Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak azid içeren bir amino asit dahil ederek bir antikor fragmanına kimyasal probları bölgeye spesifik olarak sokmaktır. Bu yöntem, protein modifikasyonu, mühendislik ve konjugasyon gibi kimyasal biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, hedef probunuzun veya et suyunuzun, basit bir karıştırma yoluyla proteinlere veya antikorlara bölgeye özel olarak sokulabilmesidir.

Plazmitleri oluşturduktan sonra, 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne mikrolitre başına sekiz hücreye iki kez 10 ila sekiz hücre konsantrasyonunda 20 mikrolitre E.Coli suşu DH10-beta'ya bir mikrolitre ekleyin. Çözeltiyi nazikçe karıştırmak için bir pipet kullanın. Ardından 20 mikrolitre karışık çözeltiyi temiz bir küvete koyun.

Elektroporasyon makinesini 25 mikrofarad ve 2,5 kilovolta ayarlayın. Ardından küveti şok haznesinin sürgüsüne yerleştirin. Küvet hazne elektrotları ile sıkı bir temas kurana kadar sürgüyü haznenin içine itin.

Elektroporasyon makinesi bip sesi çıkarana kadar darbe düğmesine bir kez basın. Bundan sonra, küvete hızlı bir şekilde bir mililitre SOC ortamı ekleyin. Daha sonra karışımı bir test tüpüne aktarın.

Bir saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, dönüştürülmüş E.Coli hücrelerini uygun antibiyotikler içeren lizojeni et suyu agar plakalarına yayın. Plakaları 12 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Plaka inkübasyonu tamamlandıktan sonra, tek bir dönüştürülmüş koloniyi antibiyotik içeren beş mililitre LB ortamında aşılayın. 37 santigrat derecede 12 saat çalkalayarak inkübe edin. Daha sonra birincil kültürü, mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ve bir milimolar AF ile 200 mililitre LB ortamına aktarın. En az üç saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin.

Kültür 550 nanometrede 0.8 optik yoğunluğa ulaştığında iki mililitre 1.6 molar arabinoz ekleyin. Daha sonra 12 saat boyunca 30 santigrat derecede çalkalanarak inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, hücreleri beş dakika boyunca 11.000 kez g'de santrifüjleme ile hasat edin.

Süpernatanı atın ve peleti eksi 20 santigrat derecede dondurun. Hücreleri parçalamaya hazır olduğunda, peleti taze bir santrifüj tüpünde 20 mililitre paraplazmik lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Karışımı 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin.

Daha sonra, hücre lizatını dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 18.000 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve peleti atın. Ardından 400 mikrolitre Ni-NTA reçine süspansiyonu ekleyin.

Bir döndürücü kullanarak, tüpü dört santigrat derecede bir saat boyunca hafifçe çalkalayın. Karıştırma tamamlandıktan sonra, süspansiyonu bir polipropilen kolona dökün. Reçineyi beş mililitre yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.

Hedef antikoru 300 mikrolitre elüsyon tamponu ile güçlendirin. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi mutant proteinin konsantrasyonunu belirleyin. Yeni bir santrifüj tüpüne 10 milimolar sodyum fosfat dibazik ve 100 milimolar sodyum klorür içeren fosfat tamponunda 10 mikromolar HerFab-L177AF çözeltisinden 10 mikrolitre ekleyerek başlayın.

Daha sonra suya 200 mikromolar Cy 5.5 azadibenzosiklooktin çözeltisinden 20 mikrolitre ekleyin. Bundan sonra, reaksiyon kabını alüminyum folyo ile örtün. Leke destekli siklo-baskı reaksiyonunun 37 santigrat derecede altı saat devam etmesine izin verin.

Reaksiyon tamamlandıktan sonra, bir santrifüj filtre döndürme kolonunda serbest Cy 5.5 boyasını yıkamak için 30 mikrolitre numune ve 450 mikrolitre fosfat tamponu ekleyin. Sıkma kolonunu dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 14.000 kez g'de santrifüjleyin. Akışı atın ve ardından saflaştırılmış numuneyi 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Saflaştırılmış etiketli HerFab'ı analiz için hazır olmadıkça dört santigrat derecede saklayın. Yeni bir tüpe 13 mikrolitre 7.8 mikromolar saflaştırılmış HerFab ekleyerek başlayın. Ardından beş mikrolitre LDS protein numune tamponu ekleyin.

Karışımı 95 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, dört ila %12 Bis-Tris SDS-PAGE jel kasetini elektroforez hücresine takın. Çalışan arabellek ekleyin.

Ardından, konjuge protein örneklerini önceden boyanmış moleküler ağırlık yapıcıya yükleyin. 200 voltta 35 dakika boyunca jel elektroforezi gerçekleştirin. Elektroforez tamamlandıktan sonra, jeli bir jel dokümantasyon ve analiz sistemine aktarın.

Cy 5.5'i tarayın ve ardından jeli ticari bir protein boyası ile boyayın. Bu çalışmada, Her-Fab antikor fragmanı, bölgeye özgü bir Bu, fragmana azid içeren bir amino asidin dahil edilmesi ve daha sonra mutant antikor fragmanının gerilmiş bir siklooktin ile reaksiyona sokulmasıyla gerçekleştirilir. SDS-PAGE analizi, azid içeren amino asit ile ve azid içeren amino asit olmadan eksprese edilen mutant proteinler için gerçekleştirilir.

Görülebileceği gibi, tam uzunlukta antikor fragmanı sadece amino asit varlığında elde edildi. Amino asidi içeren antikor, bir Cy 5.5'e bağlı azadibenzosiklooktilin türevi Cy 5.5 ile reaksiyon yoluyla konjugasyon için değerlendirilir ve SDS-PAGE ile analiz edilir. Floresan görüntüleri, mutant antikor fragmanının Cy 5.5 ile konjugasyonunu gösterirken, kontrolde konjugasyon gözlenmedi.

Proteininizi asetilfenilalanin ile düzgün bir şekilde ifade ettikten ve saflaştırdıktan sonra, protein, suşlu bir prob ile verimli bir şekilde etiketlenebilir. Etiketleme reaksiyonu ek bir reaktif gerektirmediğinden, probu proteininizle karıştırarak probu hedef proteininize sokabilirsiniz. Bu videoyu izledikten sonra, genetik olarak azid içeren bir amino asidi dahil ederek bir antikor parçasına kimyasal probunun bölgeye spesifik olarak nasıl sokulacağını iyi anlamış olmalısınız.