Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Bu prosedürün genel amacı, LINC kompleks proteini nesprin-2G için tasarlanmış bir biyosensör aracılığıyla canlı hücrelerde FRET mikroskobu yoluyla nükleoskeleton hücre iskeletinin veya LINC kompleksinin bağlayıcısı üzerindeki kuvvetleri belirlemektir. Bu yöntem, canlı hücrelerin çekirdeğindeki proteinlere uygulanan kuvvetler ve bu kuvvetlerin değişken koşullar altında nasıl değiştiği gibi mekanotransdüksiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, proteinler ve canlı hücreler üzerindeki çok küçük kuvvet seviyelerini ölçme yeteneğidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler görüntü yakalamakta zorlanacaktır. Tüm deney grupları arasında iyi bir sinyal almak için mikroskop lazer gücünü ve kazancını optimize etmek zordur. Başlamak için, NIH 3T3 fiber blast hücrelerini, sıcaklık ve CO2 regülasyonuna sahip standart bir hücre kültürü inkübatöründe altı oyuklu bir hücre kültürü kabında %70 ila %90 arasında birleşecek şekilde büyütün.

Bir hücre kültürü davlumbazında, ortamı çıkarın ve her bir kuyuyu yaklaşık 1 mililitre indirgenmiş serum hücresi ortamı ile durulayın. Her oyuğa 800 mikrolitre indirgenmiş serum hücresi ortamı ekleyin ve altı oyuklu odayı inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, lipo karışımını oluşturmak için 700 mikrolitre indirgenmiş serum hücresi ortamını, 35 mikrolitre lipid taşıyıcı solüsyon ile L etiketli 1.5 mililitrelik bir tüpe pipetleyin.

Süspansiyonu pipetleyerek karıştırın. Daha sonra, indirgenmiş serum hücresi ortamının 100 mikrolitresini, bir ila altı arasında etiketlenmiş altı adet 1.5 mililitrelik tüpün her birine pipetleyin. Nesprin gerginlik sensörü, nesprin başsız sıfır kuvvet kontrolü, mTFP1 ve venüs için plazma DNA'sını metin protokolünde açıklandığı gibi bir ila altı arasındaki tüplere pipetleyin.

Farklı DNA türlerini pipetlerken pipet uçlarını tekrar kullanmayın. Ardından, L tüpünden 100 mikrolitre lipo karışımını etiketli her tüpe pipetleyin ve her tüp için temiz bir pipet kullanarak tekrarlanan pipetleme ile karıştırın. Süspansiyonu 10 ila 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra, etiketlenmiş her tüpten 200 mikrolitreyi, hücreleri içeren hazırlanmış altı oyuklu odanın bir kuyusuna ekleyin. Her bir kuyucuğun üstünü karşılık gelen DNA eklenmiş olarak etiketleyin. Ardından, altı oyuklu odayı dört ila altı saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin.

İnkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve durulamak için bir ila iki mililitre indirgenmiş serum hücresi ortamı ekleyin. İndirgenmiş serum hücresi ortamını aspire edin ve altı oyuklu tabağı inkübatöre beş ila 15 dakika boyunca yerleştirmeden önce her bir kuyucuğa iki mililitre tripsin ekleyin. Hücreler inkübatörde ayrılırken, fosfat tamponlu salin içinde çözülmüş mililitre başına 20 mikrogram konsantrasyonda bir fibronektin tabakası ile altı cam tabanlı görüntüleme kabını kaplayın.

Bulaşıkların hücre kültürü davlumbazındaki yüzeyi kaplamasına izin verin. Hücreler ayrıldıktan sonra iki mililitre DMEM ekleyerek tripsini nötralize edin. Daha sonra, her bir oyuğun içeriğini etiketli 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve sallanan bir rotor santrifüjünde beş dakika boyunca 90 kez g'de döndürün.

Süpernatanı aspire edin ve her hücre peletini bir pipet kullanarak 1.000 mikrolitre DMEM'de yeniden süspanse edin. Fibronektin karışımını cam tabaklardan aspire edin ve her hücre süspansiyonundan 1.000 mikrolitre pipetleyin. Hücreler cam tabakların dibine yerleştikten sonra, her bir oyuğa bir mililitre daha ortam ekleyin.

Hücrelerin hücre inkübatöründe en az 18 ila 24 saat boyunca sensör takmasına ve ifade etmesine izin verin. Transfeksiyon verimliliğini doğrulamak için, mTFP1 için 462 nanometreye veya venüs için 525 nanometreye yakın bir uyarma frekansı ile donatılmış bir floresan mikroskop kullanın. mTFP1 için 492 nanometre veya venüs için 525 nanometre merkezli bir emisyon filtresi kullanın.

Transfeksiyonun tamamlanmasından yaklaşık 18 ila 24 saat sonra, floresan hücrelerin sayısını görüntülenen toplam hücre sayısıyla karşılaştırarak transfeksiyonun etkinliğini incelemek için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanın. Canlı hücreler transfeksiyondan sonraki 48 saat içinde görüntülenemezse, hücreleri beş dakika boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. Hücrelerin fiksasyondan önce 24 ila 48 saat boyunca sensörü ifade etmesine izin verin.

Hücreleri PBS'de saklayın ve 48 saat sonra görüntüleyin. Bir hücre kültürü davlumbazında, hücre ortamını% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş görüntüleme ortamı ile değiştirin. Görüntüleme çanaklarını sıcaklık kontrollü bir konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin.

mTFP1 transfekte edilmiş hücrelere sahip cam görüntüleme çanağını, 60X büyütme ile 1.4 sayısal diyafram açıklığı ile yağ objektifinin üzerine yerleştirin. Geniş alan floresan modunda mTFP1 eksprese eden hücreleri bulun. Görüş alanında bir floresan hücre varken, spektral algılama modunu seçin ve spektral görüntüyü yakalayın.

10 nanometrelik artışlar kullanarak 458 nanometrenin üzerindeki tüm frekansları dahil edin. Hücre üzerinde parlak bir floresan bölge seçin. Spektrumları Veritabanına Kaydet'e tıklayarak spektral veritabanına normalleştirilmiş yoğunluk olarak floresan ROI ortalamasını ekleyin.

Lazer gücünü optimize edin ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde edilecek şekilde kazanç elde edin. Ayarlar farklı ekipmanlar için değişiklik gösterecektir. Venüs ifade eden hücreler için işlemi tekrarlayın ve spektral modda kalın.

458 nanometre yerine 488 nanometrelik bir uyarma frekansı kullanın. Güç ayarlarını gerektiği gibi ayarlayın, ancak emisyon frekanslarını değiştirmeyin. Yaklaşık 20 piksel yarıçaplı parlak bir floresan yatırım getirisi seçin.

Spektrumları Veritabanına Kaydet'e tıklayarak floresan ROI ortalamasını normalleştirilmiş yoğunluk olarak spektral veritabanına ekleyin. Karıştırılmamış görüntüleri yakalamak için, önce yakalama modunu spektral karıştırma olarak değiştirin. Venüs ve mTFP1'in spektral parmak izlerini karıştırma kanallarına ekleyin.

Uyarma lazerini tekrar 458 nanometre argon kaynağına ayarlayın. Nesprin gerginlik sensörünü yerleştirin view çanak 60X yağ objektifinin üzerine. Yeterince parlak ifadeye sahip bir floresan hücreye odaklandıktan sonra, sinyal-gürültü oranını optimize etmek için kazancı ve lazer gücünü ayarlayın.

Nispeten benzer parlaklığa sahip nesprin gerginlik sensörü hücrelerinin en az 15 ila 20 görüntüsünü yakalayın ve aşırı piksel doygunluğundan kaçının. Aynı görüntüleme parametrelerini kullanarak nesprin başsız hücrelerle görüntü yakalama işlemini tekrarlayın. Lipid aracılı bir taşıyıcı kullanılarak nesprin gerginlik sensörü ile transfekte edilen 3T3 fibroblastların temsili 10X büyütülmüş bir görüntüsü burada gösterilmektedir.

Tipik olarak, belirli bir görüş alanında hücrelerin yalnızca bir kısmı transfekte edilir. Burada, spektral olarak karıştırılmamış venüs ve mTFP kanallarında nesprin-TS'yi eksprese eden iki 3T3 çekirdeğinin temsili bir çifti gösterilmektedir. İki kanalın birleştirilmiş renkli görüntüsü en sağdaki panelde gösterilir.

Burada, desenli ve desensiz substratlar üzerinde kararlı eksprese eden MDCK hücrelerinden nesprin-TS maskeli çekirdeklerin temsili bir örneklemesi verilmiştir. Oran görüntüleri, venüs kanalının oranının mTFP kanalına bölünmesi olarak tanımlanır ve göreceli nicel kuvvet karşılaştırmaları yapmak için kullanılabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık sekiz saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, transfeksiyon sırasında DNA tüplerini dikkatli bir şekilde etiketlemeyi unutmamak ve spektral sonuç görüntülerini yakalarken görüntüleme parametrelerini sabit tutmak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, nesprin gerginlik sensörü ile hücrelerin nasıl transfekte edileceğini ve gerginlik sensörü üzerindeki kuvvetle ilişkili olan bilgisayar FRET indeksine spektral olarak çözülmüş görüntüleri nasıl yakalayacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bu durumda, nesprin için bir FRET sensörü kullanılsa da, ölçüm kuvvetinin istendiği hücredeki diğer proteinlere de uygulanabilir.