Name: Doğrusal Agaroz Kanallar kullanarak Okuyacak Drosophila Larva Tarama Davranış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Öğrenin Drosophila larvalarının doğrusal agaroz kanallarda sürünme davranışını gözlemleme yöntemini. Bu teknik sinir devrelerinin gelişimini ve motor kontrol mekanizmalarını detaylı incelemek için güvenilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chris Wreden ve Michelle Bland'a el yazması hakkındaki yorumları ve teknik yardımları için teşekkür ederiz.

Larva 1. Hazırlık <ol><li> Bir hafta davranışı kaydetmeden önce, bir haç (25 bakireler ve 5 erkek en az) kurdu. 25 ° C&#39;de tüm haçlar ve soyunu korumak. Not: kültür koşulları sıcaklığı değiştirilebilir, ancak aşağıda tarif edilen zaman aralığı gelişim hızı değişiklikleri hesaba ayarlanması gerekir. </li><li> 5 gün sabah ilk şey kaydetmeden önce, bir agar / suyu kapağı ve ağar / suyu kap merkezinde maya hamur dab (0.5-1 ml) ile bir toplama kafes içine ortasını yerleştirin. <ol><li> Bir koleksiyon kafes yapmak için, bir 6 oz içine delik karıştırmak. Kare polietilen Drosophila şişe. </li><li> , Ağar / suyu kapaklar hale konik bir şişe içinde 600 ml su ile agar 18 g karıştırın. 200 ml elma suyu ayrı bir şişeye karışımı 20 gr sakaroz. katılar kadar mikrodalga çözülür. Karışım, 60 ° C&#39;ye kadar soğumaya bırakıldıktan, birleştirin ve karıştırın. % 95 etanol içinde 20 mL% 10 metil-p-hidroksibenzoat ekleyin ve karıştırın. Ekle ~ 735 x 10 mm yuvarlak petri kabı alt yarısına mi. Agar / suyu oda sıcaklığında 1 saat boyunca katılaşmaya izin verin. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> , Maya salçası yapmak hacim kuru maya ve su eşit parçaya ekleyin. 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol></li><li> Larva koleksiyonları sağlığını kontrol edin. <ol><li> Sabah, 4 ve 3 gün kayıttan önce, kapağı çıkarın ve kafes taze bir kap yerleştirin. 24 hr yumurta toplama ve yumurtadan yeni çıkmış larva elde etmek için her gün aynı saatte kapaklarını değiştirin. </li><li> Her kapak kaldırıldıktan sonra, çapraz döşeme kaç yumurta görmek için inceleyin. Yani 500-2.000 yumurta arasında bekleyin. Gerekirse, yetişkinlerin sayısını ayarlayın. NOT: Bir kaç yumurta larva haline yumurtadan gerekirdi, ve yeni yumurtadan larva uzak maya macunundan bulunacaktır. </li><li> 24 saat boyunca her kap yaş. Larvalar sağlıklı olup olmadığını belirlemek için kapağını yeniden inceleyin. NOT: Çoğu yumurta larva haline yumurtadan gerekirdi, ve larva siz içine sürünerek gerekirdiast yapıştırın. kötü sağlık belirtileri bir bağışıklık reaksiyonu gösteren karın önemli koyu yamalar ile bir çıkmamış yumurta çok sayıda uzak maya hamur ölü larva organları ve larvaları içerir. Larvalar sağlıksız ise, kafes değiştirmek taze kapakları / maya hamur yapın ve genotipi kontrol edin. </li><li> Eski kapaklar atın. </li></ol></li><li> Davranışsal kayıtları için larva toplayın. <ol><li> kaydetmeden önce de 2 ve 1 gün, kapağı çıkarın ve taze bir kapak ile değiştirin. </li><li> Her çıkarıldı sınırı etiketi ve 25 ° C de devam edin. Bu davranış kayıtları için larva aşamalı dizi üretecek. İkinci instar (24-48 saat posthatch) ila (0-4 saat posthatch) yeni yumurtadan larvaları kanallar kullanılabilir. gün üst üste kayıtlar için kapaklar kaydedin. </li><li> 48 saat sonra tüm kapakları atın. </li><li> Gerekirse, en fazla 5 ek d 1.4.1-1.4.3 adımları tekrarlayın. Bu az sonra döllenmiş yumurtalar üretilir. </li></ol></li></ol><ol><li> Doğrusal kanal PDMS (polidimetilsiloksan, bir silikon elastomer) döküm kalıp (Şekil 1A) hazırlayın. Döküm PDMS istek üzerine Heckscher laboratuarında temin edebilirsiniz. <ol><li> izopropil alkol ile döküm kalıbı temizleyin. Hava kuru, dab laboratuvar mendil ile kuru veya konserve hava kullanın. </li><li> Bir 10 sm Petri kabı kapağı veya başka bir kap içine döküm kalıbı yerleştirin. </li></ol></li><li> Hazırlayın ve agaroz çözüm dökün. <ol><li> tamamen çözünene dek mikrodalga tarafından su içinde% 3 agaroz çözeltisi (100 ml, 3 g) sağlayın. </li><li> 55 ° C&#39;ye soğutun, kabarcıklar yüzeye yükselmesini bırakarak. </li><li> kalıp sadece kaplıdır, böylece döküm kalıbı içeren petri içine agaroz karışımı dökün. katılaşmış kadar agaroz set edelim. </li></ol></li><li> döküm kalıp agaroz kanalları çıkarın. Bir jilet ile agaroz diskin kenarları kırpın. <ol><li> kanal koymaksu içine batırılmış bir 10 santimetrelik bir petri tabağına s. Bunlar, 7 gün boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol></li></ol> Kayıt Davranışlarına bir kanal içine larva yükleme 3. NOT: 4 ° C&#39;de kanallar saklamak durumunda, kanallar davranışsal kayıt için kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. <ol><li> Aşama 2 (Şekil 2A) &#39;da hazırlanmış olan tek bir kanal kesmek için temiz bir tıraş bıçağı kullanma. </li><li> Bir cam lamel (Şekil 2B) kanal yivli yan yukarı yerleştirmek için forseps bir çift kullanın. lamel çapı ve derinliği görüntüleme için kullanılan spesifik kapsama bağlıdır. </li><li> Adım 1&#39;de hazırlanan ağar / meyve suyu kapağından bir larva seçin ve kesme kanalı (Şekil 2C) içine yerleştirmek için ince forseps kullanın. <ol><li> Larva sıkmak yok. forseps tine ucu ile hafifçe toplayın. Iyi bir noktaya sahip bir fırça ile larva işlemek de mümkündür. NOT: Bu önemli larva olarak çok sen olandokunmak sas. bunlar dikkatle ele değilseniz, nosiseptif tepkiler denemenin ilk birkaç saniye boyunca davranışlarını hakim olabilir. </li><li> kısaca suyla daldırarak larvaları yıkayın. </li><li> kesim kanalı üzerine larva yerleştirdikten sonra, yavaşça kanal koru içine larva kızdırmak için forseps tine ucunu kullanın. NOT: Bir çok uygulama için larva genişliği ve kanal genişliği aynı olmalıdır. Farklı gelişim aşamalarında larvaların ortalama genişliği aşağıdaki gibidir: 0 saat posthatch - 140 mikron, 24 saat posthatch - 180 mikron, 48 saat posthatch - 320 mikron, 72 saat posthatch - 500 mikron, 96 saat posthatch - 750 mikron 8. Aşağıdaki genişliklere girmektedirler kanallar 100, 150, 200, 250 ve 300 mikron, ve bütün kanallar 150 um derindir. </li><li> kanal içinde larva konumunu ayarlamak için bir forseps tine ya da fırça ucu kullanın. Bu, herhangi bir yönde yönlendirilmiş olabilir: ventralyukarı, ventral aşağı ventral bir tarafı, ne yapısına bağlı olarak, görüntülenecek olan. </li></ol></li><li> Forseps kullanarak, hafifçe larva kapak camına şimdi olduğu gibi üzerinde kanalı çevirin. Bu, su (Şekil 2D) ile doldurur ve böylece kanalın ucunda su, bir veya iki damla yerleştirin. <ol><li> Yavaşça herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için kanalın kenarlarına kaldırın. </li><li> larva yönünü ayarlayın. Bunu yapmak için, hafifçe kanalı değil larva rulo cam kapak dürtmek. Bu yönünü değiştirmek değilse, kapak camı kaldırın ve larva konumunu ayarlamak. Larva yansıması hazırdır. </li><li> Görüntü kanal / ters bir mikroskop lamel. dik bir mikroskop görüntüleme, sadece kanal / lamel ters çevirin. </li></ol></li></ol> Davranış Kayıt İlgi 4. Tedbir Özelliği <ol><li> Ilgi bir yapı için (örneğin, kuyruk, MSS), ilgilenilen bir özelliği ölçmek (örnZamanla, flüoresan yoğunluğu, yer). NOT: baş ve kuyruk gibi yapılar elle açıklamalı edilebilir. Örneğin, baş koyu H-şekilli ağız kanca içeren olarak tespit edilebilir ve kuyruk arka trakeal spiricles içerdiği tespit edilebilir. Bu yazıda sinir kablosu üzerinde duruluyor. Floresan merkezi sinir sistemini (MSS) etiketlemek için bir UAS-myr-GFP transgen (elav&gt; GFP) 9,10 sürmek için nöronal GAL4 hat elav-GAL4 kullanın. MSS posterior (Şekil 3) kadar uzanır sinir kablosu, bağlı iki ön beyin lobu içerir. </li><li> Her zaman noktasında (t) sinir kordonu (f (NC)) piksel yoğunluğunu ölçün. Aşağıda manuel açıklama yaklaşımı açıklar, ancak bu adımı otomatik olabilir. <ol><li> &#39;Analiz&#39; menüsünden Fiji (veya benzer yazılım) ortalama gri değeri ve dilim ve rapor &quot;ayarla Ölçümler ...&quot; diyalog kutusunu kullanıne konumu. </li><li> El ile film (Şekil 3) ilk karesine sinir kablosu merkezinde bir kutu çizin. Bu adım aynı zamanda görüntü segmentasyonu ve kayıt algoritmaları ile otomatik olabilir. </li><li> ilgi kutulu bölgedeki ortalama piksel yoğunluğunu rapor &#39;Analiz&#39; menüsünden &quot;Tedbir&quot; komutunu kullanın. Bu bir &quot;Sonuçlar&quot; penceresi oluşturur. </li><li> Bir sonraki çerçevede, elle ok tuşlarını kullanarak yeniden boyutlandırma olmadan kutuyu yeniden konumlandırmak. Yine &quot;Tedbir&quot; komutunu kullanın. güncellenmiş sonuçlar &quot;Sonuçlar&quot; penceresinde gösterilir. ilgi her kare için bu adımı yineleyin. </li><li> Dosya menüsünden kullanarak &quot;Sonuçlar&quot; &#39;Save As ...&#39; komutunu kaydedin. Sonuçlar bir .xls dosyası olarak ihraç edilecek. </li></ol></li></ol> 5. Ölçümleri analiz <ol><li> &lt;0 ve 1 (z (t arası bir değere (NC) değeri) her bir F normalize/ Em&gt;). <ol><li> e-tabloya (veya başka bir program) olarak Results.xls dosyasını açın. Bu dosya çerçeve numarası ve ortalama floresan yoğunluğu temsil eden iki sütun vardır. </li><li> Yeni bir sütun yapmak ve ([NC] f) normalize floresan değeri oluşturmak için formül z (t) = f (NC [t]) -Min (f [NC]) / max (f [NC]) -Min kullanın her bir zaman noktasında karşılık gelir. </li></ol></li><li> Kayıtta her adım için adım süresini belirleyin. NOT: Bir adım döngü ileri için tekrarlayan tüm vücut hareket birimidir (ve tersi) tarama. Kongre tarafından bu tür bağırsak veya MSS 1 olarak kuyruk, baş ve diğer iç organların ileri hareketi ile ileri adım başlar (ve biter). <ol><li> El ile her adım başlanması sürelerini (i) davranışsal kayıt incelemek ve kayıt (i (Stride Döngüsü [n])). NOT: Aşağıdaki örnekte, ileri hareketCNS bir adım çevriminin başlatılması (Şekil 3) gibi. </li><li> Her adım süresini hesaplamak: Δ t (Adım döngüsü) = i (Stride Döngüsü [n + 1]) -i (Stride Döngüsü [n]). </li></ol></li><li> Kaydın her bir zaman noktası için geçen adım döngüsünün yüzdesini hesaplayın. <ol><li> Bir adım döngüsü (c) başlangıcından beri geçen süreyi temsil eden tablo dosyasında ek bir sütun olun. Saati ayarla her adım başlangıcında sıfıra adım başlatılması beri (c (Stride Döngüsü [n]) = 0). buna göre başladıktan sonra kere ayarlayın. </li><li> . Geçen yüzde adım döngüsü (% adım döngüsü) geçtikten temsil tablo dosyasında ek bir sütun yapmak adım dönemi ayarlanmış kez bölün ve adım döngüsünün yüzdesine dönüştürmek için 100 ile çarpın:% adım döngüsü = (c (Stride Döngüsü [n] )) / (Δ t (Adım döngü) * 100). </li></ol></li></ol> 6. Polar Tarama Döngüsü üzerinden İlgi Yapıların Dinamikleri Temsil Arsalar Koordinat üret <ol><li> MATLAB, güncellenmiş Results.xls almak için Giriş sekmesinde &#39;İthalat Verilerini&#39; diyalog kullanın. </li><li> Make a yeni bir dizi &quot;Teta&quot; içeren yüzde adım döngüsü değerleri (% adım döngüsü). (Q1% adım devrini temsil eder &quot;teta = var1&quot;). </li><li> Yeni bir dizi &quot;Rho&quot; normalize floresan değerleri (z (t)) içerirler olun. (Var2 z (t temsil eden &quot;Rho = var2&quot;)). </li><li> açı olarak yüzde adım döngüsü ve yarıçapı ( &quot;PolarPlot (Teta, Rho)&quot;) olarak floresan ile kutupsal koordinat çizimleri yapmak için &#39;PolarPlot&#39; komutunu kullanın. </li></ol>

<ol><li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism%2C+segment%2C+and+somatic+body+wall+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li>
<li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+rev%22%5BJournal%5D)">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687(1996).</li>
<li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+control+of+swimming+behavior%3A+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li>
<li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li>
<li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Drosophila+motoneurons%3A+specification+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+cell+devl+bio%22%5BJournal%5D)">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li>
<li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even-Skipped%28%2B%29+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li>
<li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Behav%22%5BJournal%5D)">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li>
<li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rover%2FSitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development%2C+Food-Patch+Quality%2C+and+Starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li>
<li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+%2F+MAPK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTufte%2C+ER+%22The+visual+display+of+quantitative+information%22">The visual display of quantitative information</a>. , Graphics Press. Cheshire, CT. (2004).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bir mikroakışkan cihaz Drosophila larvaları ağırlayacak doğrusal agaroz kanalları (Şekil 1) yapmak için inşa edilmiştir. Drosophila larvaları, bu lineer agaroz kanallarda yerleştirildiğinde davranışsal repertuarı tarama döngüsü boyunca larva yapıların dinamikleri ayrıntılı gözlem için izin veren, tarama ile sınırlıdır. Bir larva (Şekil 3) ritmik adımlar bir dizi gerçekleştirdiğinizde Başarılı bir kayıt oluşur. Bu oluşmazsa, kanalda bir hava...

Bu yöntemin genel amacı ayrıntılı olarak Drosophila larva tarama incelemektir. Lokomosyon üzerinde deneyler geliştirilmesi ve motor kontrolü 2 teorileri test önemli bir rol oynamıştır. Geleneksel olarak hareket su hayvanları (örneğin, sülük taşemen, larva) 3 incelenmiştir. bu hayvanlarda hareketin tekrarlayan doğa lokomosyon sürüş biyofiziksel olayların analizi için, ve lokomosyon eşlik nöral ateşleme desenleri izlenmesi için, ritim yaratılışına çalışması için izin verdi. Yüzeysel genetik, iyi karakterize geliştirme, birinci ve ikinci instars de optik açık bir gövde ve entire devam eden bir transmisyon elektron mikroskobik yeniden: hareketin çalışmaları için Drosophila larva kullanımı diğer model sistemler üzerinde avantaj benzersiz bir bileşimini sunuyor sinir sistemi 4-6. Ancak, Drosophila larva locodüz açık yüzeylerde hareket, duraklamalar da dahil olmak üzere biraz karmaşık döner ve kıvrımlı 7 tarar. Bu yayın larva, düz, ritmik tarama davranışı sürekli gerçekleştirmek şekilde Drosophila larva lokomotor davranışını yönlendirmek için doğrusal agaroz kanalları kullanmak için bir yöntem sunar. Bunun yerine düz açık yüzeylerde davranış, agaroz kanallarda Drosophila larva davranış incelenmesi, çeşitli avantajları vardır. Birincisi, araştırmacılar özellikle larva davranışsal repertuar bir parçası olan pek çok hareketlerinden davranışı tarama seçmenizi sağlar. İkinci olarak, larva vücut büyüklüğü karşısında kanalın genişliğini ayarlayarak, tarama hızı ayarlanabilir. Üçüncü olarak, kanallar larva larva yüklenir ve kanal içinde nasıl yönlendirileceğini bağlı dorsal, ventral ya da yan tarafında görülebilir için izin verir. ilgi herhangi bir yapı tarama sırasında sürekli olarak görünür olması için larva yönde Bu çok yönlülük sağlar. Dördüncü,kanallar mikroskoplar ve hedeflerinin geniş bir yelpazede kullanım için müsait. Örneğin, doğrusal kanal / veya eğirme disk konfokal mikroskoplar 1 yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve parlak alan stereoskop düşük çözünürlüklü görüntüleme için kullanılabilir. Beşinci olarak, bu yöntem, herhangi bir genetik arka Optogenetic / thermogenetic nöronal manipülasyonlar ile bir arada kullanılabilir. (Birinci ve ikinci instars at) larva vücut ve agaroz kanallar hem optik açıktır, çünkü genetik olarak kodlanmış floresan problar ile etiketlenen larva yapıların floresan yoğunluğu dinamik hareketleri veya değişiklikleri inceleyerek Son olarak, kanallar kullanılabilir. Tarif edilen yöntem olup, ilk ve ikinci instar Drosophila larva özelliklerinin detaylı kinematik çalışmalar için uygundur. Bu yayın kanallarının kullanımını göstermek için ileri larva tarama sırasında MSS floresan yoğunluğu dinamik değişiklikleri analiz ve bir habercisi olarak Neu içinronal kalsiyum görüntüleme.

<table><tbody><tr><td>6 oz kare Drosophila şişesi</td><td>Scimart</td><td>DR-103</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>sükroz</td><td>sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>elma suyu</td><td></td><td></td><td>konsantreden değil</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Fisher</td><td>T2300</td><td>metil-p-hidroksibenzoat</td></tr><tr><td>35 x 10 mm yuvarlak petri kabı</td><td>Fisher</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>ekmek mayası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS döküm kalıbı</td><td>FlowJem</td><td></td><td>yazarlardan talep edilebilir</td></tr><tr><td>İzopropil alkol</td><td>Fisher</td><td>A417-1</td><td></td></tr><tr><td>laboratuvar mendilleri</td><td>Fisher</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>konserve hava</td><td>Fisher</td><td>18-431</td><td></td></tr><tr><td>10 cm petri kabı</td><td>BioPioneer</td><td>GS82-1473-001</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher</td><td>50-444-176</td><td></td></tr><tr><td>tıraş bıçağı</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>forseps</td><td>FST</td><td>11241-40</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 kapak camı, #1.5</td><td>Fisher</td><td>50-365-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (sürüm 1.51d)</td><td>NIH</td><td></td><td>fiji.sc</td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td>www.microsoftstore.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2016</td><td>Matematik İşleri</td><td></td><td>www.mathworks.com</td></tr></tbody></table>

doğrusal agaroz kanallar kullanarak okuyacak<em&gt; drosophila</em&gt; larva tarama davranış

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larva tarama sensorimotor davranış nöral kontrolünü incelemek için güçlü bir model olarak ortaya çıkmaktadır. , Duraklatma dönüm ve dolambaçlı: Ancak, düz açık yüzeylerde larva tarama davranışı da dahil olmak üzere, karmaşıktır. Hareketin repertuarında Bu karmaşıklık, tek bir tarama adım döngüsü sırasında meydana gelen olayların ayrıntılı analizini engellemektedir. Bu engeli aşmak için, doğrusal agaroz kanallar düz, sürekli, ritmik tarama larva davranış sınırlamak olduğunu yapılmıştır. Agaroz kanalları ve Drosophila larva vücut hem optik açıktır, çünkü prensip olarak, genetik olarak kodlanmış floresan problar ile etiketlenen larva yapıların hareket bozulmamış, serbestçe hareket eden larva izlenebilir. Geçmişte, larva lineer kanal içine yerleştirildi ve bütün organizmada kısım düzeyinde tarama ve kas 1 analiz edilmiştir. Gelecekte, kanallarda tarama larva nöro izlemek için kalsiyum görüntüleme için kullanılabilirNAL aktivitesi. Ayrıca, bu yöntemler, bir genotip larvalarına ve herhangi bir araştırmacı tasarlanmış kanal birlikte kullanılabilir. Böylece aşağıda sunulmuştur protokol motor kontrolünü anlamak için bir model olarak Drosophila larva kullanan çalışmalar için yaygın olarak uygulanabilir.

Bu makalede, agaroz kanalları kullanarak Drosophila larva davranış rehberlik ve bir tarama döngüsü boyunca larva yapıların dinamiklerini ölçmek için bir yöntem açıklanır. Doğrusal kanallarda Larvalar ritmik tarama (Şekil 3) sürekli nöbetleri gerçekleştirin. larva ve kanallar hem de optik açıdan berrak olduğu için, kanalların larva çıkar yapıda ifade floresan probları ifade ile birlikte kullanılabilir. Biz (elav-Gal4 / +; UAS MYR-GFP / +) her nöronlarda ...

Drosophila larva davranış nöral kontrolünü incelemek için güçlü bir model sistem. Bu yayın, tekrarlanan tarama davranışı sırasında, larva yapılarının dinamik ölçmek için lineer tarama ve yöntemler sürekli nöbetleri ortaya çıkarmak için, doğrusal agaroz kanallarının kullanımını tarif eder.

Doğrusal Agaroz Kanallar kullanarak Okuyacak<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Tarama Davranış

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

Bu prosedürün genel amacı, nöral devrelerin gelişimini incelemek için doğrusal bir agaroz kanal içinde ilerleyen larva evresindeki Drosophila'ları gözlemlemektir. Bu yöntem, motor modelleri oluşturan nöral kodların anlaşılması ve hareket kontrolü için nöronal devreleri şekillendiren temel genetik ve hücresel süreçlerin belirlenmesi gibi nöroetoloji ve gelişim biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların tek bir çoklu modeli ayrıntılı olarak inceleyebilmeleri için larva davranış repertuvarını kısıtlamasıdır.Prosedürü, laboratuvarımdan teknisyen Zarion Marshallle gösterecektir. Öncelikle larvanın sağlığını değerlendirmek önemlidir. Kayıttan üç ila dört gün önce, yetişkin kafesinin toplama plağını değiştirin.Bunu her gün ve günün aynı saatinde yapmaya devam edin. Plakadaki yumurtaları ve yeni çıkmış larvaları sayın. Beklenen yumurta sayısı 500 ile 2.000 arasındadır.Kafesteki yetişkin sayısını gerektiği gibi ayarlayın. Larvaların sağlıklı olup olmadığını belirlemek için plakayı 24 saat sonra inceleyin. Yumurtaların çoğu larvaya dönüşmüş olmalı ve larvalar maya macununun içine girmiş olmalıdır.Kötü sağlık belirtileri arasında çok sayıda açılmamış yumurta, maya macunundan uzakta bulunan ölü larva gövdeleri ve bağışıklık reaksiyonunun bir göstergesi olan abdomen bölgesinde olağan dışı koyu lekeler bulunan larvalar yer alır. Larvalar sağlıksız görünüyorsa, taze hazırlanmış plakalar kullanarak kafesi değiştirin ve yetişkinlerin genotipini kontrol edin. Deney için, bir ila iki günlük plakalardan yeni çıkmış ikinci instar larvaları toplayın.Tüm bu aşamalar analizde kullanılabilir. Bu protokol için, doğrusal kanallı bir PDMS döküm kalıbı hazırlayın. Döküm kalıbını izopropil alkol ile temizleyin.Kuruduğunda, kalıbı on santimetrelik bir kapak veya benzeri bir kaba yerleştirin. Ardından kalıbı 55 °C'ye kadar soğutulmuş yüzde üç oranında agaroz ile doldurun. Kalıpta hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için agarozu dikkatlice dökün.Kalıp, agaroz ile sadece üzeri kapanacak şekilde örtülmelidir. Katılaştıktan sonra, agaroz kanallar kalıptan çıkarılmalıdır. Disk şeklindeki kanalların kenarları düzeltilmeli ve ardından kanallar suyun içine daldırılmalıdır.Bunlar, dört santigrat derece sıcaklıkta su içerisinde yedi güne kadar saklanabilir. Kanalları kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin. Larvanın genişliğine uygun bir kanal seçin.Kanalların genişliği 100 ile 300 mikron arasında değişmekte olup hepsinin derinliği 150 mikrondur. Ardından, hazırlanan diskten tek bir kanalı kesmek için temiz bir jilet kullanın. Kanalı, oluklu tarafı yukarı gelecek şekilde, uygun boyutlardaki bir cam lamelle veya lama pensle aktarın.Ardından, ince uçlu bir pensle larvayı sıkmadan nazikçe kaldırın. İnce uçlu bir resim fırçası da etkili bir yöntemdir. Eğer larva sıkılırsa, kanalda yuvarlanma veya büzülme gibi ağrı refleksleri larvanın davranışına hakim olabilir.Şimdi larva, kısa süreliğine suya daldırılarak yıkanır ve ardından nazikçe itilerek kesik kanala yerleştirilir. Kanala yerleştirildikten sonra, ilgilenilen yapının görüntülenmesini kolaylaştırmak için larvanın yönü ayarlanır. Daha sonra kanalı suyla doldurmak için kanalın her iki ucuna bir veya iki damla su eklenir.Hava kabarcığı sıkışmışsa, bunları gidermek için kanalın kenarlarını nazikçe kaldırın. Larvanın yönünü daha fazla ayarlamak için, larvanın dönmesini sağlamak amacıyla kanalı hafifçe itin. Larva artık görüntüleme için hazırdır.Lineer kanallardaki larvalar, ritmik sürünmenin sürdürülebilir evrelerini gerçekleştirirler. Floresan problar kolaylıkla incelenebilir. Örneğin, GAL4 sürücüsü aracılığıyla nöronlarında GFP eksprese eden larvalar, sürünme döngüsü sırasında sinir kordonundan yayılan floresan yoğunluklarında dinamik değişiklikler sergilerler.Larval baş ve kuyrukla neredeyse aynı anda ilerleyen MSS, kas kasılma dalgasının vücut ekseni boyunca geçişiyle birlikte odak düzleminin içine ve dışına girer ve bu durum sinir kordonunun floresansının değişmesine neden olur. Floresanstaki değişiklikler, üç larva için üç sürünme adımı üzerinden nicelleştirilmiştir. Adım döngüsü boyunca sinir kordonu floresansının dinamikleri, fenotipleme için kullanılabilecek tekrarlanabilir bir patern izlemiştir.Bu videoyu izledikten sonra, davranış çalışmaları için larvaların nasıl toplanacağı, agaroz kanalların nasıl hazırlanacağı ve lineer sürünme davranışını görselleştirmek için larvaların kanallara nasıl yükleneceği konusunda bilgi sahibi olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, larvaların nazikçe taşınması gerektiğini hatırlamak önemlidir.

using-linear-agarose-channels-to-study-drosophila-larval-crawling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Drosophila melanogaster bir yüzyıl 1 aşkın süredir birçok önemli biyolojik işlemlerin moleküler ve hücresel temelini anlamak için kullanılan bir genetik ve davranışsal uysal modeli sistemidir. Drosophila iyi sinek davranışının genetik temeli içgörü kazanmak için istismar edilmiştir.

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Biz kayıt ve sayısal bir video-hızı izleme mikroskop sistemi...

C. elegans Takip ve Davranış Ölçme

Bu videoda, genel hareket kabiliyetlerini değerlendirmek için serbestçe yürüyen sineklerin nasıl izleneceği açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, video izleme yazılımı kullanarak tahlilin kurulumunu ve veri analizini gösterir.

Serbestçe Yürüyen Sineklerin İzini Sürmek: Drosophila'da Hareketi Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Bu video, koku alma duyu nöronlarının (ORN'ler) optogenetik uyarılmasına yanıt olarak Drosophila larvalarının navigasyon davranışı üzerine bir çalışmayı göstermektedir. ORN'lerde ışığa duyarlı iyon kanallarını eksprese eden transgenik Drosophila larvaları, bir davranış alanı içinde agaroz üzerine yerleştirilir. Işıkla optogenetik stimülasyon kanalları açarak sinyalin beyne iletimini tetikleyen bir katyon akışına neden olur ve navigasyon davranışı kaydedilir.

Koku Alma Duyu Nöronlarının Optogenetik Stimülasyonuna Yanıt Olarak Drosophila Larvalarının Seyir Davranışı

Drosophila melanogaster larvaları besleme devresi besleme hızındaki değişimler stomatogastric sinir devresi değişiklikler ile korelasyon sağlayan bir basit ama güçlü bir model oluşturuyor. Bu devre, ağız kanca projeksiyonlar hem de foregut göndermek merkezi serotonerjik nöronların oluşmaktadır.

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila</i

Burada bir yanal bakış açısıyla Drosophila yetişkin ve larva mutant fenotip yüksek kaliteli dijital video elde etmek için basit ve yaygın olarak erişilebilir mikroskopi tekniği açıklar.

Yüksek-Kalite Dijital Video Edinme Drosophila Bir Yanal Perspektifinden Larva ve Yetişkin Davranışları

Drosophila melanogaster yiyecek arama yolu uzunluğu testi için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Test hayvanlarının hazırlanmasını ve işlenmesini, testin nasıl gerçekleştirileceğini ve verilerin nasıl analiz edileceğini tartışıyoruz.

için yiyecek arama yolu uzunluğu Protokolü<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Bu iletişim kuralı Drosophila larva yanıt onun koku nöronlar eşzamanlı optogenetic uyarılması için gezinme davranışını analiz eder. 630 nm dalga boyunda ışık kırmızı kaymıştır kanal rhodopsin ifade bireysel koku nöronlar etkinleştirmek için kullanılır. Larva hareketi aynı anda izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel olarak yazılmış yazılım kullanılarak analiz.

Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek

Bu protokol, Drosophila larva fototaktik davranışını araştırmak için ışık noktası bir test sunar. Bu testte, ışık stimülasyonu olarak bir ışık noktası oluşturulur ve larva ışıktan kaçınma işlemi kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi tarafından kaydedilir.

Drosophila Larva Fototaksisanalizi için Hafif Nokta Tabanlı Tahlil

Öğrenin Drosophila larvalarının doğrusal agaroz kanallarda sürünme davranışını gözlemleme yöntemini. Bu teknik sinir devrelerinin gelişimini ve motor kontrol mekanizmalarını detaylı incelemek için güvenilir bir platform sunar.

Doğrusal Agaroz Kanallar kullanarak Okuyacak

Daha fazla video keşfet