ACT-PRESTO: Biyolojik Doku Takas ve Hacim Görüntüleme için ile immün Yöntemleri

Bu prosedürün genel amacı, temizlenmiş, sağlam dokuyu elde etmek ve immünoetiketleme yöntemlerini kullanarak üç boyutlu moleküler bilgisini görselleştirmektir. Bu yöntem, nöronal bağlantılar, moleküler sınıflandırma ve gelişim sırasında yapısal değişim gibi nörobilim ve gelişim biyolojisi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, dokunun, büyük örneklerin kesitlere ayrılmadan hücre altı düzeyde analizini açıkça mümkün kılmasıdır.

Bu işleme başlamak için, sabit organları A4P0 Hidrojel monomer çözeltisi içinde dört santigrat derecede 12 ila 24 saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Bundan sonra, 10 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir tüpe beş mililitre Hidrojel monomer çözeltisi ekleyin. Daha sonra, fare beyin örneğini ona aktarın ve tüpün üstünü Parafilm ile sarın.

Daha sonra, bir dakika boyunca Hidrojel infüzyonlu beyin örneği ile sıvının içinden nitrojen sıkın. Numune içeren tüpü hızlı ve sıkı bir şekilde kapatın. Tüpü iki saat boyunca bir su banyosuna aktarın.

Bundan sonra, Hidrojelin viskozitesini kontrol edin ve ardından fazla Hidrojeli çıkarmak için polimerize numuneyi 0.1 X PBS ile kısa bir süre yıkayın. Bu adımda, polimerize numuneyi bir doku kabına aktarın. Ve doku kabını ETC odasına yerleştirin.

Ardından, peristaltik bir pompa kullanarak ETC haznesini ETC tamponu ile doldurun. ETC koşullarını ayarlayın ve açın. Bir ila iki milimetre kalınlığındaki beyin dilimleri iki saat içinde temizlenir.

Ve bütün bir beyin beş ila altı saat içinde yeterince temizlenir. Daha sonra, numuneyi 45 mililitre 0.1 X PBS ile 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. SDS'nin tamamen çıkarılmasını doğrulamak için tüp kısa bir süre çalkalandığında kabarcık görülmeyene kadar numuneyi 0.1 X PBS ile birkaç kez yıkayın.

C-PRESTO gerçekleştirmek için küçük bir numuneyi 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Kollajen tip dört antikor için bir ila 500 seyreltme faktörü ile 500 mikrolitre antikor seyreltme çözeltisi ekleyin ve tüpü iki saat boyunca 600 kez g'de santrifüjleyin. Bundan sonra, lekeli numuneyi 30 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüjleme ile 0.1 X PBS ile yıkayın.

Daha sonra, Cy3 konjuge Anti Tavşan ikincil antikoru için bir ila 500 seyreltme faktörü ile 500 mikrolitre antikor seyreltme çözeltisi ekleyin ve iki saat boyunca 600 kez g santrifüjleyin. Daha sonra, lekeli numuneyi 30 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüjleme ile 0.1 X PBS ile yıkayın. Daha büyük doku için s-PRESTO gerçekleştirmek için, numuneyi kapalı valf konumunda üç valfe bağlı bir şırıngaya aktarın.

Kollajen tip dört antikor için bir ila 500 seyreltme faktörü ile beş ila yedi mililitre antikor seyreltme çözeltisi ekleyin. Daha sonra, valfi açarak antikor çözeltisini numuneye ekleyin. Ardından, açık valf konumunda, infüzyon geri çekilme hareketi için yeterli alan sağlamak için şırınga pistonunu 17 mililitre konumuna ayarlayın.

Ardından, şırınga ayarı bittikten sonra üç vanayı kapatın. Numuneyi içeren şırıngayı bir şırınga pompasına yerleştirin. Şırınga pompası koşullarını dakikada on mililitrelik bir infüzyon çekme hacmine ve sürekli döngü modunda dört dakikalık bir duraklama süresine ayarlayın.

Daha sonra, şırınga pompasını oda sıcaklığında üç ila 24 saat çalıştırın. Daha sonra, üç vanayı açın ve çözeltiyi 0.1 X PBS ile değiştirin. Lekeli numuneyi şırınga pompasını kullanarak her seferinde bir saat boyunca 0.1 X PBS ile iki kez yıkayın.

Daha sonra, PBS'yi Cy3 konjuge Anti Tavşan ikincil antikoru içeren antikor seyreltme çözeltisi ile değiştirin ve şırınga pompasını üç ila 24 saat çalıştırın. Bunu takiben, üç vanayı açın ve çözeltiyi 0,1 X PBS ile değiştirin. Görüntülemeden önce, lekeli numuneyi uygun miktarda kübik montaj çözeltisi içinde oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin.

Bir saat sonra, çözeltiyi taze kübik montaj çözeltisi ile değiştirin ve bir saat daha inkübe edin. Antikorlar difüzyon yoluyla yoğun dokulara nüfuz edemediğinden, PRESTO immünoetiketleme yöntemleri, makromolekülleri aktif olarak infüze etmek ve reaktifleri yoğun dokulara iletmek için tasarlanmıştır. Standart bir masa üstü santrifüj kullanılarak merkezkaç kuvvetlerinin uygulanması, antikorların verilmesini önemli ölçüde kolaylaştırdı.

Bir şırınga pompası ile konveksiyon akışı uygulamak da antikor penetrasyonunu iyileştirdi. s-PRESTO için, antikorları iletmek için bir şırınga pompası kullanıldı. Böbrekler ve karaciğer gibi fare organları kollajen tip 4 ile etiketlendi.

Konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırıldığında, üç saatlik c veya s-PRESTO etiketleme derinliğini önemli ölçüde artırır. Böbrek ve karaciğerde, z ekseninin derinliği PRESTO örneklerinde 300 ila 350 mikrometre veya daha derine ulaşırken, kontrol örnekleri sadece 40 ila 50 mikrometre derinlikte etiketlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknikler düzgün bir şekilde yapılırsa doku için net bir şekilde bir günde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, doku fiksasyon zamanını Hidrojel monomer emülsiyonu ve elektroforetik doku net bir şekilde tutmayı unutmamak önemlidir. Prosedürü takiben, hücresel dinamiklerin analizi ve birden fazla organda bir nöronal soketin tanımlanması gibi ek soruları yanıtlamak için immünoetiketleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra bu teknik, tıp bilimi alanındaki araştırmacıların hastalık teşhisini keşfetmelerinin önünü açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, Hidrojel gömme ve doku polimerizasyonunun nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız. Hidrojel monomer çözeltisi ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman önlem alınması gerektiğini unutmayın.