Bir Optimize Protokol Lenfositlerindeki Glikoliz ve Mitokondriyal Solunum Analiz

Bu prosedürün genel amacı, hücre dışı bir akı testi kullanarak lenfositlerde glikoliz ve mitokondriyal solunumu doğru bir şekilde ölçmektir. Bu yöntem, aktivasyon, farklılaşma veya hastalık sırasında bağışıklık hücrelerinde hangi metabolik değişikliklerin meydana geldiği gibi immünometabolizma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bir seferde 90'dan fazla numunenin metabolik profillerinin verimli ve gerçek zamanlı analizine izin vermesidir.

Bu yöntem lenfosit metabolizması hakkında bilgi sağlayabilse de, işlevselliklerinde minimum bozulma ile plaka ilavesi gerektiren yapışık olmayan hücreler de dahil olmak üzere diğer hücrelere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, lenfositler kırılgan olduğundan ve işlevselliklerini ve canlılıklarını korumak için nazik bir kullanım gerektirdiğinden mücadele edeceklerdir. Deneyden bir gün önce, hücre dışı akı analizörünün sensör kartuşunu kaldırın ve yardımcı plakanın her bir kuyusunu 200 mikrolitre kalibant çözeltisi ile doldurun.

Ardından, kartuşu plakaya indirin, sensörleri kalibant solüsyona batırın ve kartuşu gece boyunca karbondioksit veya nitrojen içermeyen 37 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Ertesi sabah, 96 kuyulu bir tahlil plakasının her bir kuyusunu 25 mikrolitre yapışkan çözelti ile kaplayın ve plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, yapıştırıcıyı aspire edin ve her bir kuyuyu 200 mikrolitre steril su ile iki kez yıkayın.

Plaka havayla kururken, 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine 70 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve hasat edilen organları süzgecin üzerine aktarın. Steril üç mililitrelik bir şırıngadan pistonu kullanarak, dokuyu süzgeçten geçirin, filtreyi ve organları maserasyon işlemi boyunca nemli tutun ve gerektiğinde MS tamponu ekleyin. Daha sonra, süzgeci beş ila 10 mililitre MS tamponu ile durulayın, ardından elde edilen hücre süspansiyonunun santrifüjlenmesi ile durulayın.

Peletleri beş mililitre ACK kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Buz üzerinde beş dakika sonra, 10 ila 20 mililitre MS tamponu ile mukavemeti geri kazanın ve hücreleri tekrar santrifüjleyin. Santrifüjlemenin sonunda, 15 mililitrelik konik bir tüp üzerine 30 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve süzgeci bir mililitre MS tamponu ile doldurun.

Hücreleri beş mililitre taze MS tamponunda yeniden süspanse edin ve parçalanmış kırmızı kan hücresi agregatlarını çıkarmak için hücre süspansiyonunu süzgeçten süzün. Boş lizis tüpünü durulamak için dört mililitre taze MS tamponu ekleyin ve yıkamayı süzgeçten geçirin. Hücreleri sayın ve hücre dışı akı tahlili için uygun sayıda splenosit ayırın.

Daha sonra her iki hücre setini de peletleyin, hücre dışı akı tahlili için splenosit örneğini buz üzerinde beş mililitre RF 10 ortamında yeniden askıya alın. İki ila sekiz santigrat derecede belirtilen inkübasyon süreleri için uygun hacimlerde biyotin antikor kokteyli, anti biyotin mikro boncukları ve MS tamponunda boncuk izolasyonu için hücreleri yeniden askıya alın. İkinci inkübasyonun sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peleti bir kez 10 ila sekiz hücre başına 500 mikrolitre taze MS tamponunda yeniden süspanse edin.

Daha sonra uygun sütunu ayırma mıknatısına yükleyin ve sütunu üç mililitre MS tamponu ile doldurun ve akışı atın. Kolonun altına steril 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin ve kolona tüm hücre numune hacmini yükleyin. Daha sonra hücre inkübasyon tüpünü üç mililitre taze MS tamponu ile durulayın ve yıkamayı konik tüpte toplayın.

Son elüte toplandıktan sonra, tüpü 15 mililitre MS tamponunun son hacmine kadar doldurun ve negatif olarak izole edilmiş hücreleri santrifüjleyin. Ardından peleti buz üzerinde beş mililitre taze RF 10 ortamında tekrar askıya alın. İzolasyondan en fazla üç saat sonra tüm hücre örneklerini santrifüjleyin ve peletleri başka bir santrifüjleme için uygun tahlil ortamının beş mililitresinde yeniden askıya alın.

İkinci santrifüjlemeden sonra, taze tahlil ortamında kuyucuk başına 180 mikrolitre hücrelik bir nihai hacim elde etmek için peletleri uygun deneysel konsantrasyonda yeniden askıya alın ve plakanın her bir oyuğuna 180 mikrolitre hücre yerleştirin. Hücreleri 37 santigrat derecede 25 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri kuyucukların dibine güvenli bir şekilde yapıştırmak için plakayı santrifüjleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.

30 dakika sonra, yeni hazırlanmış 37 santigrat derece bileşikleri, hücre dışı akı analizörü sensör kartuşunun uygun enjektör portlarına yüklemek için bir mikro pipet kullanın, herhangi bir kontrol arka planını ve deneysel olmayan portları yalnızca ortamla yükleyin. Yüklenen kartuşu inkübatöre geri koyun ve hücre dışı akı tahlil programını ayarlayın. Ardından kartuşu yükleyin ve istendiği gibi kalibrasyondan sonra kalibant plakasını tahlil plakasıyla değiştirerek programa başlayın.

Hücre dışı akı testinden sonra, protein içeriği ölçümlerine devam edin. Tüm hücre popülasyonlarının %90'ından fazlası, lenfositler için gözlenen %98 ila %99'luk bir saflık ile yaşayabilir. Her hücre tipinin birleşmesi, ilk kaplama yoğunlukları ile ilişkilidir.

Lizat protein konsantrasyonları, kaplama yoğunlukları ile doğrusal olarak ilişkilidir ve protein konsantrasyonlarının hücre dışı akı verilerini doğru bir şekilde normalleştirmek için kullanılabileceğini doğrular. Daha yüksek hücre sayıları, daha yüksek ölçülen oksijen tüketim oranının yanı sıra mitokondriyal inhibitörlere daha dramatik tepkiler ile ilişkilidir. Daha yüksek kaplama yoğunlukları, T hücrelerinde ve splenositlerde benzer normalleştirilmiş oksijen tüketim oranı ölçümlerine neden olurken, oyuk başına beş ila 1.25 kez 10 kez, B hücrelerinde benzer normalleştirilmiş oksijen tüketim oranı ölçümlerine neden olur.

Mitokondriyal solunum parametreleri de kaplama yoğunlukları ile doğrusal olarak ilişkilidir. Ek olarak, düşük proton sızıntısı, temel solunumun çoğunun ATP sentezine doğru kullanıldığını gösterir. Daha yüksek kaplama yoğunlukları, daha yüksek hücre dışı asitlenme oranlarına ve mitokondriyal inhibitörlere daha fazla yanıta neden olur.

Glikoliz parametreleri, hücre kaplama yoğunlukları ile doğrusal olarak ilişkilidir ve yüksek kaplama yoğunluğu, başarılı bir glikoliz stres testi için en uygun olarak belirlenmiştir. Glikoz, oligomisin tarafından inhibe edilen mitokondriyal solunumu hafifçe uyarırken, 2-DG oksijen tüketimini önemli ölçüde etkilemez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa altı ila sekiz saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, hücre dışı akı analizinden önce hücreleri buz üzerinde tutmayı ve hücreleri doğru bir şekilde saymayı ve plakalamayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hücrelerin metabolik durumu ile ilgili ek soruları yanıtlamak için mitokondriyal potansiyelin ve glikoz alımının ölçülmesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, lenfositlerin nasıl izole edileceğini ve hücre dışı akı testinin nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.