Bir Optimize Protokol Lenfositlerindeki Glikoliz ve Mitokondriyal Solunum Analiz

Bu prosedürün genel amacı, hücre dışı akış analizi kullanarak lenfositlerdeki glikolizi ve mitokondriyal respirasyonu doğru bir şekilde ölçmektir. Bu yöntem, immünmetabolizma alanındaki; bağışık hücrelerde aktivasyon, farklılaşma veya hastalık sırasında ne tür metabolik değişikliklerin meydana geldiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir seferde 90'tan fazla örneğin metabolik profillerinin verimli ve gerçek zamanlı analizine olanak tanımasıdır.

Bu yöntem lenfosit metabolizması hakkında bilgi sağlayabilse de, fonksiyonelliklerine minimum düzeyde müdahale ederek plak eklemesi gerektiren yapışmayan hücreler de dahil olmak üzere diğer hücrelere de uygulanabilir. Genellikle, bu yönteme yeni başlayan kişiler lenfositlerin hassas olması ve fonksiyonellikleri ile canlılıklarını korumak için nazik bir işlem gerektirmeleri nedeniyle zorluk yaşayacaklardır. Deneyden bir gün önce, hücre dışı akış analizörünün sensör kartuşunu kaldırın ve yardımcı plağın her bir kuyucuğunu 200 µL kalibrasyon çözeltisi ile doldurun.

Ardından, kartuşu plaka üzerine indirerek sensörleri kalibrasyon çözeltisine daldırın ve kartuşu, karbondioksit veya azot içermeyen 37 °C'lik bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Ertesi sabah, 96 kuyucuklu bir analiz plakasının her kuyucuğunu 25 µL yapıştırıcı çözelti ile kaplayın ve plakayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda yapıştırıcıyı aspire edin ve her kuyucuğu 200 µL steril su ile iki kez yıkayın.

Plaka havada kururken, 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine 70 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve hasat edilen organları süzgecin üzerine aktarın. Steril bir üç mililitrelik şırınganın pistonunu kullanarak, gerekirse MS tamponu ekleyerek maserasyon işlemi boyunca filtreyi ve organları nemli tutarak dokuyu süzgeçten geçirin. Ardından, süzgeci beş ila 10 mililitre MS tamponu ile durulayın ve ardından elde edilen hücre süspansiyonunu santrifüjleyin.

Çökeltiyi beş mililitre ACK eritrosit liziz tamponu içinde yeniden süspande edin. Buz üzerinde beş dakika bekledikten sonra 10 ila 20 mililitre MS tamponu ile seyrelterek konsantrasyonu düşürün ve hücreleri tekrar santrifüjleyin. Santrifüjlemede sona erdiğinde, 15 mililitrelik konik bir tüpün üzerine 30 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve süzgeci bir mililitre MS tamponu ile ön işlemden geçirin.

Hücreleri beş mililitre taze MS tamponu içinde yeniden süspande edin ve lizlemiş eritrosit agregatlarını uzaklaştırmak için hücre süspansiyonunu süzgeçten geçirin. Boş liz tüpünü durulamak için dört mililitre taze MS tamponu ekleyin ve yıkama sıvısını süzgeçten geçirin. Hücreleri sayın ve hücre dışı akış analizi (extracellular flux assay) için uygun sayıda splenosit alikotlayın.

Ardından her iki hücre setini pelletleyin ve ekstraselüler fluks analizi için splenosit örneğini buz üzerinde beş mililitre RF 10 besiyerinde yeniden süspanse edin. Boncuk izolasyonu için kullanılacak hücreleri, belirtilen inkübasyon süreleri boyunca iki ila sekiz derece Celsius'ta, uygun hacimlerdeki biyotin antikor kokteyli, anti-biyotin mikroboncuklar ve MS tamponu içerisinde yeniden süspanse edin. İkinci inkübasyonun sonunda hücreleri santrifüj ile toplayın ve pelletini 1x10⁸ hücre başına 500 mikrolitre taze MS tamponu içerisinde yeniden süspanse edin.

Ardından, uygun kolonu ayırma mıknatısına yerleştirin ve kolonu üç mililitre MS tamponu ile hazırlayarak akıştan geçen sıvıyı atın. Kolonun altına steril 15 mililitre konik tüp yerleştirin ve tüm hücre örneği hacmini kolona yükleyin. Daha sonra, yıkama sıvısını konik tüpte toplayarak hücre inkübasyon tüpünü üç mililitre taze MS tamponu ile durulayın.

Son elüat toplandıktan sonra, tüpü 15 mililitre MS tamponu ile son hacmine kadar doldurun ve negatif olarak izole edilen hücreleri santrifüjleyin. Ardından, pellet'i buz üzerinde beş mililitre taze RF 10 ortamında yeniden süspande edin. İzolasyondan sonra en geç üç saat içinde tüm hücre örneklerini santrifüjleyin ve pellet'leri, bir başka santrifüj işlemi için beş mililitre uygun analiz ortamında yeniden süspande edin.

İkinci santrifüjlemeden sonra, kuyuk başına 180 mikrolitre hücre içeren nihai bir hacim elde etmek için pelletleri taze assay medyumunda uygun deneysel konsantrasyonda yeniden süspanse edin ve plakanın her bir kuyusuna 180 mikrolitre hücre ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 25 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, hücrelerin kuyuların tabanına güvenli bir şekilde yapışması için plakayı santrifüj edin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin.

30 dakika sonra, taze hazırlanmış 37 derece Celsius sıcaklıktaki ilgili bileşikleri, bir mikropipet kullanarak ekstraselüler fluks analizör sensör kartuşunun uygun enjektör portlarına yükleyin; kontrol arka planı ve deneysel olmayan portları yalnızca besiyeri ile doldurun. Yüklenen kartuşu inkübatöre geri yerleştirin ve ekstraselüler fluks analiz programını kurun. Ardından kartuşu yükleyin ve programı başlatın; kalibrasyon sonrası ekrandaki uyarı geldiğinde kalibrasyon plakasını analiz plakasıyla değiştirin.

Hücre dışı akış analizi tamamlandıktan sonra protein içeriği ölçümlerine geçiniz. Tüm hücre popülasyonlarının %90'ından fazlası canlıdır ve lenfositler için %98 ila %99 saflık gözlemlenmiştir. Her bir hücre tipinin konfluens düzeyi, başlangıç ekim yoğunlukları ile korelasyon göstermektedir.

Lizat protein konsantrasyonları ekim yoğunlukları ile doğrusal olarak korelasyon göstermektedir; bu durum, protein konsantrasyonlarının hücre dışı akış verilerini doğru şekilde normalize etmek için kullanılabileceğini doğrulamaktadır. Daha yüksek hücre sayıları, daha yüksek ölçülen oksijen tüketim hızıyla ve mitokondriyal inhibitörlere karşı daha belirgin yanıtlarla korelasyon göstermektedir. T hücreleri ve splenositlerde daha yüksek ekim yoğunlukları benzer normalize edilmiş oksijen tüketim hızı ölçümleriyle sonuçlanırken, kuyuk başına 5 ve 1,25 × 10⁵ hücreler B hücrelerinde benzer normalize edilmiş oksijen tüketim hızı ölçümleriyle sonuçlanmaktadır.

Mitokondriyal solunum parametreleri ayrıca ekim yoğunlukları ile doğrusal olarak korelasyon göstermektedir. Ek olarak, düşük proton sızıntısı, bazal solunumun büyük bir kısmının ATP sentezi için kullanıldığını göstermektedir. Daha yüksek ekim yoğunlukları, daha yüksek hücre dışı asitlenme hızlarına ve mitokondriyal inhibitörlere karşı daha güçlü yanıtlar verilmesine yol açar.

Glikoliz parametreleri, hücre ekim yoğunlukları ile doğrusal olarak ilişkilidir ve yüksek ekim yoğunluğunun başarılı bir glikoliz stres analizi için en uygun olduğu belirlenmiştir. Glikoz, oligomisin ile inhibe edilen mitokondriyal respirasyonu hafifçe stimüle ederken, 2-DG oksijen tüketimini önemli ölçüde etkilemez. Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde altı ila sekiz saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, hücrelerin hücre dışı akış analizinden önce buz üzerinde tutulmasının, hücrelerin doğru şekilde sayılmasının ve ekilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Hücrelerin metabolik durumuna ilişkin ek soruları yanıtlamak için bu prosedürün ardından, mitokondriyal potansiyelin ve glikoz alımının ölçülmesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, lenfositlerin nasıl izole edileceği ve hücre dışı akış analizinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.