Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu
January 6th, 2017
Büyük sarmal bobin alanlarının karakterizasyonuna ve kristalizasyonuna rehberlik etmek için basit biyokimyasal ve hesaplamalı analizi içeren bir çerçeve tanımlıyoruz. Bu çerçeve, küresel proteinler için uyarlanabilir veya çeşitli yüksek verimli teknikleri içerecek şekilde genişletilebilir.
Bu prosedürün genel amacı, kristalleşecek içsel bir parça bulma olasılığını artırmak için büyük sarmal bobin proteinleri içindeki olası alan sınırlarını hızlı bir şekilde belirlemek ve test etmektir. Bu yöntem, araştırmacıların, kristalleşmesi çok zor olabilen büyük sarmal bobin proteinleri için kristalleşme sürecini kolaylaştırmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin avantajı, kristalleşme için olası adayları hızlı bir şekilde belirlemek ve taramak için hem deneysel hem de hesaplama yöntemlerini entegre etmesi ve böylece başarı şanslarını artırmasıdır.
Bu tekniği göstermek, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Jenna Zalewski ve laboratuvarımda lisans araştırmacısı olan Keith O'Conor olacak. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi olası sarmal bobin etki alanı sınırlarının tahminlerini oluşturmak için yerleşik web tabanlı araçlardan elde edilen çıktıları birleştirin. İfade plazmitleri oluşturduktan ve metinde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi ifade seviyelerini test ettikten sonra, Ruby etiketli proteini başarıyla ifade eden her bir suşun saflaştırılmasına başlayın.
Hücreleri parçalamak için, önce çözülmüş her hücre peletini proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş 1.5 mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Mililitre başına 10 miligram konsantrasyonda 30 mikrolitre lizozim ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin, ardından kullanılan aletin talimatlarını izleyerek sonikasyon yapın. Numuneyi, çözünmeyen materyali veya parçalanmamış hücreleri peletlemek için 14.000 kez G'de 30 dakika boyunca bir masa üstü santrifüjde santrifüjleyin.
SDS-PAGE aracılığıyla sonraki analizler için hem süpernatanı hem de peleti saklayın. Nikel afinite saflaştırmasını gerçekleştirmek için, önce 100 mikrolitre nikel NTA boncuklarını inkübe edin, lizis tamponunda çözünebilir lizat ile beş ila 10 dakika önceden yıkanın. Boncukları karıştırmak için süspansiyonu birkaç kez ters çevirin.
Boncukları peletlemek için numuneyi bir masa üstü santrifüjde 30 saniye boyunca 800 kez G'de santrifüjleyin. Bunu, spesifik olmayan kirleticileri temizlemek için peleti lizis tamponu ile üç ila beş kez yıkayarak takip edin. Son olarak, bir molar imidazol ile desteklenmiş lizis tamponu ile boncuklardan Ruby füzyon proteinini çıkarın.
Ruby füzyon proteininin konsantrasyonunu ölçmek için 280 nanometreye ayarlanmış bir spektrofotometre kullanın, ardından doğal bir PAGE jeline bir ila beş mikrogram füzyon proteini yükleyerek numunenin homojenliğini değerlendirin. %10 doğal PAGE jelini dört santigrat derecede 140 voltta 175 dakika çalıştırın. Floresanı görselleştirmek için donatılmış bir görüntüleyici kullanarak yerel SAYFAYI görüntüleyin ve Ruby etiketli füzyonun bu tahlilde nereye göç ettiğini gözlemleyin.
Önce 95 mikrolitre Ruby-Shroom SD2 füzyonunu beş mikrolitre 0.025 Subtilisin A ile inkübe ederek stabil şekilde katlanmış alanları tanımlamak için sınırlı proteoliz gerçekleştirin. Reaksiyonu sıfır, 0.5, iki, beş, 15, 60 ve 120 dakikalık zaman noktalarında örnekleyin, her zaman noktası için reaksiyondan 10 mikrolitre çıkarın ve reaksiyonun ilerlemesini %15 akrilamid jel kullanarak SDS-PAGE aracılığıyla görselleştirin. Proteaza dirençli bir türün tanımlanıp tanımlanamayacağını değerlendirmek için jeli Coomassie mavisi ile boyayın. Saflaştırma verimliliğinden, doğal PAGE'deki davranıştan ve kısmen saflaştırılmış mRuby2-Shroom füzyon proteinleri üzerindeki sınırlı proteolizden elde edilen verileri, bu proteinlerin çözeltideki genel davranışının kapsamlı bir değerlendirmesine entegre edin.
Beş ila 20 miligram tamamen saflaştırılmış numune elde etmek amacıyla iki litrelik mRuby2-Shroom SD2 kültürleri ile büyük ölçekli ifadeler gerçekleştirin. Hücre büyümesini takiben, hücreleri 10 dakika boyunca 8.000 kez G'de santrifüjleme ile peletleyin. Elde edilen hücre peleti, ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklanabilir.
Daha sonra, peleti, donmuş hücre peletinin gramı başına yaklaşık sekiz mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Bir homojenizatör kullanarak yeniden süspanse edilmiş hücreleri parçalayın. Hücre lizizini takiben, hücresel kalıntıları 30 dakika boyunca 30.000 kez G'de santrifüjleme yoluyla peletleyin.
Daha sonra, 10 mililitre önceden yıkanmış nikel NTA reçinesi kullanarak çözünür fraksiyonu toplu olarak bağlayın. Boncuk süspansiyonunu uygun bir yerçekimi kolonuna dökün ve bağlanmamış proteinlerin boşalmasına izin verin, ardından reçineyi 40 mililitre lizis tamponu ile üç ila beş kez yıkayın, ardından bir molar sodyum klorür ile takviye edilmiş lizis tamponu ile yıkayın. Reçinenin, 80 milimolar imidazol ile desteklenmiş 40 mililitre lizis tamponu ile son bir yıkamasını gerçekleştirin.
Ruby-Shroom füzyon proteinini, bir molar imidazol içeren 40 mililitre lizis tamponu ile elute edin. Ayrıştırılmış proteini manuel olarak dört ila 10 mililitrelik fraksiyonlara ayırın. %10 SDS-PAGE jeli kullanarak Ruby-Shroom füzyon proteini içeren fraksiyonları onaylayın.
Ruby etiketini çıkarmak için her 25 ila 50 miligram füzyon proteini için bir miligram TEV proteaz ekleyin. Daha sonra, altı ila sekiz kilodalton moleküler ağırlıklı kesme diyaliz tüpü kullanarak uygun fraksiyonları TEV bölünme tamponuna diyaliz edin. Proteini gece boyunca oda sıcaklığında yavaş karıştırarak diyalize edin.
Diyalizden sonra, nikel afinite saflaştırma adımlarını tekrarlayın. Shroom-SD2 alanı, Ruby etiketi reçineye bağlı kalırken bağlanmamış fraksiyona akmalıdır. Bir spin yoğunlaştırıcı kullanarak, tepe fraksiyonlarını mililitre başına yaklaşık 10 miligrama konsantre edin, ardından %12'lik bir SDS-PAGE jeli ile tepe fraksiyonlarını analiz eden boyut dışlama kromatografisi gerçekleştirin.
Tepe fraksiyonlarını bir araya getirdikten sonra, çözeltiyi kristalizasyon tamponuna diyalize edin, ardından diyaliz proteinini kristalizasyondan önce mililitre başına 10 miligrama konsantre edin. Kristalizasyon denemeleri için en uygun protein konsantrasyonunu belirlemek için 24 iyi oturan damla kristalizasyon tepsisi kullanarak 12 koşuldan oluşan küçük bir diziyi tarayın. Buhar difüzyon yöntemini kullanarak kristalizasyon denemeleri yapın.
İlk olarak, 12 koşulun her birinden 500 mikrolitreyi ayrı kuyucuklara pipetleyin. Her kaide üzerinde, bir mikrolitre kuyu çözeltisi ve bir mikrolitre protein örneği içeren damlalar yapın. Tepsiyi şeffaf bantla hızlı bir şekilde kapatın, ardından tepsiyi titreşimsiz, sıcaklık kontrollü uygun bir ortama taşıyın.
Önümüzdeki üç gün boyunca tepsilerdeki damlaları 100X'e kadar büyütmede bir mikroskop kullanarak inceleyin. Üç günlük sürenin sonunda, her damlayı yağış, hafif yağış, yoğun yağış veya kristal içermeyecek şekilde puanlayın. Uygun bir protein konsantrasyonu altıdan fazla ağır yağış içermemelidir.
Belirlenen protein konsantrasyonunu kullanarak, ticari olarak temin edilebilen çok çeşitli kristalizasyon eleklerini eleyin. Bir sıvı işleme veya kristalizasyon robotunun kullanılması, bu işlemi büyük ölçüde hızlandırırken aynı zamanda damlalardaki hatayı en aza indirir. Çok daha az protein gerektirir ve kullanıcının tek bir örnekle daha fazla koşulu taramasına olanak tanır.
Daha önce olduğu gibi 24 kuyulu elek tepsisi kullanarak kristalleşme damlası içindeki değişkenlerin her birini sistematik olarak değiştirerek geniş ekranlardan tanımlanan başlangıç koşullarını iyileştirin. Sınırlı proteoliz, proteinin esnek olabilecek veya proteaz için daha erişilebilir olabilecek bölgelerini tanımlamak için kullanılır. Burada, proteolitik olarak hassas olan bir SD2 alanı ve oldukça kararlı olan bir başka alan için bir bozunma modeli gösterilmektedir.
Ruby füzyon proteinleri bağlamında sınırlı proteoliz gerçekleştirildi. Bu durumda, Ruby ve SD2 alanı arasındaki bağlayıcı dizisi beklendiği gibi hızlı bir şekilde bölündü, ancak ortaya çıkan Ruby ve SD2 parçaları büyük ölçüde sabit kaldı. Yerel PAGE ile yapılan analizler, kristalleşme için iyi adayları hızlı bir şekilde ortaya çıkarabilir.
Farklı protein pillerine sahip dört Shroom-Rock kompleksi, yerel PAGE jelleri üzerinde çalıştırıldı. Kaya 834 ila 913'ü içeren kompleks en iyi davranışa sahipti ve kolayca kristalleşti, diğerleri ise sadece bozunma sırasında kristalleşti veya tamamen kristalleşemedi. Bu videoyu izledikten sonra, büyük sarmal bobin proteininiz için bir dizi potansiyel alan sınırının nasıl geliştirileceğini ve kristalleşme için en iyi adayları hızlı ve hızlı bir şekilde belirlemek için Ruby sistemini nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Kristalografi zaman alıcı bir çaba olmaya devam etse de, bu tekniği kullanmak, zayıf adayları elemek için basit tahliller kullanarak kristalleşecek proteinleri aramaya odaklanacak ve başarı şansı daha yüksek olan adaylar üzerinde daha fazla zaman harcamanıza olanak tanıyacaktır. Bu yordamı denerken, olası etki alanı sınırlarınızı seçerken mümkün olduğunca fazla bilgi eklemeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü kullanırken seçmeyi seçtiğiniz bilgiler her protein için değişecektir.
Mümkünse, söz konusu protein parçalarının hala biyolojik ilgi işlevini içerdiğinden emin olmak için hücre bazlı veya biyokimyasal tahliller gibi diğer yöntemler uygulanmalıdır. Bu yöntem sarmal bobin proteinlerine odaklanmış olsa da, genel çerçeve hemen hemen her protein için kolayca uyarlanabilir. Belirli enstrümantasyon ve biyolojik reaktiflerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven kullanmak veya koruyucu gözlük takmak gibi önlemlere her zaman uyulması gerektiğini unutmayın.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, büyük sarmal bobin alanlarının karakterizasyonunu ve kristalleşmesini geliştirmek için biyokimyasal ve hesaplamalı analizi birleştiren bir çerçeve sunmaktadır. Yöntem, bu zorlu proteinlerin kristalleşme sürecini hızlandırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Yapısal Biyoloji
- Protein Kristalleşmesi
Arka Plan
- Büyük sarmal bobin proteinlerin kristalleştirilmesi zordur.
- Alan sınırlarının belirlenmesi, başarılı kristalleşme için kritik öneme sahiptir.
- Deneysel ve hesaplamalı yöntemlerin birleştirilmesi başarı oranlarını artırabilir.
- Bu çerçeve, çeşitli protein türleri için uyarlanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Sarmal bobin proteinlerde potansiyel alan sınırlarını hızla belirlemek.
- İçsel protein fragmanlarının kristalleştirilme olasılığını artırmak.
- Daha iyi sonuçlar için hem deneysel hem de hesaplamalı teknikleri entegre etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Sarmal bobin alan sınırlarını tahmin etmek için web tabanlı araçların kullanılması.
- Protein ekspresyon seviyelerini test etmek için ekspresyon plazmidlerinin oluşturulması.
- Kristalleşme denemeleri için başarılı bir şekilde eksprese edilen proteinlerin saflaştırılması.
- Laboratuvar araştırmacıları tarafından tekniğin gösterimi.
Ana Sonuçlar
- Çerçeve, kristalleşme için umut verici adayları etkili bir şekilde tanımlar.
- Yöntemlerin entegrasyonu, kristalleşme sürecinin verimliliğini artırır.
- Lisans ve yüksek lisans araştırmacıları tarafından tekniğin başarılı bir şekilde gösterimi.
- Sarmal bobinlerin ötesinde diğer protein türlerine uyarlanma potansiyeli.
Sonuçlar
- Önerilen çerçeve, büyük sarmal bobin proteinlerin kristalleşmesine önemli ölçüde yardımcı olur.
- Hesaplamalı tahminlerin deneysel doğrulama ile birleştirilmesi, başarı oranlarını artırır.
- Bu yaklaşım, yapısal biyoloji araştırmacıları için değerli bir araç olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Crystallizing large coiled-coil proteins remains a significant bottleneck in structural biology and target validation, often consuming substantial resources with low success rates. This integrated wet and dry lab approach enables rapid identification of crystallizable protein fragments, reducing wasted effort on non-viable candidates. By improving hit rates in early-stage structural screening, the method supports more efficient lead identification and de-risks downstream structural and functional studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of domain boundaries to isolate stably folded fragments for structural characterization.
- Operational Value: Uses fluorescent tagging (mRuby2) for rapid visualization and quantification under standard imaging conditions.
- Strategic Value: Filters out aggregation-prone or unstable constructs early, focusing resources on high-potential targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Combines computational domain prediction with empirical validation via native PAGE and limited proteolysis.
- Operational Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts for protein concentration and homogeneity assessment.
- Strategic Value: Creates a reusable screening cascade adaptable to high-throughput expression and robotic crystallization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms structural integrity of purified domains through protease resistance and native gel mobility.
- Operational Value: Enables iterative refinement using data from initial screening to improve construct design.
- Strategic Value: Increases confidence in selecting fragments that retain functional relevance for downstream assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, linking computational target selection to empirical validation and structural screening, thereby informing go/no-go decisions before significant investment in crystallization campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of domain boundaries through combined bioinformatics and experimental validation.
- Screening: Delivers assay-ready, fluorescently tagged protein samples with quantified concentration and homogeneity metrics.
- Analytics: Provides native PAGE and proteolysis data to assess structural stability and domain integrity.
- Translational Research: Ensures selected fragments maintain structural fidelity, supporting continuity into functional and structural studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, adaptable framework applicable across diverse protein targets beyond coiled-coils.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target suitability by reducing mechanistic ambiguity in protein behavior.
- Operational Value: Increases reproducibility through standardized lysis, purification, and quantification steps.
- Strategic Value: Reduces time and reagent expenditure on low-probability constructs, improving capital efficiency in structural projects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on empirical crystallizability metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein purification, and fluorescence-based detection.
- Dependent on access to spectrophotometry, native and SDS-PAGE systems, and fluorescence imaging equipment.
- Necessitates cross-team alignment on construct design, tagging strategies, and data interpretation between computational and experimental groups.
- Adaptation to non-fluorescent or non-tagged systems may require alternative detection methods.
- Success depends on accurate domain boundary prediction and careful interpretation of proteolysis and gel shift data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
Express and Purify Proteins with Identified Domain Boundaries
2:38
Characterize Protein Sample to Identify Those with Advantageous Properties
4:16
Producing High Quality Crystals of the Coiled-coil SD2 Domain from Shroom
8:43
Results: Evaluation of Expression, Purification, Characterization, and Crystallization of Candidate Coiled-coil Proteins
9:49
Conclusion
