Doğrusal Agaroz Kanallar kullanarak Okuyacak Drosophila Larva Tarama Davranış

Bu prosedürün genel amacı, nöral devrelerin gelişimini incelemek için larva evresi Drosophila'nın doğrusal bir agaroz kanalında sürünmesini gözlemlemektir. Bu yöntem, motor kalıpları oluşturan nöral kodları anlamak ve hareket kontrolü için nöronal devreleri kapsayan temel genetik ve hücresel süreçleri belirlemek gibi nöro etoloji ve gelişimsel biyoloji alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, larva davranış repertuarını kısıtlamasıdır, böylece araştırmacılar tek bir çoklu deseni ayrıntılı olarak inceleyebilirler.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Zarion Marshall olacak. İlk olarak, larvaların sağlığını değerlendirmek önemlidir. Kayıttan üç ila dört gün önce, yetişkin kafesinin toplama plakasını değiştirin.

Bunu her gün ve günün aynı saatinde yapmaya devam edin. Plakadaki yumurtaları ve yumurtadan yeni çıkmış larvaları sayın. Beklenen yumurta sayısı 500 ile 2.000 arasındadır.

Kafesteki yetişkin sayısını gerektiği gibi ayarlayın. Larvaların sağlıklı olup olmadığını belirlemek için 24 saat sonra plakayı inceliyoruz. Yumurtaların çoğu larvalara yumurtadan çıkmış olmalı ve larvalar maya macununa girmiş olmalıdır.

Kötü sağlık belirtileri arasında çok sayıda yumurtadan çıkmamış yumurta, maya macunundan uzakta ölü larva cisimleri ve karın bölgesinde alışılmadık derecede koyu lekeler bulunan larvalar bulunur, bu da bir bağışıklık reaksiyonunun göstergesidir. Larvalar sağlıksız görünüyorsa, taze hazırlanmış tabakları kullanarak kafesi değiştirin ve yetişkin genotipini kontrol edin. Deney için, bir ila iki günlük plakalardan yeni yumurtadan çıkmış ikinci instar larvalarını toplayın.

Tüm bu aşamalar analizde kullanılabilir. Bu protokol için doğrusal kanallı bir PDMS döküm kalıbına sahip olun. Döküm kalıbını izopropil alkol ile temizleyin.

Kuruduktan sonra kalıbı on santimetrelik bir kapağa veya benzeri bir kaba koyun. Daha sonra kalıbı 55 santigrat dereceye kadar soğutulmuş yüzde üç agaroz ile doldurun. Kalıpta hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için agarozu dikkatlice dökün.

Kalıp sadece agaroz tarafından örtülmelidir. Katılaştıktan sonra agaroz kanallarını kalıptan çıkarın. Disk şeklindeki kanalların kenarlarını kesin ve ardından kanalları suya batırın.

Yedi güne kadar dört santigrat derecede suda saklanabilirler. Kanalları kullanmadan önce oda sıcaklığına ısınmalarına izin verin. Larva genişliğine uygun bir kanal seçin.

Kanalların genişliği 100 ila 300 mikron arasında değişir ve hepsi 150 mikron derinliğindedir. Ardından, hazırlanan diskten tek bir kanal kesmek için temiz bir tıraş bıçağı kullanın. Forseps ile kanalı uygun boyutta bir cam kapağa, yivli tarafı yukarı gelecek şekilde kaydırın veya kaydırın.

Ardından, bir larvayı sıkmadan nazikçe almak için ince forseps kullanın. İnce uçlu bir boya fırçası da iyi çalışır. Sıkılırsa, yuvarlanma veya kamburlaşma gibi ağrı refleksleri larvaların kanaldaki davranışına hakim olabilir.

Şimdi larvaları kısa bir süre suya batırarak yıkayın ve ardından kesilen kanala yerleştirin ve nazikçe yerine oturtun. Kanala girdikten sonra, ilgilenilen yapının görüntülenmesini kolaylaştırmak için larvanın yönünü ayarlayın. Ardından, kanalı suyla doldurmak için kanalın her iki ucuna bir veya iki damla su koyun.

Herhangi bir hava kabarcığı sıkışırsa, bunları çıkarmak için kanalın kenarlarını hafifçe kaldırın. Larvaların yönünü daha da ayarlamak için, larvaları yuvarlamak için kanalı hafifçe itin. Larva artık görüntülenmeye hazırdır.

Doğrusal kanallardaki larvalar, sürekli ritmik tarama nöbetleri gerçekleştirir. Floresan problar kolayca incelenir. Örneğin, GAL4 sürücüsünden nöronlarında GFP eksprese eden larvalar, tarama döngüsü sırasında sinir kordonundan yayılan floresan yoğunluklarında dinamik değişiklikler gösterir.

CNS, bir kas kasılma dalgası vücut ekseni boyunca geçerken larva başı ve kuyruğu ile hemen hemen aynı anda ileri doğru hareket eder, CNS odak düzlemine girip çıkar ve sinir kordonunun floresansının değişmesine neden olur. Floresandaki değişiklikler, üç larva için üç tarama adımından ölçüldü. Sinir kordonu floresansının adım döngüsü üzerindeki dinamikleri, fenotipleme için kullanılabilecek yeniden üretilebilir bir model izledi.

Bu videoyu izledikten sonra, davranış için larvaların nasıl toplanacağını, agaroz kanallarının nasıl hazırlanacağını ve doğrusal tarama davranışını görselleştirmek için larvaların kanallara nasıl yükleneceğini anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, larvaları nazikçe tutmayı unutmamak önemlidir.