Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Bu nöronal farklılaşma protokolünün genel amacı, mikroelektrot dizileri üzerinde büyüyen insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden hızlı ve kontrollü bir şekilde nöronal ağlar oluşturmaktır. Bu yöntem, sinirbilim alanlarındaki temel soruları ele almak için kullanılabilir. Nörolojik bozuklukların altında yatan biyolojik mekanizmaları incelemek için kullanılabilir, ancak daha temel nörobiyolojik soruları ele almak için de kullanılabilir.

Bu tekniğin en büyük avantajı, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin kontrollü bir şekilde nöronlara hızlı bir şekilde farklılaşmasıdır. Birinci gün, %1 penisilin streptomisin içeren DMEM / F12, CDS ve E8 ortamını oda sıcaklığına ısıtın. Daha sonra, mililitre başına dört mikrogramlık bir son konsantrasyon elde etmek için E8 ortamına doksisiklin ekleyin ve ardından karışıma kaya inhibitörü ekleyin.

RTTANGN2 pozitif hiPSC'lerin harcanan ortamını aspire edin ve hücrelere bir mililitre CDS ekleyin. Daha sonra, hücreleri nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatörde üç ila beş dakika inkübe edin. Mikroskop altında, hücrelerin birbirinden ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin.

Ardından, kuyuya iki mililitre DMEM / F12 ekleyin. Hücreleri 1.000 mikrolitrelik bir pipetle yavaşça askıya alın ve daha sonra 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna yedi mililitre DMEM / F12 ekleyin ve hücreleri beş dakika boyunca 200 x g'da döndürün.

Beş dakika sonra, süpernatanı aspire edin ve hazırlanan E8 ortamından iki mililitre ekleyin. 1.000 mikrolitrelik bir pipetin ucunu 15 mililitrelik tüpün kenarına koyarak ve hücreleri nazikçe yeniden süspanse ederek hiPSC'leri ayırın. Mikroskop altında, hücrelerin ayrışıp ayrışmadığını kontrol edin.

Ardından, bir hemositometre kullanarak mililitre başına hücre sayısını belirleyin. Altı kuyucuklu MEA için, mililitre başına 7.5 kez 10 ila beşinci hücreye kadar bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri seyreltin. Kapak kaymaları için, mililitre başına dört kez 10 ila dördüncü hücrelik bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri seyreltin.

Seyreltilmiş laminini kapak kızaklarından ve altı kuyulu MEA'dan aspire edin. Altı kuyulu MEA için, her bir oyuktaki aktif elektrot alanına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri kaplayın. Daha sonra, 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri plakalayın.

Ardından, altı kuyulu MEA'yı veya 24 kuyulu plakayı nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. İki saat sonra, altı kuyucuklu MEA'nın her bir oyuğuna dikkatlice 500 mikrolitre hazırlanmış E8 ortamı ekleyin. Daha sonra, altı kuyulu MEA'yı gece boyunca nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.

Üçüncü günde,% 0.05 Tripsin-EDTA'yı oda sıcaklığına ısıtın. % 1 penisilin streptomisin ile DPBS ve DMEM / F12'yi 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Ardından, sıçan astrosit kültürünün harcanan ortamını aspire edin.

Beş mililitre DPBS ekleyerek kültürü yıkayın ve hafifçe çevirin. Daha sonra, DPBS'yi aspire edin ve beş mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Tripsin-EDTA'yı hafifçe çevirin.

Daha sonra hücreleri nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatörde beş ila 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını incelemek için mikroskop altında kontrol edin. Şişeye birkaç kez vurarak son hücreleri ayırın.

Ardından, şişeye beş mililitre DMEM / F12 ekleyin. Şişenin içindeki hücreleri 10 mililitrelik bir pipetle nazikçe derecelendirmeye çalışın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte toplayın.

Tüpü sekiz dakika boyunca 200 x g'da döndürün. Bundan sonra, süpernatenti aspire edin ve hücreleri bir mililitre DMEM / F12'de yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak mililitre başına hücre sayısını belirleyin.

Daha sonra, altı kuyu MEA'sının her bir kuyucuğuna dördüncü astrositlere 7.5 çarpı 10 ekleyin. Ve 10 oyuklu plakanın her bir oyuğuna dördüncü astrositlere iki kez 24 ekleyin. Hücreleri gece boyunca nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatörde inkübe edin.

Verileri 1.200 kat amplifikasyonda alın ve MCS veri toplama kartını kullanarak sinyali 10 kilohertz'de örnekleyin. MEA'larda kültürlenen hiPSC türevi nöronların 20 dakikalık elektrofizyolojik aktivitesini kaydedin. Kayıt sırasında, sıcaklığı 37 santigrat derecede tutun ve MEA'lara sabit ve yavaş bir nemlendirilmiş gaz akışı sağlayarak orta buharlaşmayı ve pH değişikliklerini önleyin.

Bundan sonra, özel bir yazılım paketi kullanarak verileri analiz edin. Bu şekil, nöronal olgunlaşmayı gösteren farklılaşma süreci sırasında sinapsin içindeki nöronal belirteçler MAP2'nin ekspresyon değişikliklerini göstermektedir. Bu grafik, farklılaşma işlemi sırasında artan tek tek hücreler için sinapsin ekspresyonunun ölçüldüğünü göstermektedir.

Üç haftalık farklılaşmadan sonra hücrelerde eksprese edilen sinapsin, PSD-95 ile birlikte lokalize olur ve fonksiyonel sinapsların varlığını gösterir. Burada, hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesini ölçmek için farklılaşma işlemi sırasında farklı zaman noktalarında tüm hücre yama klempi gerçekleştirildi. Hücreler, farklı zaman noktalarında aksiyon potansiyelleri üretebildi.

Ve zamanla artan sivri hücrelerin yüzdesi, hücrelerin çoğunun, farklılaşmanın erken aşamasında bile aksiyon potansiyelleri üretebildiğini göstermektedir. Hücreler tarafından alınan uyarıcı postsinaptik akımları ölçmek için yama kelepçesi de kullanıldı. Farklılaşma işlemi sırasında hücrelerin aldığı girdi sayısı artmıştır.

Uyarıcı postsinaptik akımların hem frekansı hem de genliği, farklılaşma işlemi sırasında artmıştır. Mikroelektrot dizileri üzerinde farklılaşan hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesi, farklılaşma işlemi sırasında ölçüldü. Burada, farklılaşma sürecinde nöronal ağ aktivitesi arttı ve 23 gün sonra senkron olaylar gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, indüklenmiş pluripotent kök hücreleri üç ila dört hafta içinde fonksiyonel nöronal ağlara farklılaştırmak için kullanılabilir. Bu prosedürü denerken, steril çalışmayı ve hücreleri nazikçe tedavi etmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hastaların hücre dizilerinde gözlenen fenotipi kurtarmak için farmakolojik testler gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların nörolojik bozukluklardaki ağ aktivitesi kusurlarını resmi olarak incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, pluripotent kök hücreleri hızlı ve kontrollü bir şekilde nöronlara nasıl ayırt edeceğinizi, indükleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.