Doğrusal Invadozom Oluşumu ve Aktivitesi Çalışmak İçin 2D ve 3D Matrisler

Grubumuz hücre ve hücre dışı matriks arasındaki etkileşim üzerinde çalışmaktadır. Hücreler üretebilir ancak aynı zamanda hücre dışı matris elementini de bozabilir. Matrisin bozulması fizyolojik sırasında ortaya çıkabilir, aynı zamanda nörodejenez ve hücre tümörünün istilası gibi patolojik süreçlerde de ortaya çıkabilir.

Hücresel düzeyde, matrisin bozunmasında rol oynayan aktin bazlı yapının varlığını fark edebiliriz. Ve bu yapılara invadosom adı verilir. İnvadozom, normal hücrelerdeki podozomları ve kanser hücrelerindeki invadopodia'yı içeren genel bir terimdir.

Bu istilanın bozulması farklı şekillerde, noktalarda, agregalarda ve rozetlerde kendi kendine organize edilebilir. Ve bu istiladomusun aktivitesi, MMP2 ve MT1-MMP gibi metaloproteinazlar tarafından yönlendirilir. Bu, MMP2, MT1-MMP çiftinin tip 1 kollajen fibrilleri tarafından aktive edildiği uzun bir süre için değildir.

İnvadozomların aktivitesini incelemek için klasik bir zimografi in-situ testi kullanıldı. Ancak tip 1 kollajen fibrillerinin invazozomlardaki rolünü ve etkisini incelemek için yeni bir test oluşturmaya karar verdik. Bunu yapmak için jelatin ve tip 1 kollajen fibrillerinden oluşan karışık bir matris oluşturduk.

Bu filmin ilk bölümünde, Eloide Henriet size bu tür bir matrisi nasıl oluşturduğumuzu gösterecek. İkinci bölümde, Zakaria Ezzoukhry size tip 1 kollajen fibrillerinin invazozomların morfolojisi, oluşumu ve aktivasyonundaki etkisini nasıl ölçebileceğimizi gösterecek. Ve son bölümde, Julie Di Marino size bir 3D kollajen istilası testini nasıl uyarladığımızı gösterecek.

Size jelatin ve tip 1 kollajen fibrillerinden oluşan karışık bir matrisin nasıl hazırlanacağını göstereceğim. İki tür karışık matris yapacağım. Floresein jelatin ve floresein olmayan tip 1 kollajen ile yerinde zymografi tahlili yapmak için biri.

Ve bir diğeri, floresein olmayan jelatin ve etiketli kollajen fibrilleri ile kollajen fibrillerini görselleştirmemize izin veriyor. Jelatin matrisini hazırlamak için, bir parça parafilm üzerine 20 mikrolitre jelatin damlacıkları ekleyin. Her damlacığı otoklavlanmış bir cam lamel ile örtün.

Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin ve ışıktan koruyun. Jelatin fiksasyonu için, PBS'de 40 mikrolitrelik %0.5 glutaraldehit damlacıkları. Forseps kullanarak, jelatin kaplı lamelleri her bir glutaraldehit damlacığına aktarın.

Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin ve ışıktan koruyun. Çok kuyulu bir hücre kültürü plakası alın ve her bir kuyucuğu 500 mikrolitre steril 1X PBS ile doldurun. Kuluçka süresinin sonunda, her bir lamel jelatin tarafı yukarı bakacak şekilde her bir oyuğa yerleştirin.

Lamelleri 1X PBS'de her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Bu adımda, lameller deney için kullanılabilir veya daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. Bir tüpe ml başına 0.4 mg kollajen pipetleyin.

Floresan boyayı, ml başına 10 mikrogramlık bir son konsantrasyon için ekleyin. Çözeltiyi tüpte karıştırın ve ışıktan korunan oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. 1x DPBS ile son hacme kadar seyreltin ve çok kuyulu bir plakada jelatin kaplı lamellerin üzerine 500 mikrolitre çözelti ekleyin.

Kollajen polimerizasyonu için 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra fazla kollajeni çıkarın. 500 mikrolitrelik son hacim için hücreler ekleyin ve fiksasyondan önce hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bu tip matrisler, fibronektin, vitronektin veya tip IV kollajen gibi diğer matris elemanları ile modifiye edilebilir. Benim açımdan, size bir invazozom belirteci olan Tks5'i kullanarak immünofloresansın nasıl gerçekleştirileceğini ve kollajen tip 1 kaplı lameller üzerinde doğrusal invadozomların nasıl ölçüleceğini göstereceğim. Sonuçları doğrusal istiladozomlarda bulunan hücre sayısına göre sunabiliriz, ancak aynı zamanda her hücredeki yapı sayısını da sunabiliriz.

Lamelleri PBS'de 500 mikrolitre% 4 paraformaldehit içinde 10 dakika boyunca sabitleyin. 1x PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 1x PBS'de% 0.2 Triton X-100 ile 10 dakika boyunca geçirgen hale getirin. Bir parça parafilm üzerinde 1x PBS'de% 4 BSA'da 50 mikrolitrelik primer antikor çözeltisi damlacıkları.

Her lamel bir damlacık üzerine yerleştirin. Işıktan korunarak oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin. Lamelleri 1x PBS ile iki kez yıkayın ve lamelleri ikincil antikor, kolloidin ve Hoechst boyasında ışıktan koruyarak 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, 1x PBS ile iki kez yıkayın, ardından tuzları çıkarmak için damıtılmış su ile yıkayın. Lamelleri polimerize montaj ortamı ile bir cam slayt üzerine monte edin. Görüntülemeden önce slaytın gece boyunca oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.

Görüntü analizi için, konfokal bir mikroskop kullanarak sırayla aktin ve Tks5'in bir görüntüsünü elde edin. Hücre başına doğrusal istiladozomların boyutunu ve sayısını ölçmek için ImageJ yazılımını ve sağlanan makroyu kullanın. Önce makroyu ImageJ'de çalıştırın ve aktin görüntüsünü açın.

Daha sonra Tks5 imajını açın. Eşiği ayarlayın ve makroyu uygulayın. Analiz edilen sonuçlar iki tabloda görünecektir.

Hücre başına doğrusal invadozom sayısı ve hücredeki doğrusal invazozomlar tarafından kullanılan yüzde alanı gibi diğer bilgiler özet tabloda yer alacaktır. Her doğrusal istiladomusun boyutu sonuç tablosunda olacaktır. Görüntülerin nicelleştirilmesinden sonra, hücre başına düşen yapı sayısını göstererek sonuçları sunabiliriz.

Bu yüzden benim açımdan, 3D olarak doğrusal istiladozomların varlığını göstermek için bir yöntem uyarlıyoruz. Jelin sadece kollajen bir fibrilden oluştuğunu fark ettik ve bu test, kollajen bir bağlamda hücre istilasını değerlendirmek için kullanıldı. Buz üzerinde ml başına iki mg'lık bir nihai konsantrasyonda tip 1 kollajen çözeltisi hazırlayın.

Floresan boyayı mililitre başına bir mikrogramlık son konsantrasyonda ekleyin. Çözeltiyi karıştırın ve ışıktan koruyarak beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra 50 mikrolitre buz gibi 10x PBS ekleyin.

Sonra 6.25 mikrolitre buz gibi bir molar sodyum hidroksit ekleyin. Doğru konsantrasyonu elde etmek için steril su ekleyin ve çözeltiyi karıştırın. Boyden hazne eklerini çok kuyulu bir hücre kültürü kabına yerleştirin.

Her bir parçaya 100 mikrolitre kollajen bir çözelti ekleyin. Kollajen jelini polimerize etmek için, tabağı 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Her bir oyuğa serumla zenginleştirilmiş hücre kültürü ortamı ekleyin ve ekleri ortama yerleştirin.

Kollajen jelinin üzerine serum içermeyen ortamda 30.000 hücre tohumlayın. Hücreleri sabitlemek için boş bir kuyucuğa% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin. Kollajen jeline dokunmadan hücre ortamını ek parçadan çıkarın.

Eki %4 paraformaldehit çözeltisi ile kuyucuklara yerleştirin ve kollajen jelinin üzerine ilave %4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Fiksasyondan sonra,% 4 paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve 1x PBS ile yıkayın.

Yıkandıktan sonra kollajen jeli şeffaf hale gelmelidir. Artık ekler immünofloresan için hazırdır. İlk önce ekleri boşaltın.

Daha sonra ekleri çok kuyulu plakanın yeni kuyularına yerleştirin. Hücrelere nüfuz etmek için, kollajen jelinin üzerine 30 dakika boyunca 1X PBS'de% 0.2 Triton X-100 çözeltisi ekleyin. Ekleri boşaltın.

1X PBS ile yıkayın ve ışıktan koruyarak bir saat boyunca kollajen jelin üzerine birincil antikor solüsyonu ekleyin. Birincil antikor solüsyonunu çıkarın, 1X PBS ile yıkayın ve kollajen jelini ikincil antikor solüsyonu ile ışıktan korunarak 1.5 saat inkübe edin. İkincil antikor solüsyonunu 1X PBS ile yıkayın.

Kollajen jelini montaja hazırlamak için, ek zarı bir neşter ile kesin. Membrana bağlı kollajen jeli cam tabanlı bir tabağa yerleştirin. Jelin üst kısmının tabağın alt kısmı ile temas halinde olması önemlidir.

Mikroskopi gözlemi için montaj ortamı ve üstüne bir lamel ekleyin. Bu testle, DDR1 reseptörünün kollajen bir jeldeki hücre istilasındaki anahtar rolünü gösterdik. Bu test, ilaçların hücre istilası üzerindeki etkisini değerlendirmek için de kullanılabilir.

Farklı çalışmamızda, fizyolojik onayına sadece yeni bir hücre dışı matris elementi eklemenin, burada tip 1 kollajen fibrillerinin, invadozomların morfolojisini, moleküler bileşimini ve aktivitesini değiştirebileceğini gösterdik. Bu filmde anlatılan farklı tahlilleri kullanarak, lineer istiladozomlar adını verdiğimiz yeni yapıların, yeni bir istila organizasyonunun varlığını gösterdik. Karmaşık ve daha fizyolojik matrisler üreterek, hücre eklenmesi, göçü ve istilası ile ilgili yeni yolların tanımlanmasına izin veriyoruz.