Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi C. elegans Germline

Bu deneyin genel amacı, C.elegans gonadlarında in vivo aktif ERK seviyelerini test etmektir. Bu yöntem, ilaç tedavilerinin veya gen bozulmalarının RAS-ERK yolu üzerindeki etkileri ve dolayısıyla germ hücresi gelişimi gibi ERK sinyalizasyonu ve germ hücresi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, ERK sinyal modelinin ve gücünün in vivo olarak ölçülebilmesidir.

İstenilen gelişim aşamasında 100 ila 150 solucan seçin ve bunları 100 mikrolitre M9 tamponu içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Daha sonra mikrosantrifüj tüpünü 900 mikrolitre daha M9 tamponu ile doldurun ve oda sıcaklığında bir dakika boyunca 1000 kez g'de santrifüjleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, M9 tamponunun 900 mikrolitresini yavaşça çıkarın.

Ardından, bağlı bakterilerin çoğunu çıkarmak için yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Ardından, geniş uçlu delikli 200 mikrolitrelik bir mikropipet ucu kullanarak, solucanları 100 mikrolitre M9 tampon içinde düz tabanlı bir cam saat kabına aktarın. Ardından, tabağa bir ila üç mikrolitre 0.1 molar Levamizol ekleyin ve hafifçe döndürün.

Şimdi, her el için bir diseksiyon aleti yapmak için iki şırıngaya iki adet 25 gauge iğne takın. Diseksiyon mikroskobu altında, her bir iğneyi her bir solucanın altına ve üzerine yerleştirin ve makas benzeri bir hareket kullanarak ikinci faringeal ampulün yakınında her bir solucan üzerinde ince bir kesim yapın. Levamisolün etkili kalması için tüm hayvanları en az bir kez, beş dakika içinde kesin.

Çanaktaki hayvanların diseksiyonunun beş dakikadan kısa sürede tamamlanması çok önemlidir. Ekstrüde edilmiş bir gonadın görünmemesi durumunda, o hayvanın üzerinden atlayın. Uygun ekstrüde gonadlar burada görülebilir.

Diseksiyon tamamlandıktan sonra, bir davlumbaz altında iki mililitre %3 paraformaldehit doğrudan cam saat çanağına ekleyin ve üzerini Parafilm ile kaplayın. Ardından on dakika bekleyin. Ardından, dokuz inçlik bir cam Pasteur pipeti kullanarak saat camına üç mililitre PBS-T ekleyin ve solüsyonu pipet kullanarak karıştırın.

Daha sonra, yeni bir cam pipet kullanarak, solucanları içeren beş mililitre sıvıyı çekin ve bunları beş mililitrelik yeni bir cam konik tüpe aktarın. Daha sonra, tüpü 1000 g'lık bir klinik santrifüjde 30 saniye santrifüjleyin. Şimdi, bir diseksiyon mikroskobu altında, disseke edilen dokuları rahatsız etmeden süpernatanı çıkarın ve atın.

Daha sonra, beş mililitre PBS-T alikotu kullanarak, yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın ve solucanları küçük bir çözelti içinde bitirin. Daha sonra bir cam pipet kullanarak iki mililitre %100 Metanol ekleyin ve dokuları taze bir Pasteur pipeti ile yukarı ve aşağı çekerek hafifçe karıştırın. Şimdi, tüpü en az bir saat boyunca eksi 20 santigrat derecede inkübe edin.

Metanol işleminden sonra, üç PBS-T yıkaması yapın ve yaklaşık 500 mikrolitre PBS-T ile bitirin. Şimdi, yeni bir Pasteur pipeti kullanarak, dokuları yeni bir mililitrelik cam tüpe aktarın ve yerçekimi ile yerleşmelerine izin verin. Beş ila 10 dakika sonra, dokuları rahatsız etmeden tüpten mümkün olduğunca fazla yıkamayı çıkarmak için yeni bir pipet ve mikroskop yardımı kullanın.

Bloğu başlatmak için, bloke edici tampon olan 100 mikrolitre% 30 normal keçi serumu ekleyin. Daha sonra tüpü Parafilm ile örtün ve bir saat oda sıcaklığında bekletin. Bir saat sonra, bir mikroskop kullanarak, yeni bir pipetle mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın.

Daha sonra, 400'de bir oranında seyreltilmiş 100 mikrolitre MAPKYT antikoru% 30 NGS yapın ve dokulara ekleyin. Ardından, tüpü Parafilm ile kapatın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri oda sıcaklığına ısıtın ve 800 mikrolitre PBS-T ekleyin.

Ardından, numuneyi yeni bir cam pipete çekin ve eşit bir süspansiyon elde etmek için nazikçe serbest bırakın. Dokular dibe çöktüğünde, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve yıkamayı toplam üç kez tekrarlayın, her zaman yeni bir pipet kullanın ve asla bir girdap kullanmayın. İkincil antikor, tıpkı birincil antikor gibi uygulanır, sadece dokuların buradan itibaren görüntülenene kadar karanlıkta kalmasına dikkat edilir.

İkincil antikor ile inkübasyondan sonra, son yıkama çıkarıldıktan sonra dokulara 800 mikrolitre seyreltilmiş DAPI çözeltisi ekleyin. Tüpün ağzını Parafilm ile örtün ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, yeni bir pipetle DAPI çözeltisinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın.

Son lekeyi çıkardıktan veya yıkadıktan sonra, tüplere bir damla montaj solüsyonu ekleyin. Şimdi, bir agaroz ped ile bir montaj sürgüsü hazırlayın. Temiz bir cam slayta bir damla eritilmiş %2 agaroz ekleyin ve agarozun üzerine dik olarak ikinci bir temiz slaytı hızlıca yerleştirin.

Son olarak, üst mikroskop lamını çok nazikçe çıkarın. Şimdi, disseke edilen hayvanları pede aktarın ve bir mikroskop yardımıyla peddeki tüm fazla sıvıyı çıkarın. Son olarak, hava kabarcıkları oluşturmadan 24 x 50 milimetrelik bir kapak kayma uygulayın.

Kapak kayma uygulandıktan sonra herhangi bir ek baskı uygulamayın. Bu genellikle sinyal kaybına neden olur. Yabani tip yetişkin hermafroditik hayvanların temsili görüntüleri, ERK'nin Difosforile aktif formunun tipik olarak orta Pakiten bölgesinde, Bölge 1'de ve Bölge 2'deki en olgun Oositlerde görselleştirildiğini ortaya koydu.

Bu aktivasyon modelindeki bozulmalar, sinyal yolundaki değişiklikleri yansıtır. Kadın germ hatları spermi belirtmez ve bu nedenle Bölge 2'de ERK aktivasyonu göstermez, sadece Bölge 1'de zayıf aktivasyon gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik en fazla iki gün sürebilir ve uygun şekilde uygulanırsa ilk gün en fazla zaman alır, bir saat sürer.

Bu prosedürü takiben, protein bolluğu bilgisine ek olarak, RNA transkript seviyesi gibi şeyleri ölçmek için RNA balığı gibi diğer yöntemler kullanılabilir. 1995 yılında geliştirildikten sonra, bu teknik, germ hücresi geliştirme alanındaki araştırmacıların in vivo protein bolluk seviyelerini analiz etmelerinin ve C. elegans'taki kromozom morfolojisini takip etmelerinin yolunu açtı.