Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Bu prosedürün genel amacı, optogenetik mikropların aydınlatılmasına verilen tepkinin gerçek zamanlı olarak ve birkaç gün boyunca otomatik olarak bir mikroskopla ölçülebildiği sürekli bir kültür kabı oluşturmaktır. Bu yöntem, hücresel biyoloji ve metabolik mühendislikte, dinamik gen ekspresyonunun statik gen ekspresyonundan farklı tepkileri nasıl ortaya çıkarabileceği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, sürekli kültürün ölçümlerin birden fazla gün boyunca toplanmasını sağlamasıdır.

Başlamak için, dijital termometrenin toprak hattını, veri hattını ve pozitif voltaj hattını baskılı devre kartına lehimleyin. Dişi üç pimli başlıktan bir pimi kesin ve kalan iki pimi kesin. Bunu R2 etiketli delik çiftine lehimleyin ve pim başlığına 4,7 kilo ohm'luk bir direnç yerleştirerek iki lehimli pimi bağlayın.

Ardından, kalan bileşenleri devre kartına bağlayın. Devre kartını mikro denetleyicinin üzerine yerleştirin. Işık geçirmez muhafazayı kurun ve tüm yazılımları beraberindeki metin protokolünde açıklandığı gibi yükleyin.

İlk olarak, alüminyum portun uzun ucunu contadan geçirerek kültür kabına yerleştirin ve kapağı vidalayın. Bir kısa alüminyum bağlantı noktası çıkışını orta çaplı silikon boru ile kapatın. Bir dişi luer kilidi takarak ve ardından bir erkek luer kilit fişi bağlayarak damıtma ucunu takın.

Bu priz tamamlayıcıdır ve kullanılmayacaktır. Orta çaplı silikon borunun iki kısa segmentini erkek ve dişi luer kilitleriyle bağlayın. Ardından bir ucunu kısa bir alüminyum bağlantı noktası prizine bağlayın ve damıtma ucunu takın.

Damar bu tüp aracılığıyla aşılanacaktır. Ardından, orta çaplı peristaltik boru ve konektörlerin uçlarına iki orta boy tüp bağlayın. Bir ucunu kısa bir alüminyum bağlantı noktasına bağlayın ve diğer ucunu takın.

Daha sonra, bu medya şişesine bağlanacaktır. Orta çaplı bir silikon tüpü en uzun alüminyum bağlantı noktasına bağlayın. Tüp, medya şişesine ulaşacak kadar uzun olmalıdır.

Sonuna kadar birkaç inç uzunluğunda başka bir kısa segment bağlayın ve ardından medya şişesindeki lastik tıpaya yerleştirin. Tüpü kelepçeleyin. Daha sonra kelepçesi açıldığında, bu bağlantı kültürün karıştırılmasına, havalandırılmasına ve gelen kabarcıklar tarafından pozitif bir basınçta tutulmasına izin verir.

Şişenin dibine ulaşacak kadar uzun orta çaplı bir boruyu, içinden ortamın aktarılacağı durdurucuya yerleştirin. Buna başka bir orta çaplı boru ve ardından ucuna geniş çaplı bir boru bağlayın. Damıtma ucunu takın.

Durdurucudaki üçüncü deliği, orta çaplı borunun diğer iki parçasına bağlı ve damıtma ucuna tıkalı kısa bir orta çaplı boru segmenti ile doldurun. Bu bir vakum pompasına ve daha sonra bir akvaryum pompasına bağlanacaktır. Dar çaplı silikon borunun bir segmentine bir erkek luer kilidi yerleştirin ve ardından PTFE boruyu sıkıca yerleştirin.

Ardından orta çaplı bir tüpe dişi luer kilidi takın. Kilitleri ve diğerini kısa bir alüminyum bağlantı noktasına bağlamak için dişi kilidi PTFE tüpü boyunca geçirin. Kültür kabının içindeki PTFE tüpünün, ikinci en uzun alüminyum borunun altında ve tabanın üzerinde sallandığından emin olun.

Gerektiği gibi kırpın. Medya buradan görüntüleme kanalına örneklenecek ve dar boru ara hacmi en aza indirecektir. Ardından, açıkta kalan dar silikon tüpü dar peristaltik tüpe ve konektörlere bağlayın.

Buna, üç dar çaplı boru segmentini ve iki segment PTFE borusunu dönüşümlü olarak bağlayın. Bunu orta çaplı boru ile atık su şişesine bağlayın. Ardından, orta çaplı bir silikon tüpün bir ucunu, atık su şişesinin diğer ucundaki alüminyum portun ikinci en uzun tüpüne bağlayın.

Bu alüminyum tüp, kültür hacmini ayarlar ve fazla kültür, atık su kabına taşar. Şişenin kapaklarını alüminyum folyo ile sarın ve ardından düzeneği 121 santigrat derece ve 15 PSI'da 30 dakika otoklavlayın. Vakum filtresini 100 mililitrelik bir şişeye takın.

Emzik kapağını çıkarın ve ardından steril cımbızla vakum filtresinin emziğinden beyaz tapayı çıkarın. Geniş silikon tüpü meme ucuna, medya şişesinin diğer serbest tüpünü bir vakum pompasına bağlayın ve medya şişesini kültür kabına bağlayan üçüncü tüpün kenetlenerek kapatıldığından emin olun. Filtreyi ortamla doldurun, vakum pompasını açın ve ardından ortamın geri kalanını filtreleyin.

Vakuma bağlı orta silikon boruyu kelepçeleyin ve vakum pompasını kapatın. Vakum pompasına bağlı orta silikon borunun ara segmentinden luerleri çıkarın ve steril bir şırınga hava filtresinin mavi ucunu bu tüpe yerleştirin. Ardından geniş silikon tüpü kelepçeleyin ve erkek luer'i ondan ayırın.

Fişi, kültür kabının medya giriş borusunun dişi luerinden çıkarın. Ortamın kültür kabına pompalanmasını sağlamak için bu luerleri bağlayın. Ardından, filtreyi 100 mililitrelik şişeden çıkarın ve şişe kapağını takın.

Bir başlangıç kültürü hazırlamak için bu ortamı kullanın. Geri akışı önlemek için sürekli kültür düzeneğini, ortam şişesi kültür kabından daha yüksek ve atık su şişesi kültür kabından daha düşük olacak şekilde bir mikroskobun yanına yerleştirin. Ortam ve atık su şişeleri üzerindeki lastik tıpaları güvenli bir şekilde bantlayın.

Daha sonra, PTFE tüpünün uçlarını dar silikon tüpten çıkarın, onları bağlayın ve bu uçları hazırlanmış bir mikroakışkan cihazın giriş ve çıkışına takın. Ardından, şırınga hava filtresinin beyaz ucunu akvaryum pompasına bağlayarak ortamı kültür kabına itin. Ortam, atık su portu seviyesine ulaştığında, orta ortam giriş borusunu ve konektörlerini yavaş peristaltik pompanın etrafına ve dar numune çıkış borusunu ve konektörlerini hızlı peristaltik pompanın etrafına sarın.

Ortam şişesi ile kültür kabı arasındaki hava tüpünü açarak ortamı havalandırın. Ardından, sıcaklığının kontrol edilebilmesi için ısıtma yastığını ve termometreyi kültür kabına bantlayın. Medya borusunu kültür kabının etrafına sarın, böylece giren ortam kap ile aynı sıcaklıkta olacaktır.

Ardından kültür kabını LED matrisinin üzerindeki siyah köpük muhafazaya yerleştirin ve tüplerin sıkışmadığından emin olun. Yavaş medya pompasını her 30 saniyelik aralığın onda biri için çalıştırmak için biyoreaktör kontrol eklentisini kullanın. Akış hızı çok düşük, ancak buharlaşma hızından daha büyük olacaktır.

Gelen hava tüpünü medya şişesi ile kültür kabı arasına sıkıştırın. Kültür kabını bir başlangıç kültüründen bir mililitre ile aşılamak için bir pipet kullanın. Daha sonra bu tüpün damıtma ucunu kelepçeleyin ve hava tüpünü açın.

Kültürün bir gecede büyümesine izin verin. Muhafazayı, ışık girmeyecek şekilde örtün. Ertesi gün, peristaltik pompaları istenen ortama ve örnekleme akış hızlarına karşılık gelen daha uzun bir süre dönecek şekilde ayarlamak için biyoreaktör kontrolör eklentisini kullanın.

Kültür yoğunluğunun gece boyunca dengelenmesine izin verin. Ertesi gün, sahne konumu listesini ve mikro yöneticisi, mikroakışkan kanala pompalanan hücrelerin odak düzleminde olacağı bir dizi örtüşmeyen konumla doldurun. Ardından biyo reaktör denetleyici eklentisini açın.

Komut istemlerinden istediğiniz LED matris zaman rotasını, görüntüleme kanallarını ve diğer deneysel ayarları seçin ve ardından veri toplamaya başlayın. Bu aparat, indüklenebilir bir optogenetik transkripsiyon sistemi aracılığıyla mavi ışığa yanıt olarak sarı floresan proteini eksprese eden bir saccharomyces cerevisiae kültürünü uyarmak için kullanıldı. Mikroakışkan kanalın baz kontrast ve floresan görüntüleri elde edildi.

Faz kontrast görüntülerinden hücre ana hatları tanımlandı, floresan görüntülerle eşleştirildi ve floresan görüntüler gerçek zamanlı olarak kaydedildi. Buradaki ısı haritası, optogenetik sistemin aktivasyonu üzerine sarı floresan protein üretimine bağlı olarak bir kültürün floresan dağılımını göstermektedir. Yaklaşık 170.000 hücrenin floresansı, 70 saat boyunca 28 aşama pozisyonundan elde edilen 30.000'den fazla görüntüden analiz edildi.

Bu çalışma sırasında, kültür altı saatlik aralıklarla değişen yoğunluklarda mavi ışığa maruz bırakıldı, ardından altı saat tam karanlık izledi. Hücreler ilk ölçümden önce ışığa maruz bırakılmıştı, bu yüzden ilk karanlık dönemde floresan yoğunluğu azalmaktadır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, üç gün boyunca sekiz saat içinde yapılabilir.

Bu işlemi denerken steril tekniği kullanmak çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, protein konsantrasyonunu kontrol etmek için gerçek zamanlı geri bildirim kontrolü gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Bu teknik, optogenetik yapılara sahip organizmaların, plakalar veya toplu kültür kullanılarak mümkün olandan daha uzun süreler boyunca dinamik olarak incelenmesini sağlayacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, optogenetik mikropları uyarmak ve incelemek için sürekli bir kültür cihazının, bir ışığın ve bir mikroskobun nasıl entegre edileceğini iyi anlamış olmalısınız.