Name: Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Öğrenin antikor fragmanlarına SPAAC ile kimyasal prob eklemeyi. Genetik olarak azid içeren amino asit dahil edilerek siteye özgü etiketleme sağlanır. Bu yöntem protein mühendisliği ve kimyasal biyoloji araştırmalarında etkili sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Plazmid Yapı <ol><li> Bir His 6 Etiketleme-hedef antikor geni (pBAD-HerFab-WT) ifade edecek bir ifade plazmid (pBAD-HerFab-L177TAG) Construct ve kehribar kodonu ile lösin-177 için kodonu replace (TAG) 27 kullanılarak konvansiyonel saha-yönlendirilmiş mutagenez tekniği. Malzemelerin Tablo bakın. </li><li> Gelişti tRNA Tyr ve aminoasil-tRNA sentetaz (Aars) çifti için genleri içeren başka bir ifade plazmid (pEVOL-AFRS) Construct. UAAS etkin dahil edilmesi için özel olarak tasarlanmış plazmid vektörü, pEVOL kullanın. Ayrıntılı plazmid bilgi ve klonlama protokolleri önceki raporda açıklanmıştır. 28 </li><li> ticari olarak temin edilebilen bir plazmid hazırlama kiti kullanılarak, yüksek kaliteli plazmid DNA elde. ~ 1.8 260/280 oranı saflaştırılmış DNA için en uygunudur. Gerekirse DNA saflığını kontrol etmek için% 1 agaroz jel elektroforez gerçekleştirin. </li></ol><ol><li> elektroporasyon <ol><li> 20 uL E. coli DH10β suşuna pEVOL-AFRS 28 ve pBAD-HerFab-L177TAG her 1 ul DNA ekleyin. bir pipet kullanılarak, yavaşça karıştırın. plazmidler birlikte ya da bağımsız reaksiyonlarda transforme edilebilir. </li><li> 0.1 cm küvetler için, 25 iF ve 2.5 kV elektroporasyon ayarlarını. </li><li> şok odasının slayt içine küvet yerleştirin. Küvet odası elektrotlar ile sıkı temas edene kadar odasına slayt itin. </li><li> elektroporasyon makinesi bip sesi gelene kadar darbe düğmesine basarak bir kez Pulse. </li><li> Katabolik baskı (SOC) ortamı maya ekstresi, 10 mM NaCI, 2.5 mM KCI (ağ / hac) trıpton,% 0.5 (w / v), 10 mM MgCI2,% 2 ihtiva eden 1 mL Süper uygun suyu, ve 20 mM glukoz ekleme hızlı küvete ve bir test tüpüne karışımı aktarın. çalkalanarak 37 ° C&#39;de 1 saat süreyle inkübe hücreleri.</li><li> (PEVOL-AFRS sırasıyla pBAD-HerFab-L177TAG, seçilmesi için 35 ug / ml kloramfenikol ve 100 ug / ml ampisilin) uygun antibiyotikleri içeren agar plakaları lizojeni etsuyu (LB) üzerine yayıldı transforme E. coli hücreleri. 12 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Kültür hazırlama <ol><li> 5 ml LB ortamı içeren antibiyotiklere tek bir dönüştürülmüş koloni inoküle. çalkalanarak 37 ° C&#39;de 12 saat boyunca inkübe edilir. </li></ol></li></ol> 3. Ekspresyon ve HerFab-L177AF saflaştırılması <ol><li> HerFab-L177AF sentezlenmesi <ol><li> 200 ml LB ortamı ihtiva ampisilin içine primer kültürünün (5 mi) transfer (100 ug / ml) ve AF (1 mM), çalkalanarak 37 ° C&#39;de kuluçkalandı. Not: 100 mm AF stok çözeltisi (10 mL), 100 mM hidroklorik asit (10 mL, nihai hacim) 206 mg AF çözülmesiyle hazırlanmıştır. </li><li> (16 1.6 M arabinoz 2 mL ekleyinKültür log-faz (OD 550 = 0.8 OD = optik yoğunluk) ulaşır mM son konsantrasyon). çalkalama ile 30 ° C&#39;de 12 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 11.000 x g&#39;de santrifüjleme ile hasat hücreleri. Süpernatantı atın ve -20 ° C&#39;de pelet dondurmak. </li></ol></li><li> Hücre liziz <ol><li> 30 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA,% 20 sakroz ve 0.2 mg / ml lisozim içeren 20 mi periplazmik liziz tamponunda yeniden süspanse hücre pelletleri, 37 ° C&#39;de 1 saat süreyle inkübe karışımı. </li><li> 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 18.000 x g&#39;de hücre lizat santrifüjleyin. yeni bir tüp süpernatant aktarın ve pelet atın. </li></ol></li><li> Ni-NTA afinite kromatografisi <ol><li> Her bir santrifüj tüpüne (200 ml kültür, 400 uL reçine) Ni-NTA reçine süspansiyonu ekleyin ve 1 saat boyunca 4 ° C&#39;de nazik bir şekilde karıştırılır. </li><li> polipropilen sütuna süspansiyon dökün ve 5 ml yıkama met ile reçineyi üç defa yıkamakffer 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0), 20 mM imidazol, 300 mM NaCl içeren. </li><li> 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0), 250 mM imidazol, 300 mM NaCI ihtiva eden 300 uL yıkama tamponu ile hedef antikor yıkayın. </li><li> Bradford protein deneyi 29 ya da 280 nm&#39;de absorbans ölçülerek mutan protein konsantrasyonunu belirleyin. Sönüm katsayısı (2,471 M -1 cm -1) AF kullanarak protein söndürme katsayısı hesap makinesi tarafından 280 nm&#39;de HerFab-L177AF için sönüm katsayısı (75866 M -1 cm -1) hesaplayın. Not: HerFab amino asit sekans, NCBI web sitesinde bulunabilir (Gl: 783282791 ve GI: 783.282.792) olabilir. </li></ol></li></ol> Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma kullanma Alkin Sondalar ile Saf HerFab-L177AF 4. Konjugasyon (SPAAC) <ol><li> (H 2 O 200 Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) 20 mcL ekleyin81; 10 mM Na-2 HPO 4 (pH 7.0) ve 100 mM NaCl ihtiva eden fosfat tamponu içinde HerFab-L177AF 10 uL (10 uM son konsantrasyon) solüsyonuna M nihai konsantrasyon). NOT: alternatifler, diflorine sikloostin (Difo) ve bisiklo gibi [6.1.0] nonyne (BCN) türevleri ayrıca aynı uygulama için kullanılabilir. </li><li> suşa teşvik siklo-ilave reaksiyonu, 37 ° C&#39;de 6 saat devam etmesine izin verir. Işığa duyarlı bir prob (örneğin, Cy5.5) kullanılırsa, alüminyum folyo ile reaksiyon bölmesi kapağı. </li><li> Adım 5&#39;e göre etiketlenmiş HerFab arındırın. </li></ol> Etiketli HerFab 5. saflaştırılması <ol><li> Bir santrifüj filtre döndürme kolonuna numune 500 ul ekle. </li><li> 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 14,000 x g&#39;de spin kolon santrifüjleyin. </li><li> Sil akış ve transfer 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne spin kolon numuneyi saflaştırılmıştır. </li><li> Alternatif bir 5,1- 5.3 adım olarak, arıtma için yerineaynı tampona karşı diyaliz ile tion. </li><li> 4 ° C&#39;de arıtılmış, etiketli HerFab saklayın. </li></ol> Etiketli HerFab 6. SDS-PAGE analizi <ol><li> 106 mM Tris-HCI, 141 mM Tris bazı (pH 8.5),% 2 LDS,% 10 gliserol, 0.51 mM EDTA, 0.22 mM SERVA Mavi G250 ve 13 uL kırmızı 0.175 mM fenol ihtiva eden 5 uL LDS proteini örnek tamponu ekleme varlığı (+) veya yokluğunda HerFab (7.8 uM veya 0.38 mg / ml) olarak tanımlanan saflaştırılmış (-) 2 uL ditiotreitol (DTT, 100 mM nihai konsantrasyon). 10 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe karışımı. </li><li> Elektroforez hücreye% 4-12 Bis-Tris, SDS-PAGE jeli kaseti takın ve çalışan tampon ekleyin. birleşik protein örnekleri ve Önceden boyanmış molekül ağırlığı işaretleyici yükleyin. 200 V 35 dakika boyunca jel elektroforezi gerçekleştirin Not: fluorofor fotoğraf beyazlatma en aza indirmek için tüm dönem boyunca karanlıkta elektroforez hücresi tutun. </li><li> Elektroforezisten sonra, aktarmaBir floresan jel tarayıcıya jel ve uygun dalga boyunda floresan emisyonu için tarayın. Cy5.5 için tarayıcı yazılımı Cy5 modunu kullanın. </li><li> ticari bir protein boyası ile jel Leke. </li></ol>

<ol><li>Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).</li>
<li>Wu, X., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+at+the+interface+of+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis at the interface of chemistry and biology.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).</li>
<li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).</li>
<li>Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+the+keto+functional+groupto+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli.</a> proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).</li>
<li>Chin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+p-azido-L-phenylalanine+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli.</a> J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).</li>
<li>Deiters, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+incorporation+of+an+alkyne+into+proteins+in+Esshcerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).</li>
<li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+transcyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).</li>
<li>Lee, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+acrylamide+fuctionality%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded acrylamide fuctionality.</a> ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+norbornene+directs+site-specific+cellular+protein+labelling+via+a+rapid+bioorthogonal+raction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction.</a> Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).</li>
<li>Lang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+encoding+of+bicyclononynes+and+trans-cyclooctenes+for+site-specific+protein+labeling+in+vitro+and+in+live+mammalian+cells+via+rapid+fluorogenic+Diels-Alder+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).</li>
<li>Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Cu-free+click+chemistry+with+readily+synthesized+biarylazacyclooctynones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azadibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+%283+%2B+2%29+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition.</a> Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+mechanism+to+mouse%3A+a+tale+of+two+bioorthogonal+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).</li>
<li>Debets, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+with+strained+alkenes+and+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation with strained alkenes and alkynes.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).</li>
<li>Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-promoted+alkyne%E2%88%92azide+cycloadditions+%28SPAAC%29+reveal+new+features+of+glycoconjugate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis.</a> ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).</li>
<li>Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+functionalization+using+catalyst-free+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition.</a> Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).</li>
<li>Yao, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore+targeting+to+cellular+proteins+via+enzymemediated+azide+ligation+and+strain-promoted+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).</li>
<li>Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+bioorthogonal+functionalities+into+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells.</a> Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).</li>
<li>Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residue+choice+defines+efficiency+and+influence+of+bioorthogonal+protein+modification+via+genetically+encoded+strain+promoted+Click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry.</a> Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).</li>
<li>Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-drug+conjugates%3A+an+emerging+concept+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).</li>
<li>Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staudinger+modification+of+proteins+containing+p-Azidophenylalanine%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine.</a> ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).</li>
<li>Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+and+efficient+method+for+the+site-specific+dual-labeling+of+proteins+for+single+molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+strategies+for+single-molecule+protein+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Click strategies for single-molecule protein fluorescence.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).</li>
<li>Jang, S., Sachin, K., Lee, hJ., Kim, D. W., Lee, hS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+method+for+protein+conjugation+by+copper-free+click+reaction+and+its+application+to+antibody-free+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis.</a> Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).</li>
<li>Kazane, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+antibody+multimers+through+peptide+nucleic+acid+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).</li>
<li>Ko, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+site-specific+antibody+labeling+by+strain-promoted+azide-alkyne+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cho, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+extracellular+region+of+HER2+alone+and+in+complex+with+the+Herceptin+Fab%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab.</a> Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+%3A+Diverse+chemical+function+from+a+few+good+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

proteinlerin içine Doğal olmayan amino asitlerin genetik dahil protein modifikasyonu için kullanılan diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Önemli avantajlar 1-3 bir proteinin her türlü genel uygulanabilmesidir. Prensip olarak, bir hedef proteini ve protein, bir hedef sitesi seçiminde herhangi bir sınırlama yoktur. Bununla birlikte, UAA ile yapısal ve fonksiyonel olarak önemli kalıntısının yerine, hedef proteinin yapısını ve fonksiyonunu değiştirerek neden olabilir. Genel olarak, çözücü maruz kalan ve...

Escherichia coli içinde bir p -methoxyphenylalanine genetik dahil belirtildikten sonra, 1 100&#39;den doğal olmayan amino asitler (UAA&#39;lar) başarılı bir şekilde çeşitli proteinlerin dahil edilmiştir. Bu UAAS arasında 1-3, bioorthogonal fonksiyonel grupları içeren amino asitler yoğun çalışılan ve büyük oranını temsil edilmiştir. UAAS kullanılan bioorthogonal fonksiyonel gruplar, keton, 4 azit 5 alkin, 6 sikloostin, 7 tetrazin, 8 α, β-doymamış bir amid, 9 norbonen, 10 transcyclooctene, 11 ve bisiklo [6.1.0] -nonyne bulunmaktadır. Her fonksiyonel grubun avantajları ve dezavantajları vardır 11 da, azid ihtiva eden amino asitler en yaygın protein konjugasyon için kullanılmıştır. p -Azidophenylalanine (AF), azido-içeren amino asitler bir, hali hazırda mevcuttur, ve dahil efficiency mükemmel. Bu amino asidi içeren mutant proteinler bakır katalitik siklo veya SPAAC göre cyclooctynes ​​sahip alkinler ile reaksiyona sokulabilir. 12-20 Son zamanlarda, biopharmaceuticals ilaç endüstrisinde büyük ilgi çekmiştir. Antikor-ilaç konjugatı (ADC) bağlı insan kanserlerinin 21 ve tedavisi için hedeflenen bir tedavi için kabiliyetleri de avantajlı terapötik bir antikor sınıfı diğer hastalıklar. 50&#39;den fazla ADC klinik çalışmalarda şu anda, ve sayısı hızla artmaktadır. ADC&#39;ler geliştirilmesinde birçok faktör etkinliğini en üst düzeye çıkarmak ve yan etkileri en aza indirmek için dikkate alınması gerekir. Bu faktörler arasında, etkin ve yere-özgü konjugasyonu reaksiyonu, bir antikor arasında bir kovalent bağ oluşturmak üzere bir ilacın önemlidir. Konjugasyon reaksiyonu istenen etkinlik ve spesifikliği, bir bir bioorthogonal fonksiyonel grup ile konjugasyon ile elde edilebilirözellikle, bir antikor içine dahil edilir, doğal olmayan bir amino asit. Burada 22-26, biz bir protokol rapor sitenin spesifik dahil bir antikor fragmanına AF biyokimyasal prob mutant antikor fragmanı konjuge.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Plazmid Yapısı</güçlü</td></tr><tr><td>>plazmit pBAD_HerFab_L177TAG</td><td></td><td></td><td>İsteğe bağlı olarak kehribar durdurma kodonunu (TAG) istenen bir konumda içerir. Ko, W. et al. Suşu Teşvik Eden Azide-Alkin Siklo Eklemesi ile Verimli ve Bölgeye Özgü Antikor Etiketlemesi. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>plazmid pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T.S., Ahmad, I., Yin, J.A. ve Schultz, P.G. E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression Host Plasmid</td></tr><tr><td>Mini-prep kit</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pack</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron biyoteknoloji</td><td>32034</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Et Suyu</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp; G</td></tr><tr><TD Colspan="4"><Güçlü>2. Kültür Hazırlama</td></tr><tr><td colspan="4">2.1 Elektroporasyon</td></tr><tr><td>Micro pulser</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Mikro pulser küvet</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp; cm elektrot boşluğu, pkg. 50</td></tr><tr><td>Ampisilin Sodyum</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC orta</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3. HerFab-L177AF<</td></tr><tr>td colspan="4">3.1 Herfab-L177AF'nin İfadesi</td></tr><tr><td>p-azido-L-fenilalanin (AF)Bachem</td><td></td> <td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L (+) - Arabinoz,% 99</td> <td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit, 35 ~ 37%</td> <td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr> <tr>< td colspan = "4"><güçlü>3.2 Hücre Lizisi< / güçlü ></td></tr> <tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan,% 99</td> <td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu dihidrat,% 99.5</td> <td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lizozim</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>3.3 Ni-NTA Afinite Kromatografisi</güçlü></td></tr><tr><td>Ni-NTA reçinesi</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Polipropilen kolon</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/paket, 1 mL kapasiteli</td></tr><tr><td>İmidazol, %99SAMCHUN</td><td></td> <td>I0578</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik, %98SAMCHUN</td><td></td> <td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür, %99SAMCHUN</td><td></td> <td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td colspan="4"><Güçlü>4. Saflaştırılmış HerFab-L177AF'nin Suş Destekli Azide-alkin Siklo Eklemesi (SPAAC) Kullanılarak Alkin Probları ile Konjugasyonu</td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>5. Etiketli HerFab</strong</td></tr><tr><td>>Amicon Ultra 0.5 mL Santrifüj Filtrelerin Saflaştırılması</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/paket, 500 & # 956; L kapasite</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>6. Etiketli HerFab ve Floresan Jel Taramasının SDS-PAGE Analizi</td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, %99,5</td> <td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Numune Tamponu, 4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES çalışma tamponu</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex %4-12 SDS PAGE jelleri</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12 kuyulu</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 değişken modlu görüntüleyici</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verimli ve siteye özgü gerilme-terfi azid-alkin siklokatılma tarafından antikor etiketleme

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

kendi yapısını ve fonksiyonunu incelemek için proteinlere kimyasal sondaları tanıtmak için mevcut şu anda birçok kimyasal araç vardır. Faydalı bir yöntem, genetik olarak bioorthogonal fonksiyonel grubu ihtiva eden bir doğal olmayan amino asidin sokulması protein konjugasyon olup. Bu rapor, site-spesifik bir antikor konjugasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklamaktadır. protokol bir azid içeren amino asitin genetik dahil, ve zorlanma-terfi azid-alkin siklo (SPAAC) tarafından konjugasyon reaksiyonu için deneysel ayrıntıları içerir. Bu soy-destekli Reaksiyon fizyolojik pH ve sıcaklıkta reaksiyona moleküllerin basit karıştırma ile ilerler ve bakır (I) &#39;iyonları ve bakır kenetleme ligandlar olarak ilave reaktifler gerektirmez. Bu nedenle, bu yöntem, genel protein konjugasyon ve antikor ilaç konjugatları (ADC) geliştirilmesi için yararlı olabilecektir.

Bu çalışmada, bir antikor parçası örneğin bir bölgeye özel fragmanına bir azid ihtiva eden amino asit içeren ve gergin sikloostin mutant antikor fragmanının reaksiyona sokulmasıyla bir florofor ile konjuge (Şekil 1). HerFab AF bir azid ihtiva eden amino asit dahil edildiği içine hedef antikor fragmanı olarak seçilmiştir. AF değiştirilmesi için HerFab kalıntı seçmek için HerFab X-ışını kristal yapısı analiz edilmiştir. Kalıntının 30 önemli şartlar etkin konjuga...

Burada, genetik olarak azid içeren bir amino asidi dahil ederek ve ardından azidi, suş destekli azid-alkin siklo ilavesi (SPAAC) ile kimyasal bir prob ile birleştirerek bir antikor fragmanına kimyasal probları bölgeye spesifik olarak sokmak için bir protokol sunuyoruz.

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak azid içeren bir amino asit dahil ederek bir antikor fragmanına kimyasal probları bölgeye spesifik olarak sokmaktır. Bu yöntem, protein modifikasyonu, mühendislik ve konjugasyon gibi kimyasal biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hedef probunuzun veya et suyunuzun, basit bir karıştırma yoluyla proteinlere veya antikorlara bölgeye özel olarak sokulabilmesidir.Plazmitleri oluşturduktan sonra, 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne mikrolitre başına sekiz hücreye iki kez 10 ila sekiz hücre konsantrasyonunda 20 mikrolitre E.Coli suşu DH10-beta'ya bir mikrolitre ekleyin. Çözeltiyi nazikçe karıştırmak için bir pipet kullanın. Ardından 20 mikrolitre karışık çözeltiyi temiz bir küvete koyun.Elektroporasyon makinesini 25 mikrofarad ve 2,5 kilovolta ayarlayın. Ardından küveti şok haznesinin sürgüsüne yerleştirin. Küvet hazne elektrotları ile sıkı bir temas kurana kadar sürgüyü haznenin içine itin.Elektroporasyon makinesi bip sesi çıkarana kadar darbe düğmesine bir kez basın. Bundan sonra, küvete hızlı bir şekilde bir mililitre SOC ortamı ekleyin. Daha sonra karışımı bir test tüpüne aktarın.Bir s

efficient-site-specific-antibody-labeling-strain-promoted-azide

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için...

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

Biz GPCRs çeşitli hedef konumlarda doğal olmayan amino asit, p-azido-L-fenil alanin-kodlayan ve genetik olarak farklı uygulamalarda Azido grubunun çok yönlülüğünü gösterir. Bunlar, bir GPCR olan ligand bağlama cebinde tortuları tanımlamak için hedef foto-çapraz teknolojisi ve bir peptid epitop ya da flüoresan probu ile GPCRs alana özgü bioorthogonal modifikasyonunu içerir.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

DNA ve proteinler dizi-spesifik afinite ya da DNA ya da protein Methyltransferases sentetik kofaktör analogları kullanılarak flüoresan raportör grup ile etiketlenir. Enzimler, aziridin veya çift aktif kofaktör benzerlerinin kofaktör özelliğine göre bir veya iki adım etiketleme için kullanılmaktadır.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

Fotostabil siyanin boyaları, enerji transferi ile hibridizasyonun izlenmesi için oligonükleotidlere bağlanır.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

125-etiketli azid sentezi ve bir bakır içermeyen tıklama reaksiyonu kullanılarak dibenzocyclooctyne (DBCO) -grubu ile konjüge edilmiş 13-mil ölçekli altın nanopartiküllerinin radyo-etiketlenmesi için ayrıntılı bir işlem tarif edilmektedir.

Bir Kullanarak Altın Nanopartiküller Verimli Radyoaktif bir Optimize Protokolü<sup&gt; 125</sup&gt; I-etiketli Azid Protez Grubu

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Lizin cyclopropene türevi antikorlar birleşmeyle antikor-uyuşturucu conjugates oluşturmak için tetrazine taşıyan moleküller siteye özgü, hızlı ve verimli bağlantı sağlar.

Genetik bir kanonik olmayan Amino asit antikor-uyuşturucu üretimi için kodlama Conjugates bir hızlı Bioorthogonal tepki

Bu protokol için biz BAKLA, bir phenyoxadiazolyl metil sulfone tabanlı reaktif yükler site seçici bağlantı için biomolecules, özellikle antikorlar thiols sentezi anlatacağız. Buna ek olarak, biz malzemelerin ve BAKLA taşıyan bifonksiyonel şelatör ve onun konjugasyon bir modeli antikor için anlatacağız.

Sentez ve Site seçici olarak oluşturulması için Thiol reaktif reaktif Bioconjugation Immunoconjugates modifiye

Floresan etiketli antibiyotikler antimikrobiyal direnç birden fazla yönünü incelemek için kullanılabilecek güçlü araçlardır. Bu makalede floresan etiketli antibiyotiklerin hazırlanması ve bakterilerde antibiyotik direnci eğitimi için uygulama açıklanmaktadır. Problar spektrofotometri, akış sitometrisi ve mikroskopi ile bakteriyel direnç (örn. efflux) mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir.

Floresan Antibiyotik Probları Kullanılarak Bakteriyel Direncin Görüntülenmesi

Öğrenin antikor fragmanlarına SPAAC ile kimyasal prob eklemeyi. Genetik olarak azid içeren amino asit dahil edilerek siteye özgü etiketleme sağlanır. Bu yöntem protein mühendisliği ve kimyasal biyoloji araştırmalarında etkili sonuçlar sunar.

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

Daha fazla video keşfet