Name: Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Öğrenin, sürekli kültürleme sistemiyle optogenetik mikropların ışık yanıtlarını gerçek zamanlı ve çok günlü ölçümle incelemeyi. Bu yöntem, hücre biyolojisi ve metabolik mühendislikte dinamik gen ifadesi araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yararlı tartışmalar ve düzenleme için protokol, Kieran Sweeney test yardım için Molly Lazar ve Verónica Delgado kabul etmek ister ve yazının eleştirel okuma Taylor Scott, My An-adirekkun ve Stephanie Geller olacaktır. Megan Nicole McClean, Ph.D. Burroughs Wellcome Fonu Bilimsel Arayüz bir Kariyer Ödülü sahibidir.

<ol><li>Motta-Mena, L. B., Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li>
<li>Hughes, R. M., Bolger, S., Tapadia, H., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+control+of+DNA+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Light-mediated control of DNA transcription in yeast.</a> Methods. 58 (4), 385-391 (2012).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Light-inducible+spatiotemporal+control+of+gene+activation+by+customizable+zinc+finger+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">a Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors.</a> J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).</li>
<li>Polstein, L. R., Gersbach, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+A+light-inducible+CRISPR-Cas9+system+for+control+of+endogenous+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">a A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 198-200 (2015).</li>
<li>Yang, X., Jost, A. P. T., Weiner, O. D., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-inducible+organelle-targeting+system+for+dynamically+activating+and+inactivating+signaling+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A light-inducible organelle-targeting system for dynamically activating and inactivating signaling in budding yeast.</a> Molecular biology of the cell. 24 (15), 2419-2430 (2013).</li>
<li>Lee, S., Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+protein+inactivation+by+optogenetic+trapping+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Reversible protein inactivation by optogenetic trapping in cells.</a> Nature methods. 11 (6), 633-636 (2014).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nat Biotechnol. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Zoltowski, B. D., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-induced+dimerization+of+a+bacterial+LOV-HTH+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein.</a> Biochemistry. 52 (38), 6653-6661 (2013).</li>
<li>Renicke, C., Schuster, D., Usherenko, S., Essen, L. O., Taxis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+LOV2+Domain-Based+Optogenetic+Tool+to+Control+Protein+Degradation+and+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">A LOV2 Domain-Based Optogenetic Tool to Control Protein Degradation and Cellular Function.</a> Chemistry & Biology. 20 (4), 619-626 (2013).</li>
<li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+the+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Description of the chemostat.</a> Science (New York, N.Y.). 112 (2920), 715-716 (1950).</li>
<li>Monod, J. La technique de culture continue. Théorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79 (4), 390-410 (1950).</li>
<li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-switchable+gene+promoter+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20, 1041-1044 (2002).</li>
<li>Kennedy, M. J., Hughes, R. M., Peteya, L. A., Schwartz, J. W., Ehlers, M. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+blue-light-mediated+induction+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.</a> Nature Methods. 7, 973-975 (2010).</li>
<li>Olson, E. J., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+characterization+methods+overcome+key+challenges+in+synthetic+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic characterization methods overcome key challenges in synthetic and systems biology.</a> Nature chemical biology. 10 (7), 502-511 (2014).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+An+experimental+organism+for+21st+century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: An experimental organism for 21st century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Galanie, S., Smolke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+yeast-based+production+of+medicinal+protoberberine+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">Optimization of yeast-based production of medicinal protoberberine alkaloids.</a> Microbial cell factories. 14 (1), 144(2015).</li>
<li>Gerngross, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+production+of+human+therapeutic+proteins+in+yeasts+and+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi.</a> Nature biotechnology. 22 (11), 1409-1414 (2004).</li>
<li>van Maris, A. J. A., Abbott, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fermentation+of+carbon+sources+in+biomass+hydrolysates+by+Saccharomyces+cerevisiae%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fermentation of carbon sources in biomass hydrolysates by Saccharomyces cerevisiae: current status.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90 (4), 391-418 (2006).</li>
<li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+control+of+microscopes+using+%C2%B5Manager%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer control of microscopes using µManager.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 14 (2010).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.jbmethods.org/jbm/article/view/36/0">Advanced methods of microscope control using µManager software.</a> Journal of biological methods. 1 (2), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/1438429/">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li>
<li>Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+homeostasis+in+batch+and+steady-state+culture+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nutritional homeostasis in batch and steady-state culture of yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 15, 4089-4104 (2004).</li>
<li>Boer, V. M., Tai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+responses+of+Saccharomyces+cerevisaie+to+preferred+and+nonpreferred+nitrogen+sources+in+glucose-limited+chemostat+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Transcriptional responses of Saccharomyces cerevisaie to preferred and nonpreferred nitrogen sources in glucose-limited chemostat cultures.</a> FEMS Yeast Research. 7, 604-620 (2007).</li>
<li>Boer, V. M., Amini, S., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+genotype+and+nutrition+on+survival+and+metabolism+of+starving+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 6930-6935 (2008).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response and metabolic activity in yeast.</a> Molecular Biology of the Cell. 19, 352-367 (2008).</li>
<li>Gresham, D., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+utility+of+continuous+culturing+in+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution.</a> Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).</li>
<li>Liu, H., Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoexcited+CRY2+interacts+with+CIB1+to+regulate+transcription+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis.</a> Science (New York, N.Y.). 322 (5907), 1535-1539 (2008).</li>
<li>McIsaac, R. S., Oakes, B. L., Wang, X., Dummit, K. A., Botstein, D., Noyes, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+gene+expression+perturbation+systems+with+rapid%2C+tunable%2C+single-gene+specificity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Synthetic gene expression perturbation systems with rapid, tunable, single-gene specificity in yeast.</a> Nucleic Acids Research. 41 (4), 1-10 (2013).</li>
<li>McIsaac, R. S., Petti, A. A., Bussemaker, H. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation-based+analysis+and+modeling+of+combinatorial+regulation+in+the+yeast+sulfur+assimilation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Perturbation-based analysis and modeling of combinatorial regulation in the yeast sulfur assimilation pathway.</a> Molecular biology of the cell. 23 (15), 2993-3007 (2012).</li>
<li>McIsaac, R. S., Silverman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-acting+and+nearly+gratuitous+induction+of+gene+expression+and+protein+depletion+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Fast-acting and nearly gratuitous induction of gene expression and protein depletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular biology of the cell. 22 (22), 4447-4459 (2011).</li>
<li>Melendez, J., Patel, M., Oakes, B. L., Xu, P., Morton, P., McClean, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optogenetic+control+of+intracellular+protein+concentration+in+microbial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 6 (3), 366-372 (2014).</li>
<li>Brauer, M. J., Huttenhower, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+growth+rate%2C+cell+cycle%2C+stress+response%2C+and+metabolic+activity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast.</a> Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).</li>
<li>Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-limiting+intracellular+metabolites+in+yeast+growing+under+diverse+nutrient+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations.</a> Molecular biology of the cell. 21 (1), 198-211 (2010).</li>
<li>Markham, B. E., Byrne, W. J., Methods, E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/j.2050-0416.1967.tb03043.x/pdf">Uptake, storage and utilization of phosphate by yeast.</a> Journal of the Institute of Brewing. 73, 271-273 (1967).</li>
<li>Kazemi Seresht, A., Palmqvist, E. A., Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+phosphate+scarcity+on+pharmaceutical+protein+production+in+S.+cerevisiae%3A+linking+transcriptomic+insights+to+phenotypic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+cell+factories%22%5BJournal%5D)">The impact of phosphate scarcity on pharmaceutical protein production in S. cerevisiae: linking transcriptomic insights to phenotypic responses.</a> Microbial cell factories. 10 (1), 104(2011).</li>
<li>Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+Systems+of+Bacteria+such+as+Escherichia+coli+in+Response+to+Nutrient+Limitation+and+Environmental+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Regulation Systems of Bacteria such as Escherichia coli in Response to Nutrient Limitation and Environmental Stresses.</a> Metabolites. 4 (1), 1-35 (2013).</li>
<li>Olson, E. J., Hartsough, L. A., Landry, B. P., Shroff, R., Tabor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+bacterial+gene+circuit+dynamics+with+optically+programmed+gene+expression+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing bacterial gene circuit dynamics with optically programmed gene expression signals.</a> Nature methods. 11 (4), 449-455 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Biz esneklik düşünülerek bu cihazı tasarladı. Kullanılan tüm kod ücretsiz ve açık kaynak. Segment hücrelere varsayılan görüntü analizi süreci basit ve hızlı bir şekilde çalışır. Özel analizi, FIJI grafik kullanıcı arayüzü ile temsili bir görüntüsünü analiz eden bir Beanshell komut girişini dönüştürme ve sonra komut dosyasını çağırmak için eklenti ayarlarken kullanıcı girişi kayıt ile uygulanabilir. o çağrıldığında, bu komut arka plan çıkarılır görüntülerin en son setine dosya yollarını içeren &quot;resimler&quot; olarak...

Optogenetic sistemleri gen ekspresyonu, 1, 2, 3, 4, 5 protein lokalizasyonu, 6 protein aktivitesini, 6, 7, 8 protein bağlama, 8, 9, 10 ve protein degradasyonunu da dahil olmak üzere hücresel süreçleri artan listesini kontrol etmek için ışık kullanır. Programlı optik stimülasyon ile kontrollü bir ortamda hücrelerin kültüre ve biyolojik ilgili zaman ölçekleri üzerindeki tepkisini ölçmek için 11 bir yöntem hücre biyolojisi ve biyoteknoloji araştırma için bu araçların potansiyelini gereklidir. Önerilen yöntem, AE, iyi karışmış sürekli bir hücre büyüme hızını sabitlemek için chemostasis yararlanırpuan ve programlanan aydınlatma maruz sıcaklık kontrollü cam kültürleme kabı 12, 13. bir inverted mikroskop ile kültür atık suyunda görsele tek tek hücreler programlanmış aydınlatma kültür tepkisini ölçmek için. floresan yoğunluğu ve atık hücre kültürünün hücresel morfoloji kullanıcı girişi olmadan birden fazla gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır. Bu protokol, büyüyen hücre kültürü ve mikroskopi aşina en laboratuvarlarında uygulanabilir ve kullanılan cihaz ucuz ve kolaylıkla temin edilebilen bileşenler yapılmıştır. Şeffaf bir kültürleme kabı ışık 1 uW / cm2 -10 mW / cm2 yayabilen ışık yayan diyotlar (LED), bir matris üzerine yerleştirilir. Mikroplar sürekli kültür kabında yetiştirilir; bir peristaltik pompa de medya eklemek için kullanılırseyrelme oranı, bir mikroskop daha az bir oranda kültür çekmek için kullanılır ve fark, taşma çıkışı kaçar. Bir ısıtma yastığı sıcaklığını koruyor. Hava sürekli pozitif basıncı muhafaza etmek ve karıştırmak ve havalandırmak için kültür kültür kabına pompalanır. Hava pompası dışında, bu cihazlar için güç aynı zamanda bir termometre ve bağlı masaüstü bilgisayardan giriş alır bir mikro denetleyici tarafından düzenlenir. atık hücre kültürü ters bir mikroskop sahnede bir mikroakışkan cihaz pompalanır. Floresan olmayan ve floresan görüntüler otomatik olarak elde edilir. Görüntülerde hücreler ilgi (ROI) bir bölge olarak her bir hücreyi bulur ve her ROI özelliklerini ölçen bir algoritma ile karakterizedir. Bu protokolün bir uygulama göstermek için, bir mavi ışık responsi ile mühendislik Saccharomyces cerevisiae hücreleri değişen ışık şiddetlerinde yanıt ölçülenfloresan protein transkripsiyonunu kontrol eden Optogenetic Sistemi. Bu sistemde gen ekspresyonunu kontrol etmek için çok sayıda Optogenetic sistemleri zaten 14, 15, 16 bulunduğu için yaygın olarak ekmek mayası olarak bilinen, S. cerevisiae, seçilmiştir. Bundan başka, bu model organizma yaygın sistem biyolojisi 17 ve biyo teknolojik uygulamalarda 18, 19, 20 için bir şasi gibi çalışmaları için kullanılır. Bizim Örnek Sonuçlar Bu protokol, giriş ışık değişen yoğunluklarda ve flüoresan raportör üretimini ölçerek çok gün boyunca kültürü transkripsiyonunu kontrol etmek için kullanılabileceğini gösterir.

<table><tbody><tr><td>Kapsamlı laboratuvar kılavuzu</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Kapsamlı, düzenli olarak güncellenen bir laboratuvar kılavuzu şu adreste mevcuttur: " Optogenetik Kemostat Dosyaları" GitHub deposu (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Bu aynı zamanda temsili sonuçları oluşturmak için kullanılan mikroakışkan kalıbın bir tanımını da içerir.</td></tr><tr><td>Fritzing Design Viewer</td><td>Fritzing</td><td>NA</td><td>.fzz tipi devre kartı tasarımlarını görüntülemek ve düzenlemek için ücretsiz, açık kaynaklı yazılım "http://fritzing.org/download/" adresinde mevcuttur</td></tr><tr>. <td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - montajlı)</td><td>Adafruit</td><td>50</td><td>Mikrodenetleyici. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Arduino İstiflenebilir Başlık Kiti</td><td>SparkFun Electronics</td> PCB'yi mikrodenetleyiciye bağlamak için <td>10007</td><td>Dişi pin başlıkları. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Ayarlanabilir 30W 110V havya - XY-258 110V</td><td>Adafruit</td><td>180</td><td>PCB'ye elektrik bağlantıları yapmak için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Havya standı</td><td>Adafruit</td><td>150</td><td>PCB'ye elektrik bağlantıları yapmak için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Mini Lehim makarası - 60/40 kurşun reçine çekirdekli lehim 0.031" çap - 100g</td><td>Adafruit</td><td>145</td><td>PCB'ye elektrik bağlantıları yapmak için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>0.1 ve mu; F kondansatör</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-08375</td><td>PCB'deki voltajı stabilize eder. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>10 & mu; F kondansatör</td><td>SparkFun Electronics</td><td>COM-00523</td><td>PCB'deki voltajı stabilize eder. 1 gerekli.</td></tr><tr><td>MAX7219CNG LED Matris/Rakam Ekran Sürücüsü - MAX7219</td><td>Maxim</td><td>MAX7219CNG</td><td>LED sürücüsü. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>8 pin IC Soket</td><td>Mouser Electronics</td><td>575-144308</td><td>16 gereklidir. Bunlar, LED matrisinin üzerindeki kültür kabını desteklemek için üst üste istiflenecektir.</td></tr><tr><td>24 Pin IC soketi</td><td>Mouser Electronics</td><td>535-24-3518-10</td><td>İsteğe bağlı. MAXIM 7219CNG sürücüsünü PCB'ye ters yönde takmak için bunu kullanın.</td></tr><tr><td>Dijital multimetre</td><td>Adafruit</td><td>2034</td><td>Elektronik sorun giderme için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Break Away Başlıkları - 40 pinli Erkek (Uzun Merkezli, PTH, 0.1")</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT-12693</td><td>Baskılı devre kartına bağlı LED matrisi için erkek pin başlıkları. Uçlar tel kesiciler ile kesilebilir. 1 set gereklidir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gömme diyagonal tel kesiciler</td><td>Adafruit</td><td>152</td><td>Uzun pim başlıklarını kırpmak ve güç kablolarını kesmek için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Premium Dişi/Dişi Jumper Telleri - 40 x 12" (300mm)</td> <td>Adafruit</td><td>793</td><td>Breadboard'u LED matrisine bağlamak için tel şerit. Daha uzun olması için erkek pin başlıkları ile uçtan uca bağlanabilir. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Yarım boy breadboard</td><td>Adafruit</td><td>64</td><td>LED matrisi buna bağlanacak ve kültür kabı bunun üzerinde duracaktır.</td></tr><tr><td>Minyatür 8x8 Mavi LED Matrix</td><td>Adafruit</td><td>956</td><td>Işık kaynağı. Baskın dalga boyu 470nm'dir (mavi). 1 gereklidir. Aynı satıcıdan alternatif minyatür LED matrisleri baskın dalga boylarında mevcuttur: 624 nm (kırmızı), 588 nm (sarı), 525 nm (yeşil), 572 nm (sarı-yeşil) ve beyaz.</td></tr><tr><td>İstiflenebilir başlık-3 pinli</td><td>SparkFun Electronics</td><td>13875</td><td>8 gereklidir.</td></tr><tr><td>Direnç Kiti - 1/4W (toplam 500)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>10969</td><td>Elektronik için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>&nbsp; IRL520N MOSFET</td><td>Uluslararası Doğrultucu</td><td>IRL520N</td><td>DC akımını kontrol etmek için voltaj ayar anahtarı. 4 gereklidir.</td></tr><tr><td>Bağlantı Teli - Çeşitler (Katı Çekirdek, 22 AWG)</td><td>SparkFun Electronics</td><td>PRT 11367</td><td>Elektronik için tel. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>5V 2A (2000mA) anahtarlamalı güç kaynağı - UL Listeli</td><td>Adafruit</td><td>276</td><td>Isıtma yastığı ve Arduino için güç kaynağı. 2 gereklidir.</td></tr><tr><td>12 VDC 1000mA ayarlı anahtarlamalı güç adaptörü - UL listeli</td><td>Adafruit</td><td>798</td><td>Peristaltik pompalar için. 2 gereklidir.</td></tr><tr><td>Elektrikli Isıtma Yastığı - 10cm x 5cm</td><td>Adafruit</td><td>1481</td><td>Biyoreaktörü ısıtmak için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Düşük akışlı değişken akışlı peristaltik pompa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-1</td><td>Ortam pompalamak için. 1 gerekli</td></tr><tr><td>Orta akışlı değişken akışlı peristaltik pompa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>Kültürü pompalamak için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>9 VDC 1000mA ayarlı anahtarlamalı güç adaptörü - Mikrodenetleyici güç kaynağı için UL listeli</td><td>Adafruit</td><td>63</td><td>. Sipariş 1.</td></tr><tr><td>Yüksek Sıcaklık Su Geçirmez DS18B20 Dijital sıcaklık sensörü + ekstralar</td><td>Biyoreaktör için Adafruit</td><td>642</td><td>Termometre. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Micromanager Micromanager</td><td></td><td>NA</td><td>Ücretsiz, açık kaynaklı mikroskop kontrol yazılımı "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>ImageJ</td><td>NA'da</td><td>mevcuttur. Ücretsiz, açık kaynaklı görüntü analiz yazılımı "http://fiji.sc/"da mevcuttur</td></tr>. <tr><td>Arduino Entegre Geliştirme Ortamı</td><td>Arduino</td><td>NA</td><td>Ücretsiz, açık kaynaklı IDE şu adreste mevcuttur: "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"</td></tr><tr><td>Özel kod</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>Özel mikrodenetleyici kodu ve "Biyoreaktör Denetleyicisi" eklentisi " Optogenetik Kemostat Dosyaları" GitHub deposu (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>USB Kablosu A'dan B'ye - 6 Ayak</td><td>SparkFun Electronics</td><td>CAB-00512</td><td>Verileri mikrodenetleyiciye indirmek için kullanılır. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>bioreactorTimecourse_example.csv</td><td>GitHub</td><td>NA</td><td>LED matris değerlerini bir CSV dosyasından yüklemenin avantajı, görüntü analizi sonuçlarına dayalı olarak bu değerleri güncellemek için eklenti tarafından bir programın çağrılabilmesi ve bu değerlerin mikrodenetleyiciye yeniden yüklenerek geri besleme kontrolünü etkinleştirebilmesidir. Şuradan edinilebilir: " Optogenetik Kemostat Dosyaları" GitHub deposu (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).</td></tr><tr><td>Tota-frost jelleri (difüzyon kağıdı)</td><td>B& H</td><td>B & H # LOFSFTL MFR # T1-72</td><td>LED matrisi için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Kit Levha Crosslink 1 / 4x12x24in</td><td>Grainger, inc</td><td>20JL37</td><td>Gemi muhafazasını kültürlemek için siyah köpük. 4 gereklidir.</td></tr><tr><td>Standart Fotodiyot Güç Sensörü, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>Işık yoğunluğunu ölçmek için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Etiketleme Bandı</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015N</td><td>Gevşek bileşenleri etiketlemek ve sabitlemek için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Kompakt Güç ve Enerji Ölçer Konsolu, Dijital 4" LCD</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Işık yoğunluğunu ölçmek için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>100mL GL45 hibridizasyon cam şişe</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>(7910-40150)</td><td>Biyoreaktör kabı. 1 gerekli.</td></tr><tr><td>Altı liman montajı</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>Özel&nbsp;</td><td>Biyoreaktör kabı için. Boru Özellikleri: .125 "OD x .055" ID. Bağlantı Noktası A: 1.0 "uzun kapak sümüklü böceğinin üstünde ve tüpün altına. Bağlantı Noktaları B, C, E, F: 1.0 "uzunluğunda kapak sümüklü böcek, 33 mm uzunluğunda. Bağlantı Noktası D: 1.0 "uzunluğunda kapak üstü sümüklü böcek, 65 mm & nbsp; uzun aşağıda. 1 gereklidir. 45 mm çapında polipropilen üstü açık vidalı kapak ve kapak ile kap arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için beyaz silikon conta içerir.</td></tr><tr><td>Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 İnç, 3'lü Paket</td><td>Amazon</td><td>B0009F3P3U</td><td>Şeffaf viski bandı. Bu, diğer birçok satıcıdan edinilebilir. Kültür kabı üzerindeki işaretleri kapatmak ve kapak camını PDMS kanalı ile alüminyum destek çerçevesine sabitlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>1/16 "ID x 3/16" OD x 1/16 "Wall Tygon Sıhhi Silikon Boru</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Plastik A.Ş.</td><td>57288</td><td>Boru. ~25' gerekli.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Twistit beyaz kauçuk tıpa, boyut 10</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-62992-32</td><td>Ortam şişesi tıpası ve atık su şişesi tıpası. 2 gereklidir.</td></tr><tr><td>2L Laboratuvar Şişesi</td><td>Pyrex</td><td>4980</td><td>Ortam şişesi ve atık su şişesi. 2 gereklidir.</td></tr><tr><td>Gündüz çimdikleme</td><td>Fisher Scientific</td><td>5867</td><td>Tüpleri sıkıştırmak için. 3 gereklidir.</td></tr><tr><td>Yedek boru tertibatı 1/16" ID</td><td>İzlenebilir Ürünler</td><td>3372</td><td>Peristaltik pompalar bir dizi tüple birlikte gelir, ancak haftalarca kullanımdan sonra yıpranırlar.</td></tr><tr><td>Yedek boru tertibatı 1/50" ID</td><td>İzlenebilir Ürünler</td><td>3371</td><td>Peristaltik pompalar bir dizi tüple birlikte gelir, ancak haftalarca kullanıldıktan sonra yıpranırlar.</td></tr><tr><td>Kilit halkalı erkek luer x 1/16" hortum dikeni, Naylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td>Konnektörler. ~10 luer gereklidir.</td></tr><tr><td>Kilit halkalı erkek luer x 1/8" hortum dikeni, Naylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-04</td><td>Konnektörler. Boruyla doldurmak için her kauçuk durdurucu deliği için bir tane olmak üzere 5 adet gereklidir.</td></tr><tr><td>Dişi luer x 1/16" hortum dikeni adaptörü, Naylon, 25/pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-00</td><td>Konnektörler. ~ 10 luer gereklidir.</td></tr><tr><td>Dişi luer x 3/16 "hortum dikenli adaptör</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45502-08</td><td>Konektörler. ~ 10 luer gerekli.</td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Aksesuarı, Dişi Luer Şapkası, Naylon, 25/Pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>SC-45502-28</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Luer Aksesuarı, Erkek Luer Kilit Fişi, Naylon, 25/Pk</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-56</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Delikli PTFE Boru, 0.022 "ID x 0.042" OD, 100 ft / rulo</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td>Boru. 1 rulo gereklidir.</td></tr><tr><td>Masterflex platinle kürlenmiş silikon boru, L/S 13, 25 ft</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-13</td><td>Boru. ~25' gerekli.</td></tr><tr><td>3/16 "ID x 1/4" OD x 1/32 "Wall Tygon Sıhhi Silikon Boru</td><td>Amerika Birleşik Devletleri Plastik A.Ş.</td><td>57293</td><td>Boru. ~1' gerekli.</td></tr><tr><td>Vakum filtresi</td><td>Fisher Scientific</td><td>974107</td><td>steril filtreleme ortamı için Nalgene vakum filtresi.</td></tr><tr><td>Aquel Oxy-Boost 200</td><td>Rena Aquatic Supply</td><td>AP200</td><td>Ortamları havalandırmak ve karıştırmak için çift diyaframlı ayarlanabilir akışlı hava pompası. 1 gerekli.&nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 ve mu; m gözenekli şırınga filtresi</td><td>Corning International</td><td>431229</td><td>Bu, akvaryum pompasından gelen havanın cihazı kirletmemesini sağlar. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Slygard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td>Mikroakışkan cihaz için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Amerikan Güvenlik Tıraş Bıçağı GEM Scientific Tek Kenarlı Tıraş Bıçakları</td><td>Fisher Scientific</td><td>17989000</td><td>Tüpleri ve PDMS'yi kesmek için. 1 bıçak gereklidir.</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core delgeç 1.2mm ID</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHAWB100028 ALDRICH</td><td>Mikroakışkan cihazda giriş/çıkış delmek için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı 22x60-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Mikroakışkan cihaz için. 1 gereklidir.</td></tr><tr><td>Kare pencereli dikdörtgen alüminyum çerçeve</td><td>Özel</td><td>Özel</td><td>Mikroakışkan kanalı desteklemek için. Dış boyutlar: 3 inç x 1,25 inç. İç kısmalar (kesilmiş kısım): 7/8 inç x 7/8 inç Kalınlık: ~ 1/32 inç</td></tr></tbody></table>

mikrobiyal optogenetic uygulamaları tasarım ve otomatik aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme sistemi uygulaması

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic sistemleri hücresel prosesleri değiştirebilir ve ışık spesifik dalga boylarında yanıt olarak şekil değiştirirler genetik olarak kodlanmış proteinleri kullanılmaktadır. Optogenetic sistemlerin aydınlatma ve stimülasyon programlanan kullanan sistemler kültürlenmesi ve ölçülmesi için bir ihtiyaç vardır. Biz bina ve ışık programlanmış dozlarda mikrobiyal hücrelerin aydınlatmak ve otomatik olarak kazanmak ve atık hücrelerin görüntülerini analiz etmek için sürekli bir kültür cihazı kullanılarak bir protokol mevcut. Bir kemostat bu düzeneğin çalışması büyüme ve hücre ortamı sıkı bir şekilde kontrol edilmesini sağlar. sürekli hücre kültürü atık düzenli örneklenmiş ve hücreler çok kanallı mikroskobu ile görüntülenmiş. floresan yoğunluğu ve kültür mahsulünden örneklenen hücrelerin hücresel morfoloji dinamik tepkiler birden fazla gün boyunca ölçülen böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik olankullanıcı girişi olmadan. Dinamik olarak transkripsiyonu aktive bir Optogenetic sistemi ile işlenmiş, Saccharomyces cerevisiae protein üretimini indükleyen bu kültürleme cihazının kullanımını göstermektedir.

Bu aygıt, cry2 / CIB1 proteini çifti 30 göre, indüklenebilir kopyalama Optogenetic sistemi ile mavi ışığa karşılık olarak sarı floresan protein (YFP) ifade S. cerevisiae'nin kültürü teşvik etmek için kullanıldı. Hücreler 0.2 ± 0.008 ortalama seyrelme oranı ile fosfat sınırlı medyada chemostatically yetiştirilmiştir. Fosfat sınırlama genel olarak büyüme oranını kontrol etmek için, S. cerevisiae kemostat deneylerde kullanılan ve fosfat sınırlı etki...

Biz bir inverted mikroskop ile atık mikropların kültürler ve düzenli görüntü hücrelere aydınlatmak için Optogenetic sistemleri ile kullanım için sürekli bir kültür cihazı tasarlanmıştır. aydınlatma dinamik tepkiler birkaç gün içinde ölçülebilir, böylece kültür, örnekleme, görüntüleme ve görüntü analizi tam otomatik vardır.

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Bu prosedürün genel amacı, optogenetik mikropların aydınlatılmasına verilen tepkinin gerçek zamanlı olarak ve birkaç gün boyunca otomatik olarak bir mikroskopla ölçülebildiği sürekli bir kültür kabı oluşturmaktır. Bu yöntem, hücresel biyoloji ve metabolik mühendislikte, dinamik gen ekspresyonunun statik gen ekspresyonundan farklı tepkileri nasıl ortaya çıkarabileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, sürekli kültürün ölçümlerin birden fazla gün boyunca toplanmasını sağlamasıdır.Başlamak için, dijital termometrenin toprak hattını, veri hattını ve pozitif voltaj hattını baskılı devre kartına lehimleyin. Dişi üç pimli başlıktan bir pimi kesin ve kalan iki pimi kesin. Bunu R2 etiketli delik çiftine lehimleyin ve pim başlığına 4,7 kilo ohm'luk bir direnç yerleştirerek iki lehimli pimi bağlayın.Ardından, kalan bileşenleri devre kartına bağlayın. Devre kartını mikro denetleyicinin üzerine yerleştirin. Işık geçirmez muhafazayı kurun ve tüm yazılımları beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi yükleyin.İlk olarak, alüminyum portun uzun ucunu contadan geçirerek kültür kabına yerleştirin ve kapağı vidalayın. Bir kısa alüminyum bağlantı noktası çıkışını orta çaplı silikon boru ile kapatın. Bir dişi luer kilidi takarak ve ardından bir erkek luer kilit fişi bağlayarak damıtma ucunu takın.Bu priz tamamlayıcıdır ve kullanılmayacaktır. Orta çaplı silikon borunun iki kısa segmentini erkek ve dişi luer kilitleriyle bağlayın. Ardından bir ucunu kısa bir alüminyum bağlantı noktası prizine bağlayın ve damıtma ucunu takın.Damar bu tüp aracılığıyla aşılanacaktır. Ardından, orta çaplı peristaltik boru ve konektörlerin uçlarına iki orta boy tüp bağlayın. Bir ucunu kısa bir alüminyum bağlantı noktasına bağlayın ve diğer ucunu takın.Daha sonra, bu medya şişesine bağlanacaktır. Orta çaplı bir silikon tüpü en uzun alüminyum bağlantı noktasına bağlayın. Tüp, medya şişesine ulaşacak kadar uzun olmalıdır.Sonuna kadar birkaç inç uzunluğunda başka bir kısa segment bağlayın ve ardından medya şişesindeki lastik tıpaya yerleştirin. Tüpü kelepçeleyin. Daha sonra kelepçesi açıldığında, bu bağlantı kültürün karıştırılmasına, havalandırılmasına ve gelen kabarcıklar tarafından pozitif bir basınçta tutulmasına izin verir.Şişenin dibine ulaşacak kadar uzun orta çaplı bir boruyu, içinden ortamın aktarılacağı durdurucuya yerleştirin. Buna başka bir orta çaplı boru ve ardından ucuna geniş çaplı bir boru bağlayın. Damıtma ucunu takın.Durdurucudaki üçüncü deliği, orta çaplı borunun diğer iki parçasına bağlı ve damıtma ucuna tıkalı kısa bir orta çaplı boru segmenti ile doldurun. Bu bir vakum pompasına ve daha sonra bir akvaryum pompasına bağlanacaktır. Dar çaplı silikon borunun bir segmentine bir erkek luer kilidi yerleştirin ve ardından PTFE boruyu sıkıca yerleştirin.Ardından orta çaplı bir tüpe dişi luer kilidi takın. Kilitleri ve diğerini kısa bir alüminyum bağlantı noktasına bağlamak için dişi kilidi PTFE tüpü boyunca geçirin. Kültür kabının içindeki PTFE tüpünün, ikinci en uzun alüminyum borunun altında ve tabanın üzerinde sallandığından emin olun.Gerektiği gibi kırpın. Medya buradan görüntüleme kanalına örneklenecek ve dar boru ara hacmi en aza indirecektir. Ardından, açıkta kalan dar silikon tüpü dar peristaltik tüpe ve konektörlere bağlayın.Buna, üç dar çaplı boru segmentini ve iki segment PTFE borusunu dönüşümlü olarak bağlayın. Bunu orta çaplı boru ile atık su şişesine bağlayın. Ardından, orta çaplı bir silikon tüpün bir ucunu, atık su şişesinin diğer ucundaki alüminyum portun ikinci en uzun tüpüne bağlayın.Bu alüminyum tüp, kültür hacmini ayarlar ve fazla kültür, atık su kabına taşar. Şişenin kapaklarını alüminyum folyo ile sarın ve ardından düzeneği 121 santigrat derece ve 15 PSI'da 30 dakika otoklavlayın. Vakum filtresini 100 mililitrelik bir şişeye takın.Emzik kapağını çıkarın ve ardından steril cımbızla vakum filtresinin emziğinden beyaz tapayı çıkarın. Geniş silikon tüpü meme ucuna, medya şişesinin diğer serbest tüpünü bir vakum pompasına bağlayın ve medya şişesini kültür kabına bağlayan üçüncü tüpün kenetlenerek kapatıldığından emin olun. Filtreyi ortamla doldurun, vakum pompasını açın ve ardından ortamın geri kalanını filtreleyin.Vakuma bağlı orta silikon boruyu kelepçeleyin ve vakum pompasını kapatın. Vakum pompasına bağlı orta silikon borunun ara segmentinden luerleri çıkarın ve steril bir şırınga hava filtresinin mavi ucunu bu tüpe yerleştirin. Ardından geniş silikon tüpü kelepçeleyin ve erkek luer'i ondan ayırın.Fişi, kültür kabının medya giriş borusunun dişi luerinden çıkarın. Ortamın kültür kabına pompalanmasını sağlamak için bu luerleri bağlayın. Ardından, filtreyi 100 mililitrelik şişeden çıkarın ve şişe kapağını takın.Bir başlangıç kültürü hazırlamak için bu ortamı kullanın. Geri akışı önlemek için sürekli kültür düzeneğini, ortam şişesi kültür kabından daha yüksek ve atık su şişesi kültür kabından daha düşük olacak şekilde bir mikroskobun yanına yerleştirin. Ortam ve atık su şişeleri üzerindeki lastik tıpaları güvenli bir şekilde bantlayın.Daha sonra, PTFE tüpünün uçlarını dar silikon tüpten çıkarın, onları bağlayın ve bu uçları hazırlanmış bir mikroakışkan cihazın giriş ve çıkışına takın. Ardından, şırınga hava filtresinin beyaz ucunu akvaryum pompasına bağlayarak ortamı kültür kabına itin. Ortam, atık su portu seviyesine ulaştığında, orta ortam giriş borusunu ve konektörlerini yavaş peristaltik pompanın etrafına ve dar numune çıkış borusunu ve konektörlerini hızlı peristaltik pompanın etrafına sarın.Ortam şişesi ile kültür kabı arasındaki hava tüpünü açarak ortamı havalandırın. Ardından, sıcaklığının kontrol edilebilmesi için ısıtma yastığını ve termometreyi kültür kabına bantlayın. Medya borusunu kültür kabının etrafına sarın, böylece giren ortam kap ile aynı sıcaklıkta olacaktır.Ardından kültür kabını LED matrisinin üzerindeki siyah köpük muhafazaya yerleştirin ve tüplerin sıkışmadığından emin olun. Yavaş medya pompasını her 30 saniyelik aralığın onda biri için çalıştırmak için biyoreaktör kontrol eklentisini kullanın. Akış hızı çok düşük, ancak buharlaşma hızından daha büyük olacaktır.Gelen hava tüpünü medya şişesi ile kültür kabı arasına sıkıştırın. Kültür kabını bir başlangıç kültüründen bir mililitre ile aşılamak için bir pipet kullanın. Daha sonra bu tüpün damıtma ucunu kelepçeleyin ve hava tüpünü açın.Kültürün bir gecede büyümesine izin verin. Muhafazayı, ışık girmeyecek şekilde örtün. Ertesi gün, peristaltik pompaları istenen ortama ve örnekleme akış hızlarına karşılık gelen daha uzun bir süre dönecek şekilde ayarlamak için biyoreaktör kontrolör eklentisini kullanın.Kültür yoğunluğunun gece boyunca dengelenmesine izin verin. Ertesi gün, sahne konumu listesini ve mikro yöneticisi, mikroakışkan kanala pompalanan hücrelerin odak düzleminde olacağı bir dizi örtüşmeyen konumla doldurun. Ardından biyo reaktör denetleyici eklentisini açın.Komut istemlerinden istediğiniz LED matris zaman rotasını, görüntüleme kanallarını ve diğer deneysel ayarları seçin ve ardından veri toplamaya başlayın. Bu aparat, indüklenebilir bir optogenetik transkripsiyon sistemi aracılığıyla mavi ışığa yanıt olarak sarı floresan proteini eksprese eden bir saccharomyces cerevisiae kültürünü uyarmak için kullanıldı. Mikroakışkan kanalın baz kontrast ve floresan görüntüleri elde edildi.Faz kontrast görüntülerinden hücre ana hatları tanımlandı, floresan görüntülerle eşleştirildi ve floresan görüntüler gerçek zamanlı olarak kaydedildi. Buradaki ısı haritası, optogenetik sistemin aktivasyonu üzerine sarı floresan protein üretimine bağlı olarak bir kültürün floresan dağılımını göstermektedir. Yaklaşık 170.000 hücrenin floresansı, 70 saat boyunca 28 aşama pozisyonundan elde edilen 30.000'den fazla görüntüden analiz edildi.Bu çalışma sırasında, kültür altı saatlik aralıklarla değişen yoğunluklarda mavi ışığa maruz bırakıldı, ardından altı saat tam karanlık izledi. Hücreler ilk ölçümden önce ışığa maruz bırakılmıştı, bu yüzden ilk karanlık dönemde floresan yoğunluğu azalmaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, üç gün boyunca sekiz saat içinde yapılabilir.Bu işlemi denerken steril tekniği kullanmak çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, protein konsantrasyonunu kontrol etmek için gerçek zamanlı geri bildirim kontrolü gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu teknik, optogenetik yapılara sahip organizmaların, plakalar veya toplu kültür kullanılarak mümkün olandan daha uzun süreler boyunca dinamik olarak incelenmesini sağlayacaktır.Bu videoyu izledikten sonra, optogenetik mikropları uyarmak ve incelemek için sürekli bir kültür cihazının, bir ışığın ve bir mikroskobun nasıl entegre edileceğini iyi anlamış olmalısınız.

design-implementation-an-automated-illuminating-culturing-sampling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Optogenetik, davranışsal sinirbilim deneylerinde kullanım için güçlü bir araç haline geldi. Bu protokol, lazer sistemlerinin tasarımı ve kurulumu için adım adım bir kılavuz sunar ve çoğu kemirgen davranışsal test paradigmasıyla uyumlu çoklu ve eşzamanlı in vivo optogenetik stimülasyonların gerçekleştirilmesi için tam bir protokol sağlar.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Bu protokol, PhyB ve PIF3 kullanarak kırmızı ve uzak kırmızı ışıkla gen ekspresyonunu kontrol etmek için optogenetik deneylerin nasıl yapılacağını açıklar. Gen ekspresyonunun veya diğer optogenetiğin bir bilgisayarla kontrol edilmesini sağlayan basit ve esnek bir aydınlatma sistemi oluşturmak için adım adım talimatlar dahildir.

Optogenetik Deneyler için Basit ve Çok Yönlü Bir Aydınlatma Sistemi Oluşturma

Işığa duyarlı memeli hücrelerini güvenilir bir şekilde kontrol etmek, optogenetik yöntemlerin standardizasyonunu gerektirir. Bu amaca yönelik olarak, bu çalışma, negatif geri beslemeli bir optogenetik gen devresini vaka çalışması olarak kullanarak ışığa bağlı gen ekspresyonunun çalışmasını standartlaştırmak için gen devresi yapımı, hücre mühendisliği, optogenetik ekipman çalışması ve doğrulama testlerinin bir boru hattını özetlemektedir.

Memeli Hücrelerinde Kararlı Optogenetik Gen Devrelerinin Güvenilir Mühendisliği ve Kontrolü

Küçük moleküllü bir substratı oksitleyen bir lusiferaz enzimi tarafından yayılan biyolüminesans ışığı, bir lusiferin, fotosensoriyel proteinleri aktive etmek için kullanılabilir, böylece ışık stimülasyonuna başka bir boyut ekler ve hücrelerde zamansal ve mekansal ölçeklerde çok sayıda ışık aracılı fonksiyonun manipülasyonunu sağlar.

Biyolüminesan Optogenetik 2.0: Fotosensör Proteinleri In Vitro ve In Vivo'yu Aktive Etmek için Biyolüminesanstan Yararlanma

Mikrobiyal metabolizmanın optogenetik kontrolü, fermantasyon süreçleri üzerinde esnek dinamik kontrol sağlar. Buradaki protokol, farklı hacimsel ölçeklerde kimyasal ve protein üretimi için mavi ışık ayarlı fermantasyonların nasıl kurulacağını göstermektedir.

Mikrobiyal Kimyasal ve Protein Üretimi için Işık Kontrollü Fermantasyonlar

İnsan mühendisliği iskelet kası dokusu ve optogenetik motonöronlar kullanarak nöromüsküler kavşak fonksiyonunu karakterize etmek için tekrarlanabilir, otomatik ve tarafsız bir görüntüleme sistemi tanımladık. Bu sistem, zaman içinde nöromüsküler bağlantının fonksiyonel olarak ölçülmesine izin verir ve nörotoksinlerin ve myastenia gravis hasta serumunun neden olduğu azalmış nöromüsküler fonksiyonu tespit eder.

İnsan Nöromüsküler Kavşağının Optogenetik Modelinin Mühendisliği ve Karakterizasyonu

Bu protokol, hücresel dağılımını ve ışık stimülasyonuna tepkisini doğru bir şekilde izlemek için cAMP sensörlerinin ve optogenetik bir protein olan bPAC-nLuc'un transfekte edilmesini içerir. Bir nokta tarama sistemi kullanarak bir cAMP yanıt haritası oluşturmaya yönelik yenilikçi yaklaşım, farklı alanlarda optogenetik proteinlerle yapılan araştırmaları ilerletme potansiyeline sahiptir.

Bir Işık Stimülasyon Izgarası Kullanarak Bir Optogenetik Proteinin Hücresel Dağılımının Haritalanması

Bu protokol, mayadaki optogenetik sistemlerin yüksek verimli karakterizasyonunu gerçekleştirmek için otomatik platform Lustró'yu kullanma adımlarını özetlemektedir.

Otomatik platform Lustro kullanılarak mayada yüksek verimli optogenetik deneyler

Bu protokol, protein aktivitesinin tersinir uzay-zamansal kontrolü için tasarlanmış bir mavi ışıkla aktive edilen allosterik anahtar (LightR) alanının uygulamasını açıklar. Src tirozin kinazını bir model olarak kullanan bu çalışma, ışık regüle edilmiş Src'yi (LightR-Src) geliştirmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yaklaşımın enzim sınıfları arasında çok yönlülüğünü göstermektedir.

Optogenetik Allosterik Regülasyon Yoluyla Protein Aktivitesinin Uzay-Zamansal Kontrolü

Bu çalışma, HEK293T hücrelerinde ışıkla indüklenebilir gen ekspresyonunu optimize etmek için 3D baskılı bir LED dizisi kullanan yüksek verimli deneyler için bir yöntemi açıklamaktadır.

Memeli Gen Ekspresyonunu Kontrol Etmek için Işıkla İndüklenebilir Bir Sistemin Hızlı Optimizasyonu

Öğrenin, sürekli kültürleme sistemiyle optogenetik mikropların ışık yanıtlarını gerçek zamanlı ve çok günlü ölçümle incelemeyi. Bu yöntem, hücre biyolojisi ve metabolik mühendislikte dinamik gen ifadesi araştırmalarına katkı sağlar.

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Daha fazla video keşfet