Name: Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile In Situ Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Öğrenin, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri etkileşimlerini in situ yakınlık ligasyon testi ile görselleştirme ve nicelleştirme yöntemini. Bu teknik, hücresel metabolizma ve sinyal iletimi araştırmalarında yüksek duyarlılık sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz optimize etmek ve protokol doğrulamak katkıda laboratuarımızda tüm insanlara teşekkür ederim. Bu çalışma INSERM ve ulusal araştırma kurumu (ANR-09-JCJC-0116 VE ANR-11-BSV1-033-02) tarafından desteklenmiştir. ET yüksek öğrenim ve araştırma Fransız bakanlığından bir araştırma bursu ile onu doktora sırasında desteklenmiştir.

Çözümler 1. hazırlanması <ol><li> PBS 14.5 ml% 37 formaldehit 5.5 mi seyreltilmesiyle PBS (tuz) içinde% 10 formaldehit hazırlayın. PBS, 50 ml glisin 3.8 g çözülmesiyle, 1 M glisin, pH 8.0, hazırlanması; 1x PBS içinde 100 mM glisin elde etmek için bu seyreltilir. </li><li> 1x PBS içinde% 0.1 Triton-X100 hazırlayın. 3.0 M sodyum klorid ve 25 ° C de pH 7.0 ile, iyonu giderilmiş su içinde hazırlanan 0.30 M trisodyum sitrat ile 20x Tuzlu sodyum sitrat (SSC) hazırlayın. 1x bu tampon sulandırmak ve deiyonize su kullanılarak 0.01x. </li></ol> Hücreler 2. Sabitleme NOT: Bu çalışmada HuH7 hepatokarsinoma hücre çizgisi kullanılır, ancak bu yöntem diğer yapışık hücre kültürleri için de geçerlidir. <ol><li> kaplanmamış 35 mm&#39;lik cam alt tabak başına 150.000 hücre (% 10 fetal dana serumu ve% 0.01 penisilin-streptomisin stok ile desteklenmiş DMEM, 1 g / L glikoz kültürlenmiştir) Levha Huh7 hücreleri,. Birincil hücrenin üzerinde çalışırkenKültürler, kolajen kaplı yemekler kullanımı. </li><li> Sonraki gün, kültür ortamı çıkarın. PBS aspire 1 ml hücreleri yıkayın. Formaldehit% 10 1 ml ekleyerek hücreleri saptamak ve ajitasyon altında oda sıcaklığında (RT) 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 1 M glisin, 1 ml reaksiyonu durdurun ve rotasyon karıştırılır. Dur reaksiyon çözüm çıkarın ve 1x PBS 1 ml ekleyerek hücreleri yıkayın; rotasyon ve aspirat ile çalkalayın. hücrelere 100 mM glisin 1 ml ilave edilir ve 15 çalkalanarak oda sıcaklığında dakika ve daha sonra aspire için inkübe. NOT: protokol burada durdurulabilir ve aşağıdaki adımlar başka bir güne ertelenebilir. Bu durumda, 100 mM glisin, 1 ml ilave edilir ve gerektiğinde, 4 ° C&#39;de tutun. </li></ol> 3. Hücrelerin Permeabilization <ol><li> 15 çalkalanarak oda sıcaklığında dakika ve daha sonra aspire inkübe edin, 1 x PBS içinde% 0.1 Triton-X100 içinde 1 ml ilave edilir. Primer hücre kültür üzerinde çalışırken 20 dakika - Bu inkübasyon süresi 15 kadar arttırılabilires (örneğin, birincil fare hepatositler). 1x PBS 1 ml ekleyerek hücreleri yıkayın; aspire. </li></ol> 4. Engelleme <ol><li> (Kit ile birlikte verilen) her bir örnek için bloke etme çözeltisi 40 ul ekle; Bu hacimli bir numunesi kapsayacak şekilde arttırılabilir. bir nemlilik bölmesi içerisinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca yemekler inkübe edin. </li><li> yemekler kapalı engelleme çözümü dokunun. Bu tekrarlanabilirlik etkileyecek gibi, her slayt için eşit kalan miktarlar elde etmek için çalışın. Numuneler kurumasına izin vermeyin! </li></ol> 5. Birincil antikorlar, <ol><li> 1x PBS birincil antikorlar seyreltin ve yemekler (VDAC1 fare antikoru: 1/100, IP3R1 tavşan antikoru: 1/500) için çözüm ekleyin. Seçenek olarak ise, GRP75 ve CypD antikorlar (1/500 kullanılan her iki fare antikorları) kullanılarak VDAC1 arasında kullanılabilir. </li><li> 4 ° C&#39;de bir nem odasında gece boyunca inkübe edin. % 0.01 Tween (TBS-T) ile slaytlar Tris Tamponlu Salin kullanarak iki kez yıkayın. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. Proximity ligasyon Testi Probları <ol><li> Yakınlık ligasyon tahlil sondaları kit tarafından sağlanmaktadır. Primer antikor türlere göre problar seçin. </li><li> Antikor seyreltici 5: İki yakınlık ligasyon tahlil Sensörler 1 hazırlayın. Karışım, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bekletin. seyreltilmiş yakınlık ligasyonu tahlil prob çözüm ekleyin. 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca önceden ısıtılmış bir nem odasında yemekler inkübe edin. TBS-T ile yemeklere iki kez yıkayın. </li></ol> 7. ligasyonu <ol><li> In situ saptama reaktif maddesi Texas kırmızısı kiti kullanım. </li><li> Yüksek saflıkta su içinde 5 ve iyice karıştırın (kit ile birlikte verilen) 5x bağlama suyu 1 seyreltin. 1:40 ve vorteks (kit tarafından sağlanan) 1x ligasyon çözeltisi içinde ligaz sulandırmak. hemen örneklerin yanı sıra öncesine kadar ligaz eklemek için bekleyin. </li><li> önceden ısıtılmış bir nem Cham slaytlar her bir örnek için, bu solüsyonu (35 mm cam alt yemekler için 40 ul) ilave edilir ve kuluçkayaBER, 37 ° C&#39;de 30 dakika karıştırıldı. TBS-T ile slaytlar iki kez yıkayın. </li></ol> 8. Büyütme NOT: Dikkatli, ışığa duyarlı reaktifler olunuz. <ol><li> Yüksek saflıkta su içinde 5: (kit ile birlikte verilen) 5x büyütme stok 1 seyreltin. donma blok kullanarak dondurucu polimeraz çıkarın (-20 ° C). (Kit tarafından sağlanan) polimeraz 1x büyütme çözüm ve vorteks içinde 1:80 seyreltilir. karışımı kullanılarak hemen önce polimeraz ekleyin. </li><li> Her bir örnek için, bu solüsyonu (35 mm cam alt yemekler için 40 ul) eklenir. 37 ° C&#39;de 100 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir nem odasında slaytlar inkübe edin. slaytlar kapalı Amplifikasyon-Polimeraz çözümü dokunun. </li></ol> 9. Final Yıkama <ol><li> 2 dakika için 1 x SSC yıkama tamponunda slaytlar yıkayın. 2 dakika boyunca 0.01x SSC yıkama tamponunda slaytlar yıkayın. Yemekler karanlıkta oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li></ol> Görüntüleme için 10. Hazırlık <ol&gt; <li> hava kabarcıkları kapak kayma altında yakalanmak sağlanması, (sulu ve katılaşmaya değildir) DAPI içeren montaj orta minimal hacmi kullanılarak slaytlar monte edin. Tırnak cilası kenarları mühür için kullanılabilir. (: 594 nm, emisyon: 624 nm, Büyütme: 63X uyarım) bir floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak analiz etmeden önce yaklaşık olarak 15 dakika boyunca bekleyin. </li><li> görüntüleme sonra karanlıkta -20 ° C&#39;de slaytlar saklayın. </li></ol>

<ol><li>Bravo-Sagua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+communication%3A+signaling+crossroads+between+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+membranes%3A+composition%2C+molecular+mechanisms%2C+and+physiopathological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+redox+signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications.</a> Antioxidants & redox signaling. 22, 995-1019 (2015).</li>
<li>Phillips, M. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+ER+membrane+contact+sites+with+other+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).</li>
<li>Cosson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RTM+resistance+to+potyviruses+in+Arabidopsis+thaliana%3A+natural+variation+of+the+RTM+genes+and+evidence+for+the+implication+of+additional+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes.</a> PLoS One. 7, 39169(2012).</li>
<li>Mannella, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+dynamics+of+the+mitochondrial+inner+membrane+cristae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).</li>
<li>Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+tomography+of+rat-liver+mitochondria+and+their+interaction+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum.</a> Biofactors. 8, 225-228 (1998).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280, 1763-1766 (1998).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li>
<li>Szabadkai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-mediated+coupling+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels.</a> J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).</li>
<li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+%28MAM%29+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).</li>
<li>Paillard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depressing+Mitochondria-Reticulum+Interactions+Protects+Cardiomyocytes+From+Lethal+Hypoxia-Reoxygenation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury.</a> Circulation. 128, 1555-1565 (2013).</li>
<li>Rieusset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+calcium+transfer+from+ER+to+mitochondria+links+alterations+of+mitochondria-associated+ER+membrane+integrity+to+hepatic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance.</a> Diabetologia. 59, 614-623 (2016).</li>
<li>Allalou, A., Wahlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BlobFinder%2C+a+tool+for+fluorescence+microscopy+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Computer+methods+and+programs+in+biomedicine%22%5BJournal%5D)">BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry.</a> Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).</li>
<li>Theurey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membranes+allow+adaptation+of+mitochondrial+metabolism+to+glucose+availability+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver.</a> Journal of molecular cell biology. , (2016).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li>
<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
<li>De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+anion-selective+channel+%28VDAC%29+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane.</a> FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).</li>
<li>Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortalin%3A+present+and+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+gerontology%22%5BJournal%5D)">Mortalin: present and prospective.</a> Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Toplu olarak, çalışmalarımız, in situ yakınlık ligasyon testinin, organele özgü floroforlar veya floresan proteinler kullanmaya gerek kalmadan, sabit hücrelerde endojen ER-mitokondri etkileşimlerini takip etmek ve ölçmek için gerçekten uygun bir strateji olduğunu göstermektedir. VDAC1/IP3R1 antikorlarının spesifik kullanımı, HuH7 hücrelerinde ER-mitokondri etkileşimlerini incelemek için uyarlanmıştır. Bununla birlikte, hücre tipine bağlı olarak VDAC ve IP3R'nin alternatif izoformları kullanılabilir. Bu durumda, ...

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (ER) hücrede bağımsız organelleri olmayan, ancak mitokondri ilişkili endoplazmik retikulum zarlarının (MAM) olarak tanımlanan temas bölgelerinde yapısal ve fonksiyonel etkileşim. Aslında, MAM her iki taraftan da proteinler arasındaki etkileşimi sağlayan ER membranlar ve mitokondri yakın kapatılan bölgelere karşılık gelir. Bununla birlikte, bu organellerin membranlar bu bölgeler içinde kaynaştırmak yok, bu yüzden onların ayrı varlıklar korumak. MAM Enerji metabolizması ve hücre yaşamını 1-3 etkileyen, mitokondri ER bir kalsiyum açısından önemli bir rol (Ca 2+) ve fosfolipid transferi oynarlar. ER ve mitokondri arasındaki ilişki ilk elektron mikroskobu ile 1970&#39;lerde görüntülendi. O zamandan beri, transmisyon elektron mikroskobu 4,5, elektron tomografi 6,7 veya ER ve mitokondri özgü fluorofor immün lokalizasyonus / floresan proteinleri 8 klasik ER-mitokondri etkileşimleri çalışmak için kullanılmıştır. MAM analizi için yararlı bir araç içi fraksiyonasyon kullanımına dayanır. Bir Percoll degrade 9 bağlanmış diferansiyel Ultrasantrifügasyon tarafından MAM fraksiyonların izolasyonu sağlar. Bununla birlikte, nihai ürün zenginleştirilmiş MAM fraksiyonlar yerine, saf kesimlerin içerir. Toplamda, bu stratejiler özellikle hassas ve / veya kantitatif değildir ve onlar büyük tarama kolayca uygun değildir. Alternatif olarak ilaç indüklenebilir floresan arası organel bağlayıcılar kullanılarak genetik yaklaşımlar ortaya çıkmıştır, ancak protein 10 &#39;nın endojen ekspresyonunun seviyelerinde organel etkileşimlerin analizine izin vermez. MAM 11&#39;de IP3R / GRP75 / SSVD kompleksinin Szabadkai keşfinden dayanarak, ER-mitokondri etkileşimleri analiz etmek için kantitatif bir yöntem geliştirdi. In situ yakınlığı ligati kullanılantahlil üzerinde algılamak ve VDAC1 ve IP3R1 arasındaki etkileşimleri ölçmek için, sabit hücrelerde 12 MAM arayüzünde Ca 2 + -channeling kompleksi yer alan iki organel-yüzey proteinleri. Kısaca, bizler, ER membran dış mitokondriyal zarın (fare anti-VDAC1 birincil antikor) ve IP3R1 (tavşan anti-IP3R1 birincil antikor) (Şekil 1, bir panel) de VDAC1 incelenir. Daha sonra, deney göre, anti-fare ve tamamlayıcı oligonükleotid uzantıları konjuge edilmiş anti-tavşan IgG (fare ve tavşan proksimite ligasyonu deney Probes), her iki ilave edildi. İki hedef proteinler 40 nm&#39;nin altında bir mesafede ise, oligonükleotidler dairesel DNA şablonu (Şekil 1 Panel B) oluşmasına izin vermek için daha sonra ilave bağlayıcı oligo ile hibridize olabilir. Bu dairesel bir DNA molekülü kovalent yakınlığı probları birine bağlanmış bir tek-şeritli DNA ürününü oluşturmak, lige edilmiş ve amplifiye edilir (Şekil 1, Panel C) </stro&gt; Ng. MAM arayüzü ER ve mitokondri arasındaki mesafe mil 6, proksimite ligasyonu ve amplifikasyon bağlı Texas kırmızısı etiketli oligonükleotid sondalar (Şekil 1, Panel D hibridizasyonu sonraki tespiti yol yapılabilir 25-10 nm arasında değerler ). Her floresan nokta böylece tek tek hücrelerin in situ ER-mitokondri etkileşimleri sayılmasına olanak tanıyan, VDAC1 / IP3R1 arasındaki etkileşimleri temsil eder. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54899/54899fig1.jpg" /> Şekil 1: Yerinde Proximity ligasyon Tahlili tarafından Endoplazmik Retikulum-mitokondri Etkileşimleri Algılama şematik İllüstrasyon. a) VDAC1 ve MAM arayüzü yakın kendi epitopuna bağlanabilir IP3R1 karşı bir tavşan primer antikora karşı yönlendirilmiş bir fare primer antikor, B) proksimite ligasyonu probları bir çift ilavesifare ve tavşan IgG karşı. Bu sondalar bağlayıcı oligo ligasyonu için şablonlar oluşturabilirler DNA ipliklerini eklenmiş. c) bağlanmasından sonra oluşturulan dairesel DNA zinciri Texas kırmızısı etiketli oligonükleotidler kullanılarak bir flüoresan nokta olarak mikroskopi ile görünür) yükseltilir ve D edilebilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54899/54899fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> In situ proksimite ligasyonu deneylerinde benzer antikorların GRP75 / IP3R1 çifti, hem de siklofilin D (CypD) ile yapılabilir / IP3R1 antikorlar CypD MAM arayüzü IP3R / GRP75 / SSVD kompleksi ile etkileştiği gösterilmiştir olduğu dikkate 12-14.

<table><tbody><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma</td><td>F-8775</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Cam alt kültür kapları</td><td>MatTeK corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Engelleme çözümü</td><td>Sigma</td><td>DUO-92004 veya DUO-92002</td><td>, Duolink PLA problarında sağlanır, Sigma</td></tr><tr><td>VDAC1 antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>IP3R1-H80 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc28614</td><td></td></tr><tr><td>CypD antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab110324</td><td></td></tr><tr><td>Grp75 antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc13967</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>euromedex</td><td>ET220</td> 1x Tween 100x euromedex 2001-B <td>elde etmek için seyreltin</td></tr> %<tr><td></td><td></td><td></td><td>0,01</td></tr> <tr>elde etmek için TBS'de seyreltin<td>PLA Probları Fare EKSİ</td><td>Sigma</td><td>DUO-92004</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>PLA Probları Tavşan ARTI</td><td>Sigma</td><td>DUO-92002</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>Duolink algılama reaktifleri kırmızı</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>Ligasyon çözümü</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Duolink algılama reaktiflerinin bir parçası kırmızı, Sigma</td></tr><tr><td>Ligase</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Duolink algılama reaktiflerinin bir parçası kırmızı, Sigma</td></tr><tr><td>Amplifikasyon çözümü</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Duolink algılama reaktiflerinin bir parçası kırmızı, Sigma</td></tr><tr><td>Polimeraz</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Duolink algılama reaktiflerinin bir parçası kırmızı, Sigma</td></tr><tr><td>Duolink Montaj Ortamı</td><td>Sigma</td><td>DUO80102</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td colspan="4">Softwares</td></tr><tr><td>Blob bulucu yazılımı</td><td></td><td></td><td>BlobFinder, floresan mikroskobu görüntülerinden hücreler üzerinde hesaplamalar yapabilen, serbestçe dağıtılan bir yazılımdır. Bu yazılım, yazılımı geliştiren Uppsala Üniversitesi'ndeki Görüntü Analiz Merkezi'nden ücretsiz olarak indirilebilir ve çalışma AB FP6 Projesi ENLIGHT ve Olink Bioscience tarafından desteklenmiştir. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm</td></tr><tr><td>ImageJ yazılımı</td><td></td><td></td><td>Şuradan ücretsiz olarak indirilebilir: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr></tbody></table>

endoplazmik retikulum ve mitokondri etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; in situ</em&gt; proximity ligasyon testi sabit hücrelerde

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Mitokondri ile ilişkili membranlar (MAM) olarak bilinen alanlardaki endoplazmik retiküler (ER) ve mitokondriyal membranlar arasındaki yapısal etkileşimler, hücresel sinyalleşme ve hücre kaderi için çok önemli merkezlerdir. Özellikle, bu organeller arası temas bölgeleri, kalsiyumun voltaja bağlı anyon kanalı (VDAC)/glikoz regüle protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP3R) kalsiyum kanal kompleksi yoluyla ER'den mitokondriye transferine izin verir. Bu hücre altı bölme hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda yoğun bir şekilde araştırılırken, hücrelerdeki endojen ER-mitokondri teması miktarını ölçmek için basit ve hassas bir yöntem yoktur. Benzer şekilde, MAM'lar oldukça dinamik yapılardır ve protein aşırı ekspresyonu olmadan ER-mitokondri etkileşimlerinin modifikasyonlarını takip etmek için uygun bir yaklaşım yoktur. Burada, dış mitokondriyal membranın (VDAC1) ve ER membranının (IP3R1) proteinleri arasındaki yakınlığı kullanarak sabit hücrelerdeki endojen ER-mitokondri etkileşimlerini görselleştirmek ve ölçmek için yerinde yakınlık ligasyon testinin kullanımına dayanan optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Benzer in situ yakınlık ligasyon deneyleri, GRP75 / IP3R1 ve siklofilin D / IP3R1 antikor çiftleri ile de gerçekleştirilebilir. Bu test, son derece spesifik, hassas ve çoklu koşul testlerine uygun olduğu için diğer görüntüleme prosedürlerine göre çeşitli avantajlar sağlar. Bu nedenle, bu in situ yakınlık ligasyon testinin kullanılması, ER-mitokondri etkileşimlerinin fizyolojik düzenlemelerinin yanı sıra patolojik bağlamlardaki rollerini daha iyi anlamak için yardımcı olmalıdır.

Bu protokolü kullanarak bizim deneyime dayalı, biz güvenle sabit hücrelerde ER-mitokondri etkileşimleri görselleştirme ve miktar tayini için bu yöntemi tavsiye ederim. Antikorların çeşitli çiftleri kullanılarak HuH7 hepatokarsinoma hücre çizgisinde in situ proksimite ligasyonu deneyi-görüntülenmiştir ER-mitokondri etkileşimlerine temsili görüntüleri gösterilmektedir. Flüoresans mikroskopisi ile, Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, her bir kırmızı nokta, i...

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Bu deneyin genel amacı, fikse edilmiş hücrelerde in situ yakınlık ligasyon analizi (PLA) kullanarak endoplazmik retikulum-mitokondri etkileşimlerini görselleştirmek ve nicelleştirmektir. Bu yöntem, basit bir immünofloresan tekniğiyle fikse edilmiş hücrelerdeki ER-mitokondri etkileşimlerini daha iyi analiz ederek biyomedikal alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve böylece yeni tedavi stratejileri önerebilir. Bu tekniğin temel avantajı, ER-mitokondri etkileşimlerini fikse edilmiş hücrelerde görselleştirip nicelleştirebilmemizdir ve bu teknik hastaların parafin gömülü doku biyopsilerine de uygulanabilir. Bu videoda gösterilen in situ yakınlık ligasyon analizi kullanılarak, dış mitokondriyal membrana karşı yöneltilmiş bir fare primer antikoru ile endoplazmik retikulum membranına karşı yöneltilmiş bir tavşan primer antikoru, mitokondri ilişkili membran arayüzündeki yakın epitoplarına bağlanır. DNA uç kuyrukları eklenmiş ve fare ile tavşan IgG'sine karşı yöneltilmiş yakınlık ligasyon probları eklenir; bunlar konnektör oligolarının ligasyonu için şablonlar oluşturabilir ve Texas Red Oligonükleotidleri kullanılarak amplifiye edilip görselleştirilebilir. Bu durum, yalnı

study-endoplasmic-reticulum-mitochondria-interactions-situ-proximity

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA'ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici...

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Bağdaşık ışık elektron mikroskobu (CLEM) yöntemi daha önce ışık mikroskobu (LM) tarafından seçilen hücrelerdeki görüntü virüs kaynaklı hücre içi yapılar elektron mikroskobu (EM) yoluyla uygulanır. LM ve EM virüs ana bilgisayar etkileşimlerin tümleşik bir görünüm elde etmek için hibrid görüntüleme yaklaştıkça birleştirilir.

Cryo-immobilize hücreler yapılarda bağdaşık ışık elektron izleme ve Viral Protein Imaging mikroskobu (CLEM) ilişkili

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Bu protokol, apex2 etiketli membran proteininin en iyi korunmuş hücre ultrayapısı içinde iletim elektron mikroskobu ile lokalize edilebildiği kriyoAPEX yöntemini açıklar.

Ultrayapısal Olarak Korunmuş Hücrelerde Membran Protein Lokalizasyonunun Elektron Mikroskobu Analizi için CryoAPEX Yöntemi

Karaciğerden hepatositlerdeki organeller veya diğer dokulardaki hücreler arasındaki membran temas bölgelerinin üç boyutlu ayrıntılarını elde etmek için basit ve kapsamlı bir protokoldür.

Hepatositlerde Organeller Arası Temas Bölgelerinin Seri Kesitli Elektron Mikroskobu Kullanılarak Üç Boyutlu Karakterizasyonu

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Burada, hücresel üst yapı ile ilgili olarak nadir proteinlerin lokalizasyonunu araştırmak için bir araç olarak endojen, floresan etiketlemeye dayalı optimize edilmiş kesit korelasyonlu ışık-elektron mikroskobu için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın gücü, Bafilomisin tedavisi olmadan aç bırakılmış hücrelerde endojen LC3'ün ultrastrüktürel lokalizasyonu ile gösterilmiştir.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

Canlı hücrelerde endoplazmik retikulum-mitokondri temaslarını izlemek için bölünmüş lusiferaz yeniden birleştirme testi oluşturduk. Bu tahlili kullanarak, kimyasal işlem koşulu altında HEK293T hücrelerdeki bu organeller arası eşleşmelerin seviyesini kantitatif olarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Hücrelerde Endoplazmik Retikulum-Mitokondri Temaslarını Ölçmek için Split-Luciferase Yeniden Birleştirme Testi

Bu protokol, sırasıyla mEosEM ve APEX2 ile etiketlenmiş mitokondri ve lizozomların etkileşimini görselleştirmek için bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu kullanmak için bir mekanizmayı açıklar.

Mitokondri ve Lizozomlar Arasındaki Etkileşimlerin Görselleştirilmesi için Çift Renkli İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobu

Öğrenin, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri etkileşimlerini in situ yakınlık ligasyon testi ile görselleştirme ve nicelleştirme yöntemini. Bu teknik, hücresel metabolizma ve sinyal iletimi araştırmalarında yüksek duyarlılık sağlar.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile

Daha fazla video keşfet