyon sağlayan otomatik bir aygıt kullanır. Protein kristalizasyon taşınan-izleme ve kristalizasyon damlacık parçacıklar RADIUS dağılımı soruşturma sırasında kontrollü ve otomatik eklenmesi kristalizasyon çözümleri tarafından out.

Situ dinamik ışık saçılma ile birleştiğinde kristalizasyon büyüyen Protein kristalleri kullanarak farklı boyutları ile otomatik

Sunulan protokol, 96 kuyucuklu yüksek verimli bir diyaliz plakası kullanarak protein kristalleşme koşullarını ve kristal büyümesini taramak için basit bir yaklaşımı açıklamaktadır. Mikrokristallerin büyük ölçekli büyümesi için diyalizör tüplerinin kullanımı, seri kristalografi ve MicroED uygulamaları için de gösterilmiştir.

Mikrodiyaliz ile Yüksek Verimli Protein Kristalizasyonu

Bu protokol, sterol taşıyıcı ABCG5/G8'in kristalizasyonu için bir kurulumu açıklar. ABCG5/G8, asılı damla kristalizasyonu için iki seliler halinde yeniden oluşturulur. Protokol, özel malzemeler veya substratlar gerektirmez, bu da X-ışını kristalografisi yoluyla protein yapısını belirlemek için herhangi bir laboratuvarda erişilebilir ve uyarlanmasını kolaylaştırır.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

Öğrenin büyük spiral-coil proteinlerin kristalleşmesi için hesaplamalı ve deneysel yöntemleri entegre eden bu çerçeveyi. Alan sınırlarını hızlıca belirleyerek kristalleşme başarısını artırın.

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Daha fazla video keşfet