Name: Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde FRET tabanlı biyosensör kullanarak nükleer LINC kompleksi üzerindeki mekanik kuvvetleri nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, mekanotransdüksiyon süreçlerini anlamak için NIH 3T3 fibroblast hücrelerinde uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, (DEC) R35GM119617 vermek Thomas F. ve Kate Miller Jeffress Memoria (DEC) güven ve NIH tarafından desteklenmiştir. konfokal mikroskop görüntüleme VCU Nanomaterials Karakterizasyonu Çekirdek (KKK) Tesisinde gerçekleştirilmiştir.

1. Nesprin-2G Sensör DNA ve diğer plazmid DNA elde edilir <ol><li> ticari bir kaynaktan Nesprin-2G TS (gerilim sensörü), Nesprin-2G HL (başsız) kontrol, mTFP1, venus, ve TSmod elde edilir. Bütün DNA plazmidleri yaymak ve daha önce 12, 13 tarif edildiği gibi, örneğin DH5a-a gibi Standart E. coli suşları, kullanarak saflaştırılması. </li></ol> Nesprin-2G ve diğer Plazmid DNA ile 2. transfekte hücreler <ol><li> Sıcaklık (37 ° C) ve CO2 (% 5) düzenlenmesi ile standart bir hücre kültürü inkübatöründe bir 6-yuvalı hücre kültürü çanağı içinde% 70-90 konflüansa NIH 3T3 fibroblast hücrelerinin büyütün. hücre büyüme ortamı için,% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kullanın. </li><li> bir hücre kültür kaput, orta kaldırmak ve bir indirgenmiş serum hücre ortamında yaklaşık olarak 1 mL&#39;si ile de her yıkayın. Her bir oyuğa indirgenmiş serum hücre ortamında 800 mcLve kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu odasına yerleştirin. </li><li> Lipid taşıyıcı çözeltisi 35 uL 1.5 ml tüp içine indirgenmiş serum hücre ortamında Pipet 700 uL &quot;lipomix&quot; oluşturulur. Pipetleme ile karıştırın. bir &quot;L&quot; ile tüp etiketleyin </li><li> Altı 1.5 ml tüpler toplayın ve her bir tüpe indirgenmiş serum hücre ortamında 6. pipetle 100 uL aracılığıyla onları 1 etiketleyin. <ol><li> mVenus 5. pipetle 1 ug tüp içine borular 3 ve 4 pipetle 1 OVMP ug içine tüpler 1 ve 2 Pipet 2 Nesprin-HL ug içine aşama 1, pipet 2 Nesprin 2G-TS ug plazmid DNA konsantrasyonu kullanılarak tüp 6. içine yeniden kullanım etmeyin pipet uçları DNA&#39;nın farklı türde pipetlerken zaman. </li></ol></li><li> Her bir işaretlenmiş borusu (1-6), &quot;L&quot; tüp lipomix Pipet 100 uL ve tekrar pipetleme karıştırın. Her tüp için temiz pipet kullanın. 10-20 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> % 70-90 konfluent 6 oyuklu odası içinde bir kuyuya her etiketli tüp 200 mcLHücreler. karşılık gelen DNA ile her bir üst Etiket ilave edildi. 46 saat için bir kuluçka makinesi içinde 6 oyuklu odasına yerleştirin. </li><li> orta aspire ve durulama için indirgenmiş serum hücre ortamında 1-2 ml. , Indirgenmiş serum hücre ortamı aspire her bir göze tripsin 2 mL ekleyin ve inkübatör (5-15 dakika), 6-çukurlu bir tabak yerleştirin. </li><li> Hücreler inkübatör içinde ayırmak birlikte, kat 6 cam alt fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde çözülmüş 20 mg / mL&#39;lik bir konsantrasyonda fibronektinle bir tabaka ile bulaşıkları görüntüleme. kaplamak için yemeklere hücre kültürü kaputu (yaklaşık 20 dakika) yüzey izin verin. </li><li> Hücreler müstakil bir kez DMEM 2 mL eklenerek tripsin nötralize. </li><li> iyi bir etiketli 15-ml santrifüj tüpüne her içeriğini aktarın ve sallanan bir rotor santrifüj içinde 5 dakika için 90 x g&#39;da aşağı doğru döndürün. Süpernatant aspire ve pipet karıştırma ile DMEM 1.000 uL, her hücre topağı yeniden askıya. </li><li> fibronektin karışımı aspireCam kaplar ve pipet cam tabaklar üzerine her bir hücre süspansiyonu 1.000 uL. </li><li> Hücreler cam kasesi taban (~ 15 dakika) yerleşmek sonra hücre kuluçka makinesi içinde de yer ve her DMEM başka bir 1 ml +% 10 FBS +% 1 Pen-Strep ekleyin. Hücreler en az 18-24 saat sensör takmak ve ekspres izin verin. Not: Hücreler, ticari katyonik lipid transfeksiyon reaktifleri (Malzemelerin Tablo) kullanılarak transfekte edilir. Seçenek olarak ise, stabil hücre hatları, bir toksine karşı direnç kazandıran bir gen ile bir plasmid kullanılarak seçilebilir (Nesprin-TS ve -HL için pcDNA plazmidler genetisin direnci ifade eden hücreler (Malzemelerin Tablo) temin eden bir DNA depo web sitesinde bulunabilir ). Ek olarak, viral enfeksiyon yöntemleri (lentivirüs, retrovirüs, veya adenovirüs) transfekte etmek zor olan hücrelerde sensörü ifade etmek için kullanılabilir. </li><li> Nesprin-TS ek olarak, Nesprin HL sıfır için ek hücreleri transfektece kontrol adımlar 2.1-2.12 tarif edildiği gibi; TSmod aynı zamanda sıfır güç kontrol olarak kullanılabilir ve Nesprin-HL benzer FRET sergilemelidir. </li><li> mTFP1 ve venus ile transfekte hücreler spektral parmak izi (Adım 4) üretmek için. Not: mTFP1 ve venus, tipik olarak Nesprin-TS daha yüksek seviyelerde eksprese eder ve bu şekilde DNA alt miktarların benzer ekspresyon seviyelerini elde etmek için transfekte edilmesi gerekebilir. </li></ol> 3. Transfeksiyon Verimi doğrulama <ol><li> Yaklaşık 18-24 saat transfeksiyon tamamlandıktan sonra, görünümünde hücreler (genellikle% 5-30) toplam sayısı flüoresan hücrelerin sayısını karşılaştırarak transfeksiyon etkinliğini incelemek için bir ters flüoresan mikroskop kullanılır. <ol><li> 462 nm&#39;de (mTFP1) ya da 525 nm&#39;de (venus) ve 492 nm&#39;de (mTFP1) ya da 525 nm&#39;de (venüs) yakınında bulunan bir emisyon filtresi yakın bir uyarım frekansı ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak. NOT: Alternatif olarak, GFP filtre setleri mTFP1 bir arada yakalamak ve ettik edeceknus emisyon transfeksiyon verimliliği teyidini sağlayacak ve. </li></ol></li><li> Transfeksiyon sonrası 48 saat içinde resmi canlı hücreleri. <ol><li> Seçenek olarak ise, 48 saat 8 sonra, PBS içinde 5 dakika, deposu için, ve görünümü (kalsiyum ve magnezyumlu PBS içinde)% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit. NOT: 48 saat ötesinde, sinyal kalitesi ve gücü azalır. Hücrelerin Tespit 8 ifade edilen FRET dahil olmak üzere durumunu korur; orta montaj FRET 14 etkileyebilir olarak, ancak, hücrelerin sadece PBS içinde görüntülü olmalıdır. ekspresyonunda bir değişiklik olabilir gibi sabit hücreleri yalnızca, diğer sabit hücrelere kıyasla olabilir. Dikkat: Paraformaldehyde toksiktir. uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin. </li></ol></li></ol> Spektral unmixing için mTFP1 ve Venüs floroforların 4. Yakalama Spektral parmak izleri <ol><li> Bir hücre kültürü kaputu, görüntüleme Mediu ile hücre orta yerine% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş m (HEPES-tamponlu). </li><li> sıcaklık-kontrollü bir (37 ° C), konfokal mikroskop aşamasında görüntüleme yemekler yerleştirin. </li><li> 1.4 olan bir sayısal açıklık ile 60X büyütmede yağ objektiv mTFP1-transfekte edilmiş hücreler ile cam görüntüleme tabağına yerleştirin. NOT: Yağ yakından cam zeminin kırılma indeksi benzemeye 60X objektif bir lazer tarama mikroskobu kullanılmaktadır. Yağ objektif lens üstüne yerleştirilir ve cam kapak ile doğrudan temas edilir. </li><li> mTFP1 bir 458 mm uyarım kaynağı ve 500 nm de bir emisyon bant-geçiş filtresi ile eksprese eden hücrelerin bulun. </li><li> Görüş alanında bir flüoresan hücre ile, (burada kullanılan yazılım &quot;Lambda modu&quot;) spektral algılama modu seçmek ve spektral görüntü (Şekil 3-1) yakalamak; 10 mil artışlarım (Şekil 3-3) kullanılarak 458 nm ötesinde tüm frekansları içerir. Parlak fluoresc seçinHücre (20 piksel uzaklık) üzerinde ent bölgesi (ROI). Not: mTFP1 eksprese ROI spektral şekil hücresi boyunca nispeten sabit kalmalıdır. şekil büyük ölçüde farklı ise, lazer yeniden ayarlayın ve sinyal-gürültü oranını geliştirmek için ayarları kazanır. </li><li> tıklayarak spektral veritabanına, floresan ROI ortalama normalize yoğunluğunu Ekle &quot;veritabanına spektrum kaydedin.&quot; </li><li> lazer gücü optimize edin ve iyi bir sinyal-gürültü oranı elde edilecek şekilde kazanırlar. Ayarlar farklı ekipman için değişecektir. Arka plan referans olarak floresan olmayan, transfekte edilmemiş hücreler kullanılarak, fakat detektörü (doyma noktasına) dinamik aralığının dışında, hücrelerin parlak olana kadar kazanç ve gücünü artırmak. Arka plan hücre ortalaması sonra saptanabilir flüoresans olmamalıdır. </li><li> aşağıdaki istisnalarla Venus-transfekte hücreler için tekrarlayın: <ol><li> uyarı frekansı 515 nm&#39;de olduğundan emin olun ve bant geçiş filtresi ce olduğuvenus-ifade eden hücreleri tespit ederken 530 nm&#39;ye yakın ntered. </li><li> Olarak &quot;Spektral Mod&quot; 515 nm yerine 458 nm&#39;lik bir eksitasyon frekans kullanımı. </li></ol></li></ol> 5. Yakalama Karışmamış Görüntüler <ol><li> için yakalama modunu değiştirin &quot;Spektral unmixing.&quot; </li><li> Karışmama kanallarına (Şekil 3, Ok-2) venus ve mTFP1 spektral parmak izi ekle. </li><li> geri 458 nm argon kaynağına uyarım lazer ayarlayın. </li><li> 60X petrol amacı yukarıda Nesprin-TS inceleyen tabağına yerleştirin. </li><li> yeteri kadar parlak ifadesi ile bir floresan hücre odaklanan sonra, sinyal-gürültü oranını optimize etmekte kazanç ve lazer gücü ayarlar. NOT: Nesprin-TS FRET verimliliği% 20 yakın olduğu için, karışmamış Venus görüntü karıştırılmamış mTFP1 resimden daha büyük ölçüde sönük olmalıdır. Kabul edilebilir bir güç ve kazanç ayarı iteratif belirlendikten sonra, bu parametreler tüm resimler capt için sabit kalmalıdıredilsin. </li><li> (Tüm doymuş piksel görüntü işleme sırasında çıkartılmıştır) nispeten benzer parlaklık Nesprin-TH hücrelerinin 15-20 görüntülerin en az çekme ve aşırı piksel doygunluk kaçının. </li><li> özdeş görüntüleme parametreleri kullanılarak Nesprin-HL hücreleri ile görüntü yakalama işlemi tekrarlayın. </li></ol> 6. Görüntü İşleme ve Oran Görüntü Analizi <ol><li> Kullanılması açık kaynak ImageJ (FİJİ) yazılımı (http://fiji.sc/), BioFormats Reader kullanılarak açık yerel biçim görüntüler. </li><li> Ön-işlem ve görüntüler ve daha önce tespit edilmiş protokollerin 15 kullanılarak oranı görüntü hesaplamak. </li></ol>

<ol><li>Conway, D. E., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+cellular+mechanotransduction+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis.</a> J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).</li>
<li>Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin-2G%2C+a+Component+of+the+Nuclear+LINC+Complex%2C+Is+Subject+to+Myosin-Dependent+Tension%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension.</a> Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).</li>
<li>Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li>
<li>Austen, K., Ringer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+rigidity+sensing+by+talin+isoform-specific+mechanical+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages.</a> Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).</li>
<li>Meng, F., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dynamic+cytoplasmic+forces+with+a+compliance-matched+FRET+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor.</a> J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).</li>
<li>Borghi, N., Sorokina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+is+under+constitutive+actomyosin-generated+tension+that+is+increased+at+cell-cell+contacts+upon+externally+applied+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).</li>
<li>Cai, D., Chen, S. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Feedback+through+E-Cadherin+Promotes+Direction+Sensing+during+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration.</a> Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).</li>
<li>Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+Shear+Stress+on+Endothelial+Cells+Modulates+Mechanical+Tension+across+VE-Cadherin+and+PECAM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Bio+CB%22%5BJournal%5D)">Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1.</a> Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).</li>
<li>Brenner, M. D., Zhou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spider+Silk+Peptide+Is+a+Compact%2C+Linear+Nanospring+Ideal+for+Intracellular+Tension+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing.</a> Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).</li>
<li>Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282499670_Controlling_Cell_Geometry_Affects_the_Spatial_Distribution_of_Load_Across_Vinculin">Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).</li>
<li>Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+molecular+interactions+of+linker+of+nucleoskeleton+and+cytoskeleton+%28LINC%29+complex+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins.</a> J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> J Vis Exp. (6), e247(2007).</li>
<li>Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+mounting+and+sealing+with+nail+polish+of+cell+specimens+lead+to+incorrect+FRET+measurements+using+acceptor+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching.</a> Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).</li>
<li>Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+activity+in+live+embryos+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).</li>
<li>Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+and+deformation+of+the+nucleus+in+micropipette+aspiration+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment.</a> J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).</li>
<li>Wang, N., Naruse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).</li>
<li>Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+stabilize+the+position+of+intranuclear+DNA+through+mechanical+connection+with+the+nucleus+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells.</a> FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).</li>
<li>Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+arrays+of+nuclear+envelope+proteins+harness+retrograde+actin+flow+for+nuclear+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement.</a> Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).</li>
<li>Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spectral+FRET+imaging+microscopy+for+monitoring+nuclear+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions.</a> J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction%2C+imaging%2C+and+analysis+of+FRET-based+tension+sensors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells.</a> Methods Cell Biol. , (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bir yöntem ve Nesprin-2G, nükleer LINC kompleksi içinde bir protein karşısında mekanik gerilimin canlı hücre görüntüleme gösteri, yukarıda özetlenen edildi. Bundan önce işe, örneğin mikropipet aspirasyon sitometrisi manyetik boncuk ve mikroskopik lazer ablasyon gibi çeşitli teknikler, hücre çekirdeği üzerindeki yükü uygulamak ve dökme malzeme özellikleri 16, 17, 18 ölçmek için kullanılmıştır. Ancak, bizim son çalış...

Kuvvet-duyarlı, genetik olarak kodlanmış FRET sensörler, yakın, canlı hücrelerde çekme bazlı kuvvetleri olarak proteinler, 1, 2, 3, 4 arasında nasıl uygulandığı mekanik kuvvetlerin fikir sağlamak için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu araçları ile, araştırmacılar geleneksel floresan mikroskop kullanılarak canlı hücreler içinde, non-invaziv görüntü hücre içi kuvvetler can. Bu sensörler bir elastik peptid 3 ile ayrılmış bir FRET çiftinin (donör ve akseptör floresan proteinleri, en çok mavi bir verici ve sarı akseptör) oluşur. C- veya N-terminal etiketleme aksine, bu sensor, bir molekül gerilme göstergesi gibi davranmak, protein üzerinden iletilen mekanik kuvvetini ölçmek için bir proteinin bir iç alanı içine eklenir. FRET p arasında artan bir mesafe sensörü sonuçları arasında mekanik gerilim artışıhava, azalmış FRET 3 elde edilir. Bunun bir sonucu olarak, FRET ters gerilme kuvveti ile ilgilidir. Bu flüoresan bazlı sensörler fokal yapışma proteinleri (vinkülin 3 ve talin 4), sitoskeletal proteinler (α-aktinin 5), ve hücre-hücre birleşme proteinleri için geliştirilmiştir (E-kadherin 6, 7, VE-cadherin 8 ve PECAM 8). Bu biyoalgılayıcılarda da en sık kullanılan ve iyi karakterize edilmiş esnek bağlayıcı TSmod olarak bilinir ve örümcek ipeği proteini flagelliform türetilmiş 40 amino asitlik (GPGGA) 8, bir tekrarlanan dizinin oluşur. TSmod çekme kuvveti 3 5 pN için 1 FRET yanıtı, bir doğrusal elastik nano yay olarak hareket ettiği gösterilmiştir. flagelliform farklı uzunlukları dinamik r değiştirmek için kullanılabilirTSmod FRET kuvvet duyarlılık 9 ange. Flagelliform ek olarak, spektrin (HP-35 olarak da bilinir) 5 ve villin başlık peptid 4 içindeki kuvvet biyosensörler 4 FRET çifti arasındaki elastik peptidler olarak kullanılmıştır tekrarlar. Son olarak, son bir yay TSmod da sıkıştırma kuvvetlerini 10 algılamak için kullanılabileceğini gösterdi. Son zamanlarda TSmod endojen benzer şekilde davranır mini Nesprin2G (Şekil 2C), olarak bilinen, daha önce geliştirilmiş kesik Nesprin2G protein içine sokulur kullanılarak Nucleo-hücre iskeletinin (LINC) kompleks protein Nesprin2G bağlayıcısına için bir güç sensörü gelişmiş Nesprin-2G 11. LINC kompleksi, nükleer lamina sitoplazmik hücre iskeleti bağlama, çekirdeğin içine dışarıdan yol açan birçok proteinler içerir. Nesprin-2G yapısal bir protein bağlanma her ikisitoplazmada ve çekirdek çevresi alanı GÜNEŞ proteinlerine aktin hücre iskeletinin. Bizim biyosensör kullanarak, Nesprin-2G NIH3T3 fibroblastların 2&#39;de actomyosin bağımlı gerilim tabi olduğunu göstermek başardık. Bu, o kuvvet direkt olarak nükleer LINC kompleksi içinde bir protein karşısında ölçüldü ilk kez oldu ve mechanobiology içinde çekirdeği üzerinde gücünün rolünü anlamak için önemli bir araç haline muhtemeldir. Aşağıdaki protokol, Nesprin- ifade eden hücrelerin FRET görüntülerin memeli hücrelerinde Nesprin gerilim sensörü (Nesprin-TS) ifadesi, hem de toplama ve analizi de dahil olmak, Nesprin-2G güç sensörü nasıl kullanılacağını detaylı bir yöntem sağlar TS. bir spektral detektörü ile donatılmış bir ters konfokal mikroskop kullanılarak, duyarlı emisyon ölçmek için nasıl bir açıklama spektral Karışmama kullanılarak FRET ve rasyometrik FRET görüntüleme sağlanır. çıkış oran ölçer görüntüleri göreceli nereye yapmak için kullanılabilirntitative kuvvet karşılaştırmaları. Bu protokol, fibroblastlarda Nesprin-TS ekspresyonu odaklanmış olsa da, bu hücre hatları ve primer hücreler de dahil olmak diğer memeli hücreleri, kolayca adapte edilebilir. Bundan başka, bu görüntü elde etme ve FRET analizi ile ilgili olarak, bu protokol, hali hazırda diğer proteinler için geliştirilmiştir, diğer FRET&#39;e dayalı bir kuvvet biyosensör için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Nesprin-TS DNA</td><td>Addgene</td><td>68127</td><td>https://www.addgene.org/68127/</td></tr> <tr><td>Nesprin-HL DNA</td><td>Addgene</td><td>68128'den</td><td>Al https://www.addgene.org/68128/</td></tr> <tr><td>mTFP1 DNA'dan</td> Al <td>Addgene</td><td>54613</td> https://www.addgene.org/54613/ <td></td></tr><tr><td>mVenüs DNA'sından</td> Al <td>Addgene</td><td>27793</td><td>https://www.addgene.org/27793/'den Al</td></tr><tr><td>TSmod DNA</td><td>Addgene</td><td>26021</td><td>https://www.addgene.org/26021/</td></tr> <tr><td>Yetkili Hücrelerden Alın</td><td>Bioline</td><td>BIO-85026</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı LB Ortamı</td><td>ThermoFisher</td><td>10855001</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001</td></tr><tr><td>Katı LB Bakteri Kültürü Plakaları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Biorad</td><td>273 BR 07335</td><td>SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>kuvars küvet</td><td>Biorad</td><td>1702504</td><td>SmartSpec Plus</td></tr><tr><td>için küvet DNA izolasyon kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740412.5</td><td>NucleoBond Xtra Midi Plus</td></tr><tr><td>6 oyuklu hücre kültürü kabı</td><td>Falcon-Corning 353046</td><td></td><td>Multiwell 6 kuyulu polistren kültür kabı</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı, (DMEM) hücre ortamı</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM(1x)</td></tr><tr><td>Sığır Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16170-078</td><td></td></tr><tr><td>azaltılmış serum hücre ortamı</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>İndirgenmiş Serum Ortamı, "optimem"</td></tr> <tr><td>Lipid Taşıyıcı Çözelti</td><td>invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipid Reaktifi, "Lipofectamine 2000"</td></tr><tr><td>1.5 mL steril plastik tüp</td><td>Denville</td><td>c2170</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>%0.25 Tripsin-EDTA (1x)</td></tr> <tr><td>cam tabanlı mikroskop görüntüleme kabı</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>35 mm 20 mm Alt Kuyulu Tabak #1.5 cam</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>ThermoFisher</td><td>33016015</td><td>fibronektin insan proteini, plazma</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin</td></tr><tr><td>15 mL steril santrifüj tüpü</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>sallanan rotor santrifüjü&nbsp;</td><td>Termo elektron</td><td>Centra CL2</td><td>Sallanan rotor termo elektron 236</td></tr><tr><td>hücre kültürü biyogüvenlik başlığı</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td></td></tr><tr><td>iklim kontrollü hücre kültürü inkübatörü</td><td>ThermoFisher</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>ters LED geniş alan floresan mikroskobu</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Clear HEPES tamponlu görüntüleme ortamı</td><td>Moleküler Problar</td><td></td><td></td>A14291DJ</tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu Yaşam</td><td>teknolojileri</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Sıcaklık Kontrollü-Ters konfokal w/458 ve 515 nm lazer kaynakları&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>&nbsp; LSM 710-w / spektral META dedektörü</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme Ortamı</td><td>Newengland Biolabs</td><td>B9020s</td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3 Fibroblastlar</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr></tbody></table>

förster rezonans enerji transferi (fret) -force biyosensörlerin kullanılması için protokol nükleer linc kompleksi karşısında mekanik kuvvetleri Ölçmek için

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

LINC kompleksinin, mekanik kuvvetlerin hücre iskeletinden çekirdeğe transferine aracılık eden kritik yapı olduğu varsayılmıştır. Nesprin-2G, aktin hücre iskeletini perinükleer boşluktaki zar proteinlerine (SUN alanı proteinleri) bağlayan LINC kompleksinin önemli bir bileşenidir. Bu zar proteinleri, çekirdeğin içindeki laminlere bağlanır. Son zamanlarda, bir Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) kuvvet probu mini-Nesprin-2G'ye (Nesprin-TS (gerilim sensörü)) klonlandı ve canlı NIH3T3 fibroblastlarında Nesprin-2G boyunca gerilimi ölçmek için kullanıldı. Bu makale, NIH3T3 fibroblastlarındaki LINC kompleks kuvvetlerini ölçmek için Nesprin-TS'yi kullanma sürecini açıklamaktadır. Nesprin-TS'den FRET bilgilerini çıkarmak için, ham spektral görüntülerin alıcı ve verici floresan kanallarına spektral olarak nasıl karıştırılacağına dair bir taslak da sunulmaktadır. Açık kaynaklı yazılım (ImageJ) kullanılarak, görüntüler önceden işlenir ve oransal görüntülere dönüştürülür. Son olarak, Nesprin-TS'nin FRET verileri, farklı deney grupları arasında verilerin nasıl karşılaştırılacağına ilişkin stratejilerle birlikte sunulmaktadır.

Yukarıdaki protokole ardından DNA plazmidi DNA deposundan alınan edildi ve E. coli hücrelerine transforme edildi. Sensör DNA ifade eden E. coli LB / Amfisilin plakaları seçilir ve bir sıvı LB suyu içinde amplifiye edildi. Vektörlerin amplifikasyonu takiben, DNA plazmidleri standart, ticari olarak temin edilebilir DNA izolasyon kiti kullanılarak Tris-EDTA tampon maddesi içinde saflaştırılmıştır. Bir spektrofotometre kullanılarak, saflaştırılmış DNA ug / mL (Şekil...

Son zamanlarda, hücre içi kuvvetin proteine özgü çözünürlüğünü sağlayan bir dizi FRET tabanlı kuvvet biyosensörü geliştirilmiştir. Bu protokolde, nükleoskeleton-hücre iskeleti (LINC) kompleksi proteini Nesprin-2G'nin bağlayıcısı için tasarlanan bu sensörlerden birinin, nükleer LINC kompleksi üzerindeki aktomiyosin kuvvetlerini ölçmek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Bu prosedürün genel amacı, LINC kompleks proteini nesprin-2G için tasarlanmış bir biyosensör aracılığıyla canlı hücrelerde FRET mikroskobu yoluyla nükleoskeleton hücre iskeletinin veya LINC kompleksinin bağlayıcısı üzerindeki kuvvetleri belirlemektir. Bu yöntem, canlı hücrelerin çekirdeğindeki proteinlere uygulanan kuvvetler ve bu kuvvetlerin değişken koşullar altında nasıl değiştiği gibi mekanotransdüksiyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, proteinler ve canlı hücreler üzerindeki çok küçük kuvvet seviyelerini ölçme yeteneğidir.Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler görüntü yakalamakta zorlanacaktır. Tüm deney grupları arasında iyi bir sinyal almak için mikroskop lazer gücünü ve kazancını optimize etmek zordur. Başlamak için, NIH 3T3 fiber blast hücrelerini, sıcaklık ve CO2 regülasyonuna sahip standart bir hücre kültürü inkübatöründe altı oyuklu bir hücre kültürü kabında %70 ila %90 arasında birleşecek şekilde büyütün.Bir hücre kültürü davlumbazında, ortamı çıkarın ve her bir kuyuyu yaklaşık 1 mililitre indirgenmiş serum hücresi ortamı ile durulayın. Her oyuğa 800 mikrolitre indirgenmiş serum hücresi ortamı ekleyin ve altı

a-protocol-for-using-frster-resonance-energy-transfer-fret-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Selülozomlar, selülozu sindirmek için tasarlanmış multienzim kompleksleridir. AFM tabanlı SMFS, selülozomla ilişkili protein düzeneklerinin mekanik özelliklerini ve katlanma konfigürasyonunu incelemek için kullanıldı. Selülozom montajında yer alan bireysel reseptör-ligand komplekslerinin etkileşimlerini incelemek için protein immobilizasyonu, veri toplama ve veri analizi için eksiksiz bir iş akışı sunuyoruz.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Tek bir T lenfositinde kuvvet regülasyonlu tek reseptör-ligand bağlanma kinetiğini ve kalsiyum sinyalinin gerçek zamanlı görüntülemesini aynı anda ölçmek için bir teknik açıklıyoruz.

Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal

Bu protokol için doğrudan bir yaşam Hücre çekirdeğinde kontrollü bir kuvvet uygulamak için micropipette yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil sorgulama yaşayan, yapisan hücredeki nükleer mekanik özellikleri sağlar.

Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Burada, prosesif miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sunulmaktadır ve bu, diğer proses motor sınıflarının çalışmasına kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlama, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları detaylandırır.

İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu

Çalışma, etiketleme alanlarının seçimi, boya seçimi, elde etme ve veri analizi dahil olmak üzere FRET haritalama metodolojisini detaylandırmaktadır. Bu metodoloji, protein sistemlerinde bağlanma bölgelerini, konformasyonel değişiklikleri ve dinamik hareketleri belirlemede etkilidir ve mevcut 3-B yapısal bilgilerle birlikte gerçekleştirilirse en yararlı olanıdır.

Förster Rezonans Enerji Transfer Haritalaması: Küresel Yapısal Özellikleri Aydınlatmak İçin Yeni Bir Metodoloji

Topluluk kuvvet spektroskopisi (EFS), biyofiziksel ve biyosensing alanlarında bir grup biyomoleküler yapının mekanik olarak açılması ve gerçek zamanlı olarak algılanması için sağlam bir tekniktir.

Kesme Kuvvetleri ile Topluluk Kuvveti Spektroskopisi

Biyosensörler karmaşık, biyolojik ortamlar ile arayüz ve yüzey modifikasyonu ile sensör takılı derece spesifik problar ile çok hassas sensörler birleştirerek hedeflenen algılaması gerçekleştirmek. Burada, sensör ve biyolojik çevre köprü silan ajanlar kullanılarak biotin ile silika optik sensör yüzeyi fonksiyonlandırmalar göstermektedir.

Silan Kaplin Ajanlar kullanarak Silika Optik Biyosensörler için Biyolojik Probları takılması

Öğrenin, canlı hücrelerde FRET tabanlı biyosensör kullanarak nükleer LINC kompleksi üzerindeki mekanik kuvvetleri nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem, mekanotransdüksiyon süreçlerini anlamak için NIH 3T3 fibroblast hücrelerinde uygulanır.

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için (Video) | JoVE Journal

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) -force biyosensörlerin kullanılması için Protokol Nükleer LINC Kompleksi karşısında Mekanik Kuvvetleri Ölçmek için

Daha fazla video keşfet