10 Aralık 2016
Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.
Bu deneyin genel amacı, sabit hücrelerde in situ yakınlık ligasyon testi kullanarak endoplazmik retikulum mitokondri etkileşimlerini görselleştirmek ve ölçmektir. Bu yöntem, basit bir immünofloresan tekniği kullanarak sabit hücrelerdeki ER mitokondri etkileşimlerini daha iyi analiz etmek için biyomedikal alandaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Umarım yeni tedavi stratejileri önerir. Bu tekniğin temel avantajı, sabit hücrelerde ER mitokondri etkileşimlerini görselleştirebilmemiz ve ölçebilmemiz ve bu tekniğin hastaların parafine gömülü doku biyopsilerine uygulanabilmesidir. Bu videoda gösterilen in situ yakınlık ligasyon testini kullanarak, dış mitokondriyal membranda VDAC1'e karşı yönlendirilmiş bir fare birincil antikoru ve endoplazmik retikulum zarında IP3R1'e karşı yönlendirilmiş bir tavşan birincil antikoru, mitokondriyal ilişkili membran arayüzünde yakınlıktaki epitoplarına birleşir. DNA uç kuyrukları bağlı olan ve fare ve tavşan IgG'ye karşı yönlendirilen yakınlık ligasyon probları eklenir ve konektör oligolarının ligasyonu için şablonlar oluşturabilir ve Texas Red Oligonükleotidler kullanılarak amplifiye edilebilir ve görselleştirilebilir. Her iki organel zarı arasındaki mesafe ile uyumlu olarak, mitokondriyal ilişkili zar arayüzünde. Yerinde yakınlık ligasyon testi için hücreleri sabitlemek ve bloke etmek için, kodlanmamış 35 mm cam alt çanak başına 150.000 hücrede insan H7 hücrelerini plakalayın. Ertesi gün, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri yıkamak için 1 mL PBS kullanın. Daha sonra tamponu aspire edin ve 1 mL yüzde on formaldehit ekleyin. Hücreleri sabitlemek için plakaları oda sıcaklığında 10 dakika çalkalayarak inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için 1 mL 1 M glisin ekleyin ve plakaları döndürerek karıştırın. Glisin çözeltisini çıkarın ve 1 mL 1XPBS ekleyin. Ardından, plakaları kısaca çalkalayın ve tamponu aspire edin. Daha sonra, hücrelere 1 mL 100 mM glisin ekleyin. Plakaları oda sıcaklığında 15 dakika çalkalayarak inkübe edin. Çözeltiyi aspire ettikten sonra, PBS'ye 1 mL %0.1 triton-X100 ekleyerek hücrelere geçirgen hale getirin. Ve inkübasyonu tekrarlayın. Deterjanı aspire edin ve hücreleri yıkamak için 1 mL PBS ekleyin. Tamponu çıkardıktan sonra, her bir hücre kabına 40 mikrolitre bloke edici çözelti ekleyin ve numuneleri 37 santigrat derecede nemli bir odada 30 dakika inkübe edin. Ardından, slaytların kurumasına izin vermeden her slayt için eşit hacimde artık tampon elde etmeye çalışarak engelleme solüsyonunu bulaşıkların üzerine hafifçe vurun. Yakınlık ligasyon testini gerçekleştirmek için, birincil antikorları seyreltmek için PBS kullanın. Vorteks ve çözeltiyi bulaşıklara ekleyin. Numuneleri 4 ° C'de inkübe edin
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Bu makale, sabit hücrelerdeki endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek duyarlılık ile nicellemek için bir prosedürü sunar. Yöntem, mitokondri-ilişkili membran arayüzündeki spesifik protein komplekslerini hedeflemek için optimize edilmiş bir in situ yakınlık ligasyon tahlili kullanır.
Quantifying endogenous ER-mitochondria interactions is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cellular signaling and metabolic regulation. The in situ proximity ligation assay enables sensitive, multiplexed detection of organelle contact sites without protein overexpression, supporting predictive confidence in disease-relevant systems. This capability strengthens portfolio decisions at the intersection of target validation and mechanistic pathway analysis.
This in situ proximity ligation assay bridges early discovery and preclinical research by enabling robust quantification of ER-mitochondria interactions in fixed cells and tissues.