Name: Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Öğrenin, mikro-elektrot dizileri üzerinde insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden hızlı ve kontrollü nöron farklılaşması protokolünü. Bu yöntem, nörolojik bozuklukların ağ aktivite kusurlarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, tüm hücre yama-kelepçe deneylerini gerçekleştirdiği için Jessica Classen'e teşekkür ediyor. Deneylerimizde kullanılan hiPSC'ler, Nijmegen Radboud Üniversitesi'nden Huiqing Zhou ve Willem van den Akker tarafından nazikçe sağlandı. Bu protokolde kullanılan transfer vektörleri, Bonn Üniversitesi Tıp Merkezi'nden Oliver Brüstle, Philipp Koch ve Julia Ladewig tarafından sağlanmıştır.

<ol><li>Ahfeldt, T., Litterman, N. K., Rubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+human+disease+using+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Studying human disease using human neurons.</a> Brain Res. , (2016).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li>
<li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (34), 12543-12548 (2004).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomic+and+functional+analyses+reveal+neuronal+subtype+differentiation+bias+in+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Integrative genomic and functional analyses reveal neuronal subtype differentiation bias in human embryonic stem cell lines.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (34), 13821-13826 (2007).</li>
<li>Chambers, S. M., Fasano, C. A., Papapetrou, E. P., Tomishima, M., Sadelain, M., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).</li>
<li>Johnson, M. A., Weick, J. P., Pearce, R. A., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+neural+development+from+human+embryonic+stem+cells%3A+accelerated+synaptic+activity+via+astrocyte+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional neural development from human embryonic stem cells: accelerated synaptic activity via astrocyte coculture.</a> J Neurosci. 27 (12), 3069-3077 (2007).</li>
<li>Hu, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+follows+developmental+principles+but+with+variable+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (9), 4335-4340 (2010).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (6), 695-706 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Odawara, A., Saitoh, Y., Alhebshi, A. H., Gotoh, M., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+electrophysiological+activity+and+pharmacological+response+of+a+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neuron+and+astrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Long-term electrophysiological activity and pharmacological response of a human induced pluripotent stem cell-derived neuron and astrocyte co-culture.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1176-1181 (2014).</li>
<li>Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+maturation+and+drug+responses+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cortical+neuronal+networks+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture.</a> Sci Rep. 6, 26181(2016).</li>
<li>Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Responses+and+Spontaneous+Activity+of+Human+iPS-Derived+Neuronal+Networks+Characterized+for+3-month+Culture+with+4096-Electrode+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays.</a> Front Neurosci. 10, (2016).</li>
<li>Heikkila, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+neuronal+cells+form+spontaneously+active+neuronal+networks+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived neuronal cells form spontaneously active neuronal networks in vitro.</a> Exp Neurol. 218 (1), 109-116 (2009).</li>
<li>Massobrio, P., Massobrio, G., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-program+approach+for+simulating+recorded+extracellular+signals+generated+by+neurons+coupled+to+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurocomputing%22%5BJournal%5D)">Multi-program approach for simulating recorded extracellular signals generated by neurons coupled to microelectrode arrays.</a> Neurocomputing. 70, 2467-2476 (2007).</li>
<li>Wang, L., Riss, M., Buitrago, J. O., Claverol-Tinturé, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+microchannel-enabled+neuron-electrode+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces.</a> J Neural Eng. 9 (2), (2012).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J. Vis. Exp. (71), e50079(2013).</li>
<li>Pacifici, M., Peruzzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+embryonic+neural+cells%3A+a+quick+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol.</a> J Vis Exp. (63), e3965(2012).</li>
<li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARHGAP12+functions+as+a+developmental+brake+on+excitatory+synapse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ARHGAP12 functions as a developmental brake on excitatory synapse function.</a> Cell Rep. 14 (6), 1355-1368 (2016).</li>
<li>Bologna, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+neuronal+activity+by+SPYCODE+multi-channel+data+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Netw%22%5BJournal%5D)">Investigating neuronal activity by SPYCODE multi-channel data analyzer.</a> Neural Netw. 23 (6), 685-697 (2010).</li>
<li>Ba, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIO+loss+of+function+is+associated+with+mild+intellectual+disability+and+affects+dendritic+branching+and+synapse+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">TRIO loss of function is associated with mild intellectual disability and affects dendritic branching and synapse function.</a> Hum Mol Genet. 25 (5), 892-902 (2016).</li>
<li>Benevento, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+by+the+Kleefstra+syndrome+protein+EHMT1+mediates+homeostatic+synaptic+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Histone methylation by the Kleefstra syndrome protein EHMT1 mediates homeostatic synaptic scaling.</a> Neuron. 91 (2), 341-355 (2016).</li>
<li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).</li>
<li>Frega, M., Tedesco, M., Massobrio, P., Pesce, M., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+dynamics+of+3D+engineered+neuronal+cultures%3A+a+new+experimental+model+for+in-vitro+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Network dynamics of 3D engineered neuronal cultures: a new experimental model for in-vitro electrophysiology.</a> Sci Rep. 4, 5489(2014).</li>
<li>Tedesco, M., Frega, M., Martinoia, S., Pesce, M., Massobrio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacing+3D+engineered+neuronal+cultures+to+micro-electrode+arrays%3A+an+innovative+in+vitro+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Interfacing 3D engineered neuronal cultures to micro-electrode arrays: an innovative in vitro experimental model.</a> J Vis Exp. (104), e53080(2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada Zhang ve arkadaşları tarafından yayınlanan verimli bir hiPSC-farklılaşma protokolü hayata geçirdik. ÇÇA üzerinde hiPSC türetilmiş nöral ağların ağ etkinliğini ölçmek için (2013) 12. Biz nöronal farklılaşma indükleyici önce rtTA / Ngn2 pozitif hiPSC hattı oluşturarak orijinal protokol uyarladı. Bu ek adım bize MEA nöronal hücre yoğunluğunu kontrol etmenizi sağlar. nöronal yoğunluğu üzerinde kontrol ÇÇA protokolü uyarlanması için ve tutarlılık sağlanması için önemli bir ön koşul oldu. ÇÇA kullanarak nöron ağları aktivitesini ölçmek için, nöronlar doğrudan MEA elektrotlar 17,18 üstünde yoğun ağları oluşturmak gerekir. Bu mutlaka nöronların kaplama yoğunluğu üzerinde sıkı kontrol gerektirir. RtTA / Ngn2 pozitif hiPSC hattı bu taktik önce farklılaşmasına hiPSCs akut lentiviral transdüksiyon dayanmaz çünkü nöron yoğunluğu kontrolü sağlar;rtTA / Ngn2 pozitif hiPSC hattı, bu nedenle neredeyse örneğin, lentiviral toksisite ve değişken enfeksiyon verimliliği için, nedeniyle son verimle herhangi bir değişiklik ortadan kaldırır. Deneysel işlemin bir diğer kritik adım ayırt hiPSCs ile kültive edilir sıçan astrositlerin sayısıdır. Astrositler aktif nöronal işleyişi için önemli süreçlerdir hepsi sinaps oluşumunu, bakım ve ortadan kaldırılması, kontrol ederek nöral devreleri geliştirme arıtma katkıda bulunur. Bu çalışmada sunulan protokol yüksek astrosit bağlıdır: tamamen olgun ve işlevsel sinaps oluşturmak için, nöronlar astrositler gelen desteği gerektirir. Bu astrositler sayısı nöronların olgunlaşmasını ve spontan aktivite sergileyen nöronal ağların formasyonunu destekleyecek hiPSC türetilmiş nöronların sayısı kabaca eşit olmalıdır yaşadı. Bizim astrosit protokol verimleri primer hücre cul yanasınırlı bir ömrü olan lar, sıçan astrositler izolasyonu düzenli yapılmalıdır. Zhang ve arkadaşları tarafından yayınlanan bir protokolün Bizim adaptasyonu. (2013) 12 MEA teknolojisi ile kullanım için muhtemelen önemli ölçüde hiPSC türetilmiş ağların ağ etkinliğini incelemek için yeteneğimizi artıracak. Daha önce, ÇÇA ile hiPSC türetilmiş nöron ağları çalışmak için kullanılan protokoller zaman alıcı farklılaşma prosedürleri 13-16 dayanmıştır. Zhang ve ark protokol. (2013) hızlı bir alternatif sağlar, ve modifikasyonu şimdi daha uygun özellikle yüksek verim ya da farmakolojik çalışmalarda, MEA teknolojisi ile kombinasyon halinde hiPSC türetilmiş nöronlar kullanımı kolaylaştırır değişkenlik kaynağı kaldırılır. Buna ek olarak, çünkü Zhang ve arkadaşları tarafından yayınlanan metot. (2013) 12 üst katman kortikal nöronların homojen bir nüfus, bizim uyarlanmış protokolü ağ a içine mümkün odaklı çalışmalar yapan verimleriBu özel nöron alt kümesinin ctivity. Bununla birlikte, bu yaklaşım aynı zamanda çeşitli sınırlamalara sahiptir. Kültürler nöron farklı sınıfları (örneğin, baskılayıcı ve uyarıcı nöronlar) heterojen bir ağ oluşturan in vivo şebekesinde benzer daha az olduğu için İlk olarak, kültürlerin homojenliği da bir dezavantaj olarak kabul edilebilir. ayrıca MEA teknolojisi ile hiPSC türevli nöronların kullanımını artırmak için, diğer nöronal hücre popülasyonları için hızlı (transgen tabanlı) farklılaşma protokolleri geliştirmek için önemli olacaktır. Protokoller kullanılabilir hale varsa, in vitro ağları daha yakından in vivo ağları taklit ediyorum. İkinci olarak, bu fare astrositler büyüme destek hiPSC türetilen nöron eklenmelidir ve bu nedenle elde edilen nöronal ağ, bir insan nöronal ağ dar anlamda değildir. Gelecekteki sol astrositlerin olabilir içine hiPSCs ayırt etmek için güvenilir protokollerBu sorunu 26 ettik. Burada tarif edildiği gibi Üçüncü olarak, iki boyutlu bir nöronal ağlar, karmaşık üç boyutlu, in vivo nöronal ağlar çalışmak için sınırlı bir model vardır. Neyse ki, MEA teknolojisi ile birlikte de farelerin primer nöron üç boyutlu kültürleri açıklayan protokolleri 27,28 zaten mevcuttur. Prospektif, üç boyutlu kültür teknikleri ve MEA teknolojisi ile hiPSC türevli nöronlar ve astrositler elde etmek için hızlı farklılaşma protokolleri kombinasyonu biyolojik mekanizmaları altta yatan nörolojik bozukluklar içine yeni fikir vermelidir.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (hiPSCs) farklılaşma protokolleri geliştirilmesi nörolojik bozukluklar çalışmak için yeni ve güçlü bir araç sağladı in vitro insan nöronları üretmek için. Yakın zamana kadar, bu hastalıkların araştırılması ciddi insan nöronları kullanarak model sistemler eksikliği güçleştirmiştir. Kemirgenler nörolojik bozukluklar incelemek için kullanılabilir, ancak bu tür çalışmaların sonuçları, insanlarda 1 kolayca çevrilemez. Bu sınırlamaları dikkate alındığında, hiPSC türetilmiş nöronlar moleküler mekanizmaları altta yatan nörolojik bozukluklar aydınlatmak için kullanılan ve in vitro ilaç taraması için olabilir umut vaat eden bir alternatif bir model vardır. Son on yılda, çeşitli protokoller nöronlara hiPSCs 2-8 geliştirilmiştir dönüştürmek. Bununla birlikte, bu protokoller de birçok yönden sınırlıdır. İlk olarak, protokoller çoğu zaman alıcıdır: Yeterli olgunlaşma ile üreten nöronlar (yani synapse formasyonu) ve fonksiyonel aktivite 9 zorlu büyük ölçekli çalışmalar vermektedir kültür işlemlerinin, aylar gerektirir. Buna ek olarak, hiPSC-to-nöron dönüşüm verimliliği düşüktür. Protokoller genellikle nöronlar heterojen popülasyonu elde ve böylece nöronal hücrelerin spesifik alt setinin çalışmaları izin vermez. Ayrıca, protokoller farklı iPSC hatları 10,11 için farklı sonuçlar veren, tekrarlanabilir değildir. Son olarak, olgunlaşma aşaması ve elde edilen nöronların fonksiyonel özellikleri 10 de değişkendir. Bu sorunların, Zhang ve arkadaşları gidermek için. (2013) 12, hızlı ve yeniden üretilebilir neurogenin-2 transkripsiyon faktörü aşırı ifade ile hiPSCs insan nöronları üreten bir protokol geliştirilmiştir. nöronal özellikleri s bağımsız (- (3 hafta Neurogenin-2 ekspresyonuna yol sonra sadece 2), protokol tekrarlanabilir yazarları tarafından bildirildiği gibi, farklılaşma nispeten hızlı bir şekilde gerçekleşirhiPSC çizgi) tarting ve hiPSC-to-nöron dönüşüm (yaklaşık% 100) yüksek verimli olduğunu. kendi protokol oluşturulacak nöron popülasyonu nöronal bozukluklar hücre türüne özgü katkılar inceleme sağlayan homojen (üst katman kortikal nöronlar benzeri) almaktadır. Dahası, onların hiPSC türetilmiş nöronlar sadece 20 d sonra olgun özelliklere (örneğin, yetenek sinapsları ve sağlam fonksiyonel aktiviteyi oluşturmak için) sergiledi. ağ düzeyinde hiPSC türetilmiş nöronların elektrofizyolojik özelliklerin belirlenmesi hiPSC teknolojisi önce önemli bir ön koşul insan hastalıklarının incelenmesi için istismar edilebilir. Bu nedenle, pek çok araştırma grupları son zamanlarda mikro-elektrot dizisi (MEA) cihazları (Çok Kanallı Sistemleri, Reutlingen, Almanya) 13-16 kullanarak ağ düzeyinde kök hücre kökenli nöronlar araştırmaya başlamışlardır. Bir MEA elektrotlar nöronal hücre kültürlenebilir hangi bir alt-tabaka içine gömülür.Taraflı çevre nöronal ağlar ve aktivitesinin in vitro gelişimi elektrofizyolojik özellikleri keşfetmek için kullanılabilir. Şu anda, ÇÇA sadece olgun ağlar elde etmek için birkaç ay sürebilir farklılaşma protokolleri ile birlikte kullanılır. Bu nedenle, hızlı bir farklılaşma protokolü ile ÇÇA birleştiren nörolojik bozuklukların büyük ölçekli çalışmalarda bu teknolojisinden kolaylaştırmalıdır. Burada, Zhang ve arkadaşları bir modifikasyonunu sunulmaktadır. (2013) 12 protokol ve ÇÇA kullanılmak üzere adapte. Özellikle, daha doğrusu bir akut lentiviral transdüksiyon güvenmek yerine, biz yerine stabil farklılaşma oluşturulmadan önce rtTA / Ngn2 ifade hiPSC hatları oluşturdu. Biz nöronal hücre yoğunluğu nöronal ağ oluşumu için kritik öneme sahiptir ve nöronlar ve MEA 17,18 elektrotları arasında iyi temas beri, nöronal hücre yoğunluğu üzerinde tekrarlanabilir kontrole sahip öncelikle yaptı. althougH Zhang ve ark. Protokol kalıt hiPSCs dönüştürülmesi ile ilgili olarak çok daha etkili olduğunu, başlangıçta 12 (Zhang ve ark. Şekil 2e) kaplamalı hiPSCs sayısından nöronların nihai verimi bakımından doğal bir değişkendir. istikrarlı bir çizgi ile, biz böyle lentiviral toksisite ve enfeksiyon verimliliği gibi değişkenliği neden birçok konuda, ortadan kaldırır. Daha sonra ağ olgunlaşmasını elde güvenilir ÇÇA üzerinde hiPSC türetilmiş nöron ağları üreten parametrelerini optimize (örneğin, kanallar çoğunluğunu kapsayan eşzamanlı olaylar) üçüncü haftasında. Bu hızlı ve güvenilir bir protokol farklı (yani hastaya özgü) hiPSC hatları yanı sıra farmakolojik çalışmalar için sağlam tutarlılık sağlamak türetilen nöronlar arasında doğrudan karşılaştırmalar etkinleştirmeniz gerekir.

<table><tbody><tr><td>Lebovitz'in L-15 orta</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>B-27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin (PDL)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Ca 2 + / Mg2 + içermeyen HBSS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>%0,05 Tripsin-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>%2,5 Tripsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek glikozlu DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Sığır Serumu)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>70 ve mikro; m hücre süzgeci</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 lentiviral paketleme vektörü</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G lentiviral paketleme vektörü</td><td>Addgene</td><td>Plazmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>Bodrum membran matrisi</td><td>Gibco</td><td>A1413201</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Hücre ayırma çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>E8 orta</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitörü</td><td>Gibco</td><td>A2644501&nbsp;</td><td>Alternatif olarak, tiazovivin gibi ROCK inhibitörleri kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu MEAs</td><td>Çok Kanallı Sistemler</td><td>60-6wellMEA200 / 30iR-Ti-tcr</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td>VWR</td><td>631-0899</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornitin (PLO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3655-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Doksisiklin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-5G</td><td></td></tr><tr><td>N-2 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>NT-3, insan rekombinantı</td><td>Promokine</td><td>C66425</td><td></td></tr><tr><td>BDNF, insan rekombinant</td><td>Promokine</td><td>C66212</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>L-alanil-L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Sitozin ve beta;-D-arabinofuranosid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Düz ince uçlu forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu yaylı makas&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

mikro-elektrot dizileri ağ aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin rapid nöronal farklılaşma

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

insan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre türetilen Nöronlar (hiPSCs) nörolojik bozukluklar çalışmak için umut verici yeni bir araç sağlar. Son on yıl içinde, nöronlar içine hiPSCs ayırt etmek için birçok protokol geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu protokoller genellikle yüksek değişkenliği düşük tekrarlanabilirlik ve düşük verimlilik ile yavaştır. Buna ek olarak, bu protokoller elde nöronlar genellikle olgun ve nöronlar birkaç ay boyunca kültürlenir sürece, hem tek hücreli ve ağ seviyelerde yeterli fonksiyonel aktivitesi eksikliği. Kısmen Bu sınırlamalar nedeniyle, hiPSC türetilmiş nöronal ağların fonksiyonel özellikleri henüz tam olarak karakterize edilmiştir. Burada, transkripsiyon faktörü neurogenin-2, 12 zorlanmış ekspresyonu ile hiPSCs insan nöron üretimini tarif yakın zamanda yayınlanan bir protokolün uyum sağlar. Bu protokol hızlı det yaklaşık% 100 dönüşüm verimliliği ile ve verimli (olgun 3 hafta içinde nöronlar veren) birEd hücreleri (&gt; DAPI-pozitif hücre% 95 olan MAP2 pozitif). Ayrıca, iletişim kuralı, nörolojik bozukluklar, hücre türüne özgü katkılar araştırılmasını sağlayacak uyarıcı nöronlardan homojen bir popülasyonu verir. Biz bize nöronların sayısı üzerinde tam kontrol vererek, stabil transduced hiPSC hücreleri üreterek özgün protokol güncellenmiştir. Bu hücreler daha sonra, mikro-elektrot dizileri üzerinde hiPSC türetilen nöron ağları oluşturmak için kullanılır. Bu şekilde, hiPSC türetilmiş nöronal ağların kendiliğinden elektrofizyolojik aktivite ölçülebilir ve hücre yoğunluğu açısından interexperimental tutarlılık korurken, karakterize edilir. sunulan protokol özellikle insan nöronal ağlarda mekanik ve farmakolojik çalışmalar için, geniş çapta uygulanabilir.

Burada başarılı hiPSCs transkripsiyon faktörü neurogenin-2 üzerinde 12 salgılayan kortikal nöronlar doğrudan farklılaşmış olan bir protokol yapılması ve biz ÇÇA kullanımı için adapte edilmiştir. Bu yaklaşım, hızlı ve bize farklılaşma indüksiyon sonrası üçüncü haftasında zaten fonksiyonel nöronlar ve ağ etkinliğini elde etmek için izin etkilidir. Farklılaşma protokolü sırasında, hücreler morfolojik nöronlar benzemeye başladı: küçük süreçler oluşturulmuş ve nöronlar birbirlerine (Şekil 1A) bağlanırken başladı. Bu gelişme sırasında nöronal morfoloji ve sinaptik özelliklerini ölçerek, sağlıklı kontrol hiPSC hattından türetilen nöron nörofizyolojik profilini oluşturmuştur. hiPSC türetilen nöron başlangıç ​​takip eden farklı günlerde MAP2 ve synapsin-1/2 için boyandıfarklılaşma (Şekil 2A). türetilmiş nöronlar 3 hafta farklılaşma indüksiyon sonrası zaten olgun nöronal morfoloji göstermektedir. sinapsin-1/2 puncta (sinaps sayısı için bir ölçü) sayısı synapsin-1/2 immünositokimya boyamalar göre ölçülmüştür. Sinapsin-1/2 puncta sayısı nöronal bağlantı düzeyi de (Şekil 2B) artmakta olduğunu göstermektedir, zamanla artmıştır. 23 gün farklılaşmasının indüksiyonu sonrasında sinapsin-1/2 puncta sayısı iki bağımsız IPS hatları (Şekil 2C) benzerdi. 23. En DIV synapsin1 / 2 puncta fonksiyonel sinaps (Şekil 2D) göstermektedir PSD-95 puncta, bitişik edildi. Zhang ve arkadaşları tarafından tarif edilen sonuçlarla tutarlıdır. Biz pan nöronal ve alt tip spesifik kortikal m teyit uyarıcı üst katman kortikal nöronlar popülasyonu oluşturulur Bu BRN2 ve SATB2 olarak arkers (katman II / III). Biz derin katman nöronların CTIP2 (katman V) ya da Foxp2 (katman VI) (Şekil 2E ve F) için pozitif nöronlar dikkat etmedi HiPSC türetilen nöron elektrofizyolojik aktivite karakterize etmek için, geliştirme sırasında ölçüldü bu nöronlar üzerinde bütün hücre akımı ve gerilim kelepçe kayıtları, örneğin, iç özellikleri ve heyecanlandırıcı girişleri kullanılmıştır. Nöronlar farklılaşma ve hücre spike yüzdesinin zaman (Şekil 2G ve H) üzerinden artan sonra zaten bir hafta aksiyon potansiyelleri oluşturmak başardık. Ayrıca, nöronlar farklılaşmanın başlaması bir hafta sonra zaten uyarıcı sinaptik girdi aldı: uyarıcı sinaptik girdi hem frekans ve genlik gelişimi sırasında (Şekil 2I - K) arttı. nt "fo: = keep-together.within-sayfa" 1 "&gt; daha tek hücre etkinliği ağ düzeyinde fonksiyonlarını oluşturacak şekilde birleştirir nasıl anlamak için, nöronlar uyum içinde nasıl çalıştığını incelemek için esastır ÇÇA üzerinde in vitro nöronal ağlar kültür. nöronal dinamiklerini incelemek için değerli bir deneysel model oluşturmaktadır. Biz 6-kuyu ÇÇA (Şekil 2M) kültüre sağlıklı kontrol hiPSC hattından elde edilen nöronların elektrofizyolojik ağ etkinliğinin 20 dakika kaydedildi. Birkaç hafta farklılaşmasının indüksiyon sonrası, nöronlar . sağlıklı kontrol hiPSCs türetilen spontan olaylar (0.62 ± 0.05 başak / s Şekil 2N) gösteren fonksiyonel olarak aktif nöron ağları oluşturulmuştur (yani 16 d farklılaşma başladıktan sonra) gelişme bu aşamada tüm kanallar ilgilendiren bir senkron olaylar . ÇÇA (Şekil 2O) tespit edilir ağ aktivite düzeyi gelişimi sırasında artmış: t sonra dördüncü haftasında (Şekil 2N 2.5 ± 0.1 başak / s) cihazının tüm kuyularda farklılaşmanın o indüksiyon, nöronal ağlar spontan aktivite yüksek düzeyde gösterdi. Uzun süreli ağları da sergilenen senkron ağ patlamaları (4.1 ± 0.1 patlama / dk Şekil 2O) (2100 ± 500 ms). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig1.jpg"> Şekil 1: Nöronlar içine hiPSC Farklılaşma. Lamelleri nöronların içine hiPSCs farklılaşma A. Üç kez puan. ÇÇA üzerinde hiPSCs B. Kaplama. C. Astrositler T75 şişesi içinde% 100 birbirine karıştığında (hücreler baklava tek tabaka oluşturur dikkat edin). Ölçek çubukları: 150 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 1 "&gt;:" keep-together.within sayfa = fo "e_content <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54900/54900fig2.jpg"> Şekil 2. Nöronlar Karakterizasyonu hiPSC türevi. C. hiPSC türetilen nöron farklılaşma başladıktan sonra MAP2 (yeşil) ve synapsin-1/2 (kırmızı), farklı günlerde için boyandı. Ölçek çubuğu: 10 mikron. İki bağımsız deneyde sinapsin puncta B. miktarının belirlenmesi. Her bir deney en az 10 hücre analiz edilmiştir. Iki bağımsız IPS çizgilerinden türetilen nöronlarda DIV23 de sinapsin puncta C. miktarının belirlenmesi. D. hiPSC türetilen nöron PSD-95 (yeşil) için boyandı ve synapsin-1/2 (kırmızı) 23 gün farklılaşma başladıktan sonra bulundu. Synapsin puncta PSD-95 puncta bitişik olduğundan. E. hiPSC türetilmiş nöronlar MAP2 (yeşil) ve BRN2 (kırmızı) veya SATB2 (kırmızı) farklılaşma başlamasından sonra 23 gün süreyle boyandı. Map2 pozitif hücrelerin F. yüzdesi obelirtilen belirteçler için pozitifti. Bu aksiyon potansiyeli gösteren G. Örnek mevcut kelepçe kayıtları gibi erken farklılaşma başladıktan sonra 7 gün olarak oluşturulabilir. Bir veya daha fazla aksiyon potansiyelleri göstermektedir farklılaşmanın başlaması takip eden farklı günlerde hücreler H. yüzdesi. I. farklılaşma takip eden farklı günlerde hiPSC türetilen nöron tarafından alınan eksitatuvar postsinaptik akımlar (EPSCs) temsil eden iz. Gelişimi sırasında eksitatuvar postsinaptik akımlar J. sıklığı. Gelişimi sırasında eksitatuvar postsinaptik akımlar K. genliği. L. Temsilcisi (kontrol) olmadan ve CNQX (CNKX) ile EPSC kayıtları izler. Bir hiPSC çizgisinden türetilen M. Nöronlar 6 oyuklu MEA kültürlendi ve ağ etkinliği hiPSC türetilmiş nöronal ağlar 16 ve farklılaşmasının indüksiyonu sonrasında 23 gün boyunca gösterilmektedir. kaydedilen aktivitesiher bir (10 kHz'lik örnekleme oranı), farklı bir renk ile belirtilir (kayıt 20 dakika 5 dakika gösterilmiştir). N. Atış hızı 16 ve farklılaşma indüksiyon sonrası 23, d. O. Patlama hızı 16 ve farklılaşma indüksiyon sonrası 23, d. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54900/54900fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> sonuçlar göz önüne alındığında, elde edilen hiPSC türetilen nöron kalitesi hücre nörofizyolojik profil verme ile değerlendirilebilir. Bu üç ila dört hafta değerlendirilebilir farklılaşma, morfoloji, sinapsin-1/2 ekspresyonu ve nöronların elektrofizyoloji başlamasından sonra vardır. Bu zaman noktasında, hiPSC türetilmiş nöronlar MAP2, sinapsin / PSD-95 pozitif performans immünsitokimya için, nöronal benzeri morfoloji gösteren ve sergisi beklenmektedirt spontan elektrofizyolojik aktivite (her ikisi de tek hücre ve ağ düzeyinde).

Biz değiştirmek ve uyarıcı kortikal nöronların 12 içine insan kaynaklı pluripotent Kök Hücre (hiPSCs) arasında hızlı, tekrarlanabilir ve verimli farklılaşma anlatan bir önceden yayınlanmış protokolü uygulamak. Özellikle, modifikasyon ağ düzeyinde elektrofizyolojik özelliklerini ölçmek için, mikro-elektrot dizileri üzerinde nöronal hücre yoğunluğu ve kullanım kontrol edilmesini sağlar.

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Bu nöronal farklılaşma protokolünün genel amacı, mikroelektrot dizileri üzerinde büyüyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden hızlı ve kontrollü bir şekilde nöronal ağlar oluşturmaktır. Bu yöntem, sinirbilim alanlarındaki temel soruları ele almak için kullanılabilir. Nörolojik bozuklukların altında yatan biyolojik mekanizmaları incelemek için kullanılabilir, ancak daha temel nörobiyolojik soruları ele almak için de kullanılabilir.Bu tekniğin en büyük avantajı, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin kontrollü bir şekilde nöronlara hızlı bir şekilde farklılaşmasıdır. Birinci gün, %1 penisilin streptomisin içeren DMEM / F12, CDS ve E8 ortamını oda sıcaklığına ısıtın. Daha sonra, mililitre başına dört mikrogramlık bir son konsantrasyon elde etmek için E8 ortamına doksisiklin ekleyin ve ardından karışıma kaya inhibitörü ekleyin.RTTANGN2 pozitif hiPSC'lerin harcanan ortamını aspire edin ve hücrelere bir mililitre CDS ekleyin. Daha sonra, hücreleri nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatörde üç ila beş dakika inkübe edin. Mikroskop altında, hücrelerin birbirinden ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin.Ardından, kuyuya iki mililitre DMEM / F12 ekleyin. Hücreleri 1.000 mikrolitrelik bir pipetle yavaşça askıya alın ve daha sonra 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna yedi mililitre DMEM / F12 ekleyin ve hücreleri beş dakika boyunca 200 x g'da döndürün.Beş dakika sonra, süpernatanı aspire edin ve hazırlanan E8 ortamından iki mililitre ekleyin. 1.000 mikrolitrelik bir pipetin ucunu 15 mililitrelik tüpün kenarına koyarak ve hücreleri nazikçe yeniden süspanse ederek hiPSC'leri ayırın. Mikroskop altında, hücrelerin ayrışıp ayrışmadığını kontrol edin.Ardından, bir hemositometre kullanarak mililitre başına hücre sayısını belirleyin. Altı kuyucuklu MEA için, mililitre başına 7.5 kez 10 ila beşinci hücreye kadar bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri seyreltin. Kapak kaymaları için, mililitre başına dört kez 10 ila dördüncü hücrelik bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri seyreltin.Seyreltilmiş laminini kapak kızaklarından ve altı kuyulu MEA'dan aspire edin. Altı kuyulu MEA için, her bir oyuktaki aktif elektrot alanına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri kaplayın. Daha sonra, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri plakalayın.Ardından, altı kuyulu MEA'yı veya 24 kuyulu plakayı nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. İki saat sonra, altı kuyucuklu MEA'nın her bir oyuğuna dikkatlice 500 mikrolitre hazırlanmış E8 ortamı ekleyin. Daha sonra, altı kuyulu MEA'yı gece boyunca nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.Üçüncü günde,% 0.05 Tripsin-EDTA'yı oda sıcaklığına ısıtın. % 1 penisilin streptomisin ile DPBS ve DMEM / F12'yi 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Ardından, sıçan astrosit kültürünün harcanan ortamını aspire edin.Beş mililitre DPBS ekleyerek kültürü yıkayın ve hafifçe çevirin. Daha sonra, DPBS'yi aspire edin ve beş mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Tripsin-EDTA'yı hafifçe çevirin.Daha sonra hücreleri nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatörde beş ila 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını incelemek için mikroskop altında kontrol edin. Şişeye birkaç kez vurarak son hücreleri ayırın.Ardından, şişeye beş mililitre DMEM / F12 ekleyin. Şişenin içindeki hücreleri 10 mililitrelik bir pipetle nazikçe derecelendirmeye çalışın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.Tüpü sekiz dakika boyunca 200 x g'da döndürün. Bundan sonra, süpernatenti aspire edin ve hücreleri bir mililitre DMEM / F12'de yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak mililitre başına hücre sayısını belirleyin.Daha sonra, altı kuyu MEA'sının her bir kuyucuğuna dördüncü astrositlere 7.5 çarpı 10 ekleyin. Ve 10 oyuklu plakanın her bir oyuğuna dördüncü astrositlere iki kez 24 ekleyin. Hücreleri gece boyunca nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatörde inkübe edin.Verileri 1.200 kat amplifikasyonda alın ve MCS veri toplama kartını kullanarak sinyali 10 kilohertz'de örnekleyin. MEA'larda kültürlenen hiPSC türevi nöronların 20 dakikalık elektrofizyolojik aktivitesini kaydedin. Kayıt sırasında, sıcaklığı 37 santigrat derecede tutun ve MEA'lara sabit ve yavaş bir nemlendirilmiş gaz akışı sağlayarak orta buharlaşmayı ve pH değişikliklerini önleyin.Bundan sonra, özel bir yazılım paketi kullanarak verileri analiz edin. Bu şekil, nöronal olgunlaşmayı gösteren farklılaşma süreci sırasında sinapsin içindeki nöronal belirteçler MAP2'nin ekspresyon değişikliklerini göstermektedir. Bu grafik, farklılaşma işlemi sırasında artan tek tek hücreler için sinapsin ekspresyonunun ölçüldüğünü göstermektedir.Üç haftalık farklılaşmadan sonra hücrelerde eksprese edilen sinapsin, PSD-95 ile birlikte lokalize olur ve fonksiyonel sinapsların varlığını gösterir. Burada, hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesini ölçmek için farklılaşma işlemi sırasında farklı zaman noktalarında tüm hücre yama klempi gerçekleştirildi. Hücreler, farklı zaman noktalarında aksiyon potansiyelleri üretebildi.Ve zamanla artan sivri hücrelerin yüzdesi, hücrelerin çoğunun, farklılaşmanın erken aşamasında bile aksiyon potansiyelleri üretebildiğini göstermektedir. Hücreler tarafından alınan uyarıcı postsinaptik akımları ölçmek için yama kelepçesi de kullanıldı. Farklılaşma işlemi sırasında hücrelerin aldığı girdi sayısı artmıştır.Uyarıcı postsinaptik akımların hem frekansı hem de genliği, farklılaşma işlemi sırasında artmıştır. Mikroelektrot dizileri üzerinde farklılaşan hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesi, farklılaşma işlemi sırasında ölçüldü. Burada, farklılaşma sürecinde nöronal ağ aktivitesi arttı ve 23 gün sonra senkron olaylar gösterdi.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri üç ila dört hafta içinde fonksiyonel nöronal ağlara farklılaştırmak için kullanılabilir. Bu prosedürü denerken, steril çalışmayı ve hücreleri nazikçe tedavi etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hastaların hücre dizilerinde gözlenen fenotipi kurtarmak için farmakolojik testler gibi diğer yöntemler kullanılabilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların nörolojik bozukluklardaki ağ aktivitesi kusurlarını resmi olarak incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, pluripotent kök hücreleri hızlı ve kontrollü bir şekilde nöronlara nasıl ayırt edeceğinizi, indükleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

rapid-neuronal-differentiation-induced-pluripotent-stem-cells-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video, hipokampal nöronlara sahip düzlemsel bir mikroelektrot dizisine bağlı bir 3D nöronal kültürün gelişimini göstermektedir. İzole edilmiş nöronlar, mikroelektrot dizisinin aktif alanı üzerinde 2 boyutlu bir ağ oluşturur ve bir zar eki olan çok kuyulu bir plakada cam mikro boncuklara yapışır. Bu nöron kaplı mikro boncukları elektroda aktardıktan sonra, birbirine bağlı bir 3D sinir ağı halinde düzenlenirler.

Mikro elektrot dizilerine bağlı üç boyutlu nöronal ağlar oluşturma

Video, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) uyarıcı kortikal nöronlar üretmek için bir yöntem göstermektedir. Doksisiklin indüksiyonu üzerine, hiPSC'ler nöral spesifik bir transkripsiyon faktörü olan nörogenin-2'yi aşırı eksprese eder. Bu süreç, belirli ortamlar kullanarak ve astrositlerle birlikte kültürlenerek, hiPSC'lerin sinaptik bağlantıları olan nöronlara farklılaşmasını kolaylaştırır.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mikro Elektrot Dizileri Üzerinde Nöronlara Farklılaşması

Video, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) türetilen nöronların elektrofizyolojik aktivitesini kaydetmek için bir mikroelektrot dizisinin (MEA) nasıl kullanılacağını gösterir. Bir nöron-astrosit ko-kültürü içeren çok kuyulu bir MEA'dan elde edilen elektrofizyolojik aktivite, ağdaki birden fazla nörondan gelen aksiyon potansiyellerini tespit etmek için kaydedilir ve hiPSC'lerin nöronlara başarılı bir şekilde farklılaştığını doğrular.

Mikro-elektrot dizileri kullanılarak nöronal ağların elektrofizyolojik aktivitesinin ölçülmesi

Bu yazıda mekansal sınırlandırılmış işlevsel birbirine bağlı nöronal devrelerin oluşturduğu nitro modüler ağlarda büyümek için bir protokol açıklamaktadır. Bir polimerik maske kültürleme alt-tabaka üzerine hücresel yapışmayı teşvik etmek için model bir protein tabakası kullanılır. Kaplama nöronlar kaplı alanlarda kendiliğinden bağlantılarının kurulması ve elektrofizyolojik aktivite sergileyen üzerinde büyür.

Tasarım, Tedavi, Hücresel Kaplama ve Fonksiyonel Inter-bağlantılı Devreler oluşan Modüler Nöronal Ağları Kültüre Yüzey

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC), ilaç ve kimyasal tarama için ve nörotoksisiteyi de içeren toksisite testi için yeni in vitro modellerin geliştirilmesi için güçlü bir araç olarak düşünülür. Burada, hiPSC'lerin nöronlara ve glia'ya diferansiyelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol anlatılmıştır.

Nörotoksisite Testi İçin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Nöronlar ve Glia Karışık Kültürlerine Ayrıştırılması Protokolü

Çok elektrotlu diziler üzerinde kültürlenen fare nöronal hücreleri, elektrik stimülasyonunu takiben yanıtta bir artış sergilemektedir. Bu protokol, nöronların nasıl kültürlendiğini, aktivitenin nasıl kaydedildiğini ve uyarılma modellerine cevap vermek için ağları eğitmek için nasıl protokol oluşturacağını gösterir.

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Bu protokol, bölümlenmiş mikrofluidik çiplerin kullanımını gösterir, insan kök hücrelerinden ayırt edilen kültürlü nöronlara döngüsel olefin kopolimer enjeksiyon kalıplı. Bu cips önceden montajlı ve daha kolay-geleneksel bölümleşmiş Poly (dimetilsiloxane) cihazlar daha kullanımı. Viral etiketleme, fluidik izolasyon, akotomi ve immünostasyon gibi çoklu yaygın deneysel paradigmalar burada açıklanmıştır.

Ön montajlı plastik mikrofluidik cips içinde ınsan kök hücresi türeyen neurons compartmentalization

Bu protokol, daha önce birden fazla hafta boyunca in vitro nöral atalardan farklılaşmış insan kök hücre türetilmiş nöronlar resucan ve kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Prosedür, ışık mikroskobu ve yüksek içerikli tarama ile uyumlu bir formatta nöritler, sinapslar ve geç ifade nöronal belirteçlerin görüntüleme tabanlı tahlilleri kolaylaştırır.

Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag

Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit (hiPSC-CM) ağlarının gelişimi için bir dizi protokolün yanı sıra, hücre membranı hareket potansiyeli ölçümleri için ters şekilde electroporate etmek için multiwell MEA plakaları üzerinde kültürlü bir set içerir. Yüksek verimlilik kayıtları aynı hücre sitelerinden gün içinde tekrar tekrar elde edilir.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

Omurilik insan kaynaklı pluripotent kaynaklı astrositleri ve nöronları ve elektrofizyolojik kayıt için ortak kültürlerini ayırt etmek için bir yöntem tanımladık.

ALS'yi Bölgesel Olarak Spesifik İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositler ve Nöronlarla Modellemek için Bir Elektrofizyolojik Platformun Kurulması

Bu protokol, in vitro epilepsiyi modellemek için dorsal-ventral kaynaşmış asembloidleri çoklu elektrot dizileri üzerinde stabil bir şekilde plakalamayı amaçlamaktadır.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Topluluklarını Kullanarak Epilepsiyi Modellemek için Çok Elektrotlu Bir Dizi Platformu

Öğrenin, mikro-elektrot dizileri üzerinde insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden hızlı ve kontrollü nöron farklılaşması protokolünü. Bu yöntem, nörolojik bozuklukların ağ aktivite kusurlarını incelemek için kullanılır.

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Daha fazla video keşfet